全 文 ：11※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 16
响应面法优化果胶酶酶解提取黑莓花色苷的
工艺参数
卢锋波 1，刘桂玲 2，王 烁 1，韩永斌 1 ,*，李 玮 3
(1.南京农业大学 农业部农畜产品加工与质量控制重点开放试验室，江苏 南京 210095；2.南京农业大学理学院，
江苏 南京 210095；3. 南京市溧水县科技局，南京 溧水 211200)
摘 要：选取果胶酶酶解黑莓浆加酶量、酶解温度和酶解时间 3个因素进行Box-Behnken设计，利用响应面法