全 文 ：※工艺技术 食品科学 2012, Vol.33, No.24 117
黑莓花色苷的超声波提取与抗氧化性活性研究
陈 钢1， 黄立山1， 徐 静2 ，简素平3，汪海利3
(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；
2.国家知识产权局专利审查协作北京中心，北京 100080；3.江西南科食品有限公司，江西 南昌 330029)
摘 要：为确定黑莓花色苷超声波提取的最佳工艺条件，以花色苷得率为考察指标，利用超声波处理，通过单因
素和正交试验优化最佳提取工艺条件，并对黑莓花色苷的抗氧化活性进行初步研究。结果表明：黑莓花色苷的最
佳提取工艺条件为：超声时间35min、75%乙醇作溶剂、料液比1:20(g/mL)、黑莓花色苷的得率为0.365mg/g。在相
同质量浓度条件下，黑莓花色苷溶液还原力明显高于VC溶液，并具有较强抑制Cu2+诱导的低密度脂蛋白氧化修饰
作用。
关键词：黑莓；花色苷；超声波提取；抗氧化性
Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Antho Cyanins from Blackberry Fruits
CHEN Gang1，HUANG Li-shan1，XU Jing2，JIAN Su-ping3，WANG Hai-li3
(1. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047，China；
2. Patent Examination Cooperation Center of the Patent Offi ce, State Intellectual Property Offi ce, Beijing 100080，China；
3. Jiangxi Nanke Food Co. Ltd., Nanchang 330029, China)
Abstract：An orthogonal array design was used to determine optimum conditions for the ultrasonic-assisted extraction of
anthocyanins from blackberry fruits, and the antioxidant activity of crude anthocyanin extract was investigated. We established
the optimum conditions for the extraction of anthocyanins from blackberry fruits as follows: 75% ethanol as an extraction
solvent at a solid-to-solvent of 1:20 (g/mL) and 35 min of ultrasonic treatment time. The extraction yield of anthocyanins under
these conditions was 0.365 mg/g. The reducing power of the extract obtained was signifi cantly higher than that of vitamin C at
the same concentration. In addition, the extract had a potent inhibitory effect on Cu2+-induced oxidative LDL modifi cation.
Key words：blackberry fruit；anthocyanin；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2012)24-0117-05
收稿日期：2012-06-04
基金项目：南昌大学食品科学与技术国家重点实验室青年骨干研究基金项目(SKLF-QN-201114)
作者简介：陈钢(1968—)，男，副教授，博士，研究方向为食品生物技术与功能食品开发。E-mail：zn_chengang@163.com
黑莓[Rubus(sp.)L.]是蔷薇科悬钩子属植物，原产北
美，是当今风靡欧美的第3代小果类果树的重要成员[1]。
其果实营养丰富，除了含有丰富的糖类、有机酸、维生
素、多种氨基酸和微量元素以外[2]，还富含黄酮[3]、花色
苷[4]、VC [5]等抗氧化功能成分。据现代研究报道：黑莓中
提取的花色苷类物质还具有很强的清除自由基[6]、抗氧化[7]、
抗癌[8]、抗突变[9]等作用。目前已有报道从黑莓果实中分
离出矢车菊-3-葡萄糖苷和矢车菊-3-芸香糖苷[10]，但对其
功能性机理方面的研究相对较少，也未见有突出的研究成
果。因此本实验以新鲜黑莓果实为原料，利用超声波提取
花色苷成分，确定最佳工艺参数，并对其还原能力、抑制
Cu2+诱导的低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)氧
化修饰作用进行初步研究，以发掘新的花色苷类物质资
源，为天然抗氧化剂的开发提供依据，同时为黑莓资源的
综合利用和深入研究提供一定的依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
黑莓 河南省新乡市天源饮料食品厂提供；
蛋氨酸、核黄素、氮蓝四唑 (NBT)、邻二氮菲 ( l ,10-
phenanthroline) 美国Sigma化学公司；LDL由中国协和
医科大学生化教研室提供；Na2HPO4、NaH2PO4、CuSO4
等均为北京化学试剂厂分析纯。
1.2 仪器与设备
Ci t r a 6紫外 -可见分光光度计 澳大利亚GBC
Scientifi c Equipment Pty有限责任公司；TDL-5A台式离心
机 上海安亭科学仪器厂；RE-52型旋转蒸发仪 上海
亚荣生化仪器厂；HHSY21电热恒温水浴锅 北京市长
风仪器仪表公司；超声波发生器(超声波频率40kHz，功
率200W) 济宁金百特电子有限责任公司。
118 2012, Vol.33, No.24 食品科学 ※工艺技术
1.3 方法
1.3.1 花色苷含量的测定
利用花色苷及黄酮的结构特性，当pH1.0时，510nm
处二者均有最大吸收峰；而当pH值为4.5时，花色苷转变
为无色查尔酮形式，在510nm处无吸收，用示差法计算
溶液中总花色苷含量[11-13]：用移液管吸取2mL样品液，
分别用pH1.0[0.2mol/L KCl:0.2mol/L HCl=25:67，V/V]和
pH4.5[0.2mol/L NaAc·3H2O:0.2moL/L HAc=1:1，V/V]的缓
冲液稀释至20mL，混匀，以2mL溶剂加18mL相应缓冲液
作空白，分别在510nm和700nm波长处测定吸光度。总花
色苷ACY的含量(以矢车菊色素-3-葡萄糖苷计)按下式计
算：
A=(A510－A700)pHl.0－(A510－A700)pH4.5 (1)
ACY৿䞣/(mg/g) = A×449.2×V26900×10×m ×100
式中：A为吸光度；V为提取液的总体积/mL；m为取样
量/g；26900为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数；
449.2为矢车菊色素-3-葡萄糖苷的摩尔质量。
1.3.2 黑莓果实多酚的提取及测定
称取一定量黑莓冻果，微波解冻去籽后打浆，在超
声发生器功率200W、占空比1:2的提取条件下，以花色苷
得率为考察指标，对提取时间、提取温度、料液比为试
验因素进行单因素和正交试验。将提取液经离心、浓缩
后按公式(1)计算出花色苷得率。
1.3.3 黑莓果实多酚的体外抗氧化性能
按1.3.2节中确定的最佳工艺制备黑莓花色苷提取
液，测定花色苷含量，在冰箱中保存备用。
根据预实验的结果，将黑莓花色苷提取液依次配成
质量浓度为1、2、3、4、5mg/mL的样品溶液进行试验。
每个样品平行测6次，取峰值平均值进行定量。
1.3.3.1 对羟自由基清除率的测定[15]
检测•OH的方法和体系有很多，离体检测羟自由基
有电子自旋共振法、化学发光法、细胞色素C氧化法等，
而其中最经典最常用的是Fenton反应体系。即在10mL
的具塞比色管中依次加1.865mmol/L邻二氮菲l.0mL、
0.2mol/L PBS(pH7.40)2.0mL和l.0mL蒸馏水，充分混匀
后，加入1.865mmol/L硫酸亚铁溶液l.0mL，混匀后，加
入0.025%双氧水(H2O2) l.0mL，总体积6.0mL，于37℃水
浴60min，在536nm处测其吸光度，所测得的数据为损伤
管的吸光度A损。
×100D/%=
A样ˉA损
A未ˉA损
(2)
式中：D为清除率/%；A样为5.0mL FeSO4-H2O2-邻
二氮菲-磷酸盐缓冲液+1.0mL样品溶液的吸光度；A未为
5.0mL FeSO4-H2O2-邻二氮菲-磷酸盐缓冲液+1.0mL蒸馏水
的吸光度；A损为5.0mL FeSO4-H2O2-邻二氮菲-磷酸盐缓
冲液+1.0mL双氧水溶液的吸光度。
1.3.3.2 对超氧阴离子自由基清除率的测定[16]
按顺序分别取蛋氨酸(0.1mol/L)、NBT(1×10-3mol/L)、
核黄素(3×10-5mol/L)各0.5mL，加入容量瓶中，然后
加入0.5mL样品，用PBS定容至5mL，即最后使蛋氨酸
(0.01mol/L)，NBT(1×10-4mol/L)，核黄素(3×10-6mol/L)
达到各自相应的浓度，反应在装有20W节能灯、四周衬
有铝箔的盒子中进行，调节反应物离灯的距离，使受光
强度均匀，反应30min，于560nm波长处测吸光度。
A0A
A ×100⏙䰸⥛/% = (3)
式中：A0 为空白样的吸光度；A为样品的吸光度。
1.3.3.3 抑制Cu2+诱导LDL氧化修饰能力的测定
将LDL用PBS稀释成250μg/mL。取200μL稀释后的
LDL，并加入200μL一定浓度的样品溶液，再加入1400μL
的PBS，放入37℃的水浴中预热10min。随后加入200μL
的硫酸铜溶液，引发氧化反应。其中，空白以PBS代替
样品溶液和硫酸铜溶液，模型以PBS代替样品溶液。即
在最终2mL的反应体系中，LDL质量浓度为25μg/mL，
Cu2+浓度为2.5μmol/L。反应引发后开始计时，每隔15min
于234nm波长处测定一次吸光度，连续测定600min，将
测得的各点OD值连成平滑曲线。
本实验采取延滞时间作为指标评价样品对LDL氧化
易感性的影响。延滞时间定义为氧化曲线的最大斜率与
平行于X轴的初始吸光度轴的截距所得的时间。
2 结果与分析
2.1 黑莓花色苷提取工艺参数的确定
2.1.1 乙醇体积分数对黑莓花色苷得率的影响
称取20g解冻后的黑莓，按料液比1:15分别用体积分
数45%、55%、65%、75%、85%的乙醇溶液以固定频率
超声波提取，提取时间为25min，结果如图1所示。
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
45 55 65 75 85
Э䝛ԧ⿃ߚ᭄/%
㢅
㡆
㣋
ᕫ
⥛
/ (m
g/
g)
图 1 乙醇体积分数对黑莓花色苷得率的影响
Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of
anthocyanins from blackberry fruits
由图1可知，花色苷得率在一定范围内随乙醇体积分
※工艺技术 食品科学 2012, Vol.33, No.24 119
数的升高而增加，当乙醇溶液体积分数为75%时花色苷
得率最大，然后随乙醇溶液体积分数的增加花色苷得率
降低，这可能与黑莓花色苷的极性大小有关系，故乙醇
溶液体积分数75%为佳。
2.1.2 不同料液比对黑莓花色苷得率的影响
称取20g解冻后的黑莓，在75%乙醇溶液、提取时间
35min的条件，在固定频率超声波下提取，料液比分别为
1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，结果如图2所示。
0.28
0.29
0.30
0.31
0.32
0.33
0.34
0.35
0.36
0.37
1:05 1:10 1:15 1:20 1:25
᭭⎆↨(g/mL)
㢅
㡆
㣋
ᕫ
⥛
/ (m
g/
g)
图 2 料液比对黑莓花色苷得率的影响
Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction yield of
anthocyanins from blackberry fruits
由图2可知，黑莓花色苷提取得率随溶剂用量的增
加而增大，在料液比1:15 时最大，以后呈平缓趋势，可
能是溶剂用量增加至一定程度时，超声提取效果达到最
佳，从经济角度考虑，选择料液比1:15为佳。
2.1.3 提取时间对黑莓花色苷得率的影响
在75%乙醇溶液、料液比1:15的条件，在固定频率超
声波下处理15、25、35、45、55min，提取效果如图3所
示。
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
15 25 35 45 55
ᦤপᯊ䯈/min
㢅
㡆
㣋
ᕫ
⥛
/ (m
g/
g)
图 3 料液比对黑莓花色苷得率的影响
Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of anthocyanins
from blackberry fruits
由图3可知，提取时间35min时，黑莓花色苷得率最
高，以后随时间延长得率逐渐降低，可能因为提取时间
过长导致温度升高，破坏了花色苷的分子结构，从而引
起花色苷得率下降。因此，选择最佳提取时间为35min。
2.1.4 正交试验
在单因素试验基础上，进行乙醇体积分数、提取时
间、料液比三因素三水平L9(33)正交试验，试验因素水平
见表1，设计及结果见表2。
表 1 黑莓花色苷提取的正交试验因素与水平
Table 1 Factors and levels for orthogonal array design
水平 因素
A乙醇体积分数/% B提取时间/min C料液比(g/mL)
1 65 25 1:10
2 75 35 1:15
3 85 45 1:20
表 2 黑莓花色苷正交试验设计及结果
Table 2 Orthogonal array design and results
试验号 因素
A乙醇体积分数 B提取时间 C料液比 花色苷得率/(mg/g)
1 1 1 1 0.297
2 1 2 2 0.311
3 1 3 3 0.324
4 2 1 1 0.337
5 2 2 3 0.365
6 2 3 2 0.346
7 3 1 3 0.315
8 3 2 2 0.351
9 3 3 1 0.346
K1 0.311 0.318 0.327
K2 0.349 0.342 0.334
K3 0.337 0.339 0.336
R 0.025 0.016 0.006
由表2极差分析可知，影响黑莓花色苷得率的主次顺
序为A＞B＞C，即乙醇溶液体积分数＞提取时间＞料液
比，最佳提取工艺参数为A2B2C3，即在固定率超声波下，
以75%乙醇溶液为溶剂、料液比1:20、提取时间35min，此
条件下黑莓花色苷得率0.365mg/g。
2.1.5 验证实验
按A2B2C3条件进行3次平行实验，黑莓花色苷得率的
平均值为0.368mg/g，与正交试验结果一致，故A2B2C3为
最佳提取工艺条件。
2.2 黑莓花色苷抗氧化活性的研究
2.2.1 黑莓花色苷对羟自由基的清除作用
*
*
*
*
*
0
20
40
60
80
100
1 2 3 4 5
⏙
䰸
⥛
/%
䋼䞣⌧ᑺ/(mg/mL)
咥㥧㢅㡆ᯨ
VC⒊⎆
图 4 黑莓花色苷和VC溶液对•OH的清除率
Fig.4 Scavenging rates of blackberry anthocyanin extract and vitamin
C against hydroxyl free radical
同质量浓度的黑莓花色苷提取物、VC溶液对•OH的
清除率如图4，从图4可以得出，黑莓花色苷提取物、VC
溶液对·OH都有较强的清除作用，且清除率呈现正相量
120 2012, Vol.33, No.24 食品科学 ※工艺技术
效关系。但黑莓花色苷提取物溶液对•OH的清除率显著
高于VC溶液的清除率(P＜0.05)。
2.2.2 黑莓花色苷对超氧阴离子自由基的清除作用
黑莓花色苷提取物、VC溶液对O2－•的清除率如图5所
示，从图5可以得出，黑莓花色苷提取物、VC溶液对O2－•
都有较强的清除率，黑莓花色苷提取物、VC溶液随着
质量浓度的升高，其对O2－•的清除率也逐步升高，并呈
量效关系。但黑莓花色苷提取物清除率显著高于VC溶
液(P＜0.05)。
*
*
*
* *
0
20
10
50
40
30
70
60
80
2(1) 4(2) 6(3) 8(4) 10(5)
⏙
䰸
⥛
/%
䋼䞣⌧ᑺ/(mg/mL)
咥㥧㢅㡆㣋⒊⎆
VC⒊⎆
横坐标为VC溶液质量浓度，括号内数字为黑莓花色苷溶液质量浓度。
图 5 黑莓花色苷和VC溶液对O2－•的清除率
Fig.5 Scavenging rates of blackberry anthocyanin extract and vitamin
C against superoxide anion free radical
2.2.3 黑莓花色苷对Cu2+诱导LDL氧化修饰的保护作用[14]
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
0 100 200 300 400 500 600
ডᑨᯊ䯈/(min)
K M A0.5
A1.0 A1.5 A2
A 2
34
nm
K：空白对照组；M：模型对照组；A0.5：0.5mg/mL黑莓花色苷提
取物溶液；A1.0：1.0mg/mL黑莓花色苷提取物溶液；A1.5：1.5mg/mL
黑莓花色苷提取物溶液；A2.0：2mg/mL黑莓花色苷提取物溶液。
图 6 不同质量浓度的黑莓花色苷溶液对Cu2+诱导LDL氧化修饰
延滞时间的影响
Fig.6 Effect of different concentrations of blackberry anthocyanin
extract on the delay time of Cu2+-induced LDL oxidation
通过黑莓花色苷在不同质量浓度下单位时间吸光度
的变化值来评价其抑制Cu2+诱导LDL氧化修饰的能力，这
样设计可以测定不同质量浓度的花色苷抑制LDL氧化修
饰的能力，根据实验的结果，将花色苷提取物配成0.5、
1.0、1.5、2.0mg/mL、空白组与模型组，共计6组，进行
试验。
图6表示不同质量分数黑莓花色苷提取物对Cu2+诱导的
LDL氧化滞后时间的曲线。当没有加入黑莓花色苷提取物
时，Cu2+诱导的LDL氧化的氧化时间为(24.90±3.80)min，
当加入不同质量分数黑莓花色苷提取物时候，Cu2+诱导
LDL氧化的时间不同程度发生了滞后现象。结果表明：
随着黑莓花色苷提取物质量分数的增加，LDL氧化滞后
时间明显延长，并呈量效关系。
3 结 论
通过对影响黑莓花色苷提取效果的乙醇体积分数、
提取时间、料液比进行单因素和正交试验，确定黑莓
花色苷的最佳提取工艺参数为以75%乙醇溶液作为提
取溶剂、料液比1:20(g/mL)，在固定频率超声波下提取
35min，黑莓花色苷得率可达0.365mg/g。
抗氧化试验表明：黑莓花色苷溶液清除·OH的能力
比同质量浓度的VC溶液强，并呈量效关系；黑莓花色苷
溶液清除O2－•的能力比高其一倍质量浓度的VC溶液的清
除力强。这说明黑莓花色苷可能对由过多·OH、O2－•造
成的人体疾病的预防效果比VC强，特别是对由O2－•造成
的人体疾病的预防效果则比VC更显著。
最新的研究表明，低密度脂蛋白(LDL)增高是动脉粥
样硬化(atherosclerotic)的重要危险因子，而LDL经过氧化
修饰，形成氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，则具有更强
的致AS作用[17-18]。本研究发现黑莓花色苷提取物具有较
强抑制Cu2+诱导LDL氧化修饰的作用，说明黑莓花色苷提
取物对降血脂、预防心血管等疾病及动脉粥样硬化具有
保护作用。
参考文献：
[1] 吴文龙, 顾姻. 新经济植物黑莓的引种[J]. 植物资源与环境学报,
1994, 3(3): 45-48.
[2] 吴文龙, 李维林, 闾连飞, 等. 不同品种黑莓鲜果营养成分的比较[J].
植物资源与环境学报, 2007(1): 58-61.
[3] WANG Cao, PRIOR R L. Total antioxidant capacity of fruits[J].
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1996, 44: 701-705.
[4] WANG S Y, LIN H S. Antioxidant activity in fruit and leaves of
blackberry, raspberry and strawberry is affected by cultivar and
maturity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48:
140-146.
[5] WANG S Y, JIAO H. Scavenging capacity of berry crops on
superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals and singlet
oxygen[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48:
5677-5684.
[6] SEERAM1N P, MOMIN1R A, NAIR M G, et al. Cyclooxygenase
inhibitory and antioxidant cyaniding glycosides in cherries and
berries[J]. Phytomedicine, 2001, 8(5): 362-369.
[7] TATE P, GOD J, BIBB R, et al. Inhibition of metalloproteinase
activity by fruit extracts[J]. Cancer Letters, 2004, 212: 153-158.
[8] BOATENG J, VERGHESE M, SHACKELFORD L, et al. Selected
fruits reduce azoxymethane(AOM)- induced aberrant crypt foci (ACF)
※工艺技术 食品科学 2012, Vol.33, No.24 121
in Fisher 344 male rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2007, 45:
725-732.
[9] HUANG W Y, CAI Y Z, ZHANG Y B. Natural phonetic compounds
from medicinal herbs and dietary plants: potential use for cancer
prevention [J]. Nutrition and Cancer, 2009, 62(1): 1-20.
[10] SEHWARZ M, HILLEBRAND S, HABBEN S, et a1. Application
of high-speed countercurrent chromatography to the large-scale
isolation of anthocyanins[J]. Biochemical Engineering Journal,
2003(14):179-189.
[11] ELISIA I, HU CHUN, POPOVICH D G, et a1. Antioxidant assessment
of an anthocyanin-enriched blackberry extract[J]. Food Chemistry,
2007, 101: 1052-1058.
[12] SELLAPPAN S, CASIMIR C A, KREWER G. Phenolic compounds
and antioxidant capacity of georgia-grown blueberries and
blackberries[J]. Agricultural Food Chemistry, 2002, 50: 2432-2438.
[13] PANTELIDIS G E, VASILAKAKIS M, MANGANARIS G A, et a1.
Antioxidant capacity, phenol, anthocyanin and ascorbic acid contents
in raspberries, blackberries, red currants, gooseberries and Comelian
cherries[J]. Food Chemistry, 2007, 102: 777-783.
[14] JURGENS G, CLEN Q, ESTERBAUER H, et al. Immunostainning
of human autopsy aortas with antibodies to modifi ed apolipoprotein B
and apoprotein (a)[J]. Arter Throm Vas, 1993(13): 1689-1699.
[15] 金鸣, 蔡亚欣, 李金荣, 等. 邻二氮菲Fe2+氧化法检测H2O2 / Fe 2+产生
的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展, 1996, 23(6): 553-555.
[16] 刘瑞恒, 付时雨, 詹怀宇. 氯化硝基四氮唑蓝显色检测超氧阴离子
自由基的研究[J]. 分析测试报, 2008, 27(4): 355-359.
[17] LEHR H, BECKER M, MARKLUND S. Superoxide dependent
stimulation of leukoeyte adhesion by oxidatively modified LDL in
vivo [J]. Arterio Thromb, 1992(12): 936-934.
[18] ESTERBAUER H J, GEBICKI H P. The role of lipid peroxidation and
antioxidants on oxidative modifi cation of LDL[J]. Free Radical Biol
Med, 1992(13): 341-390.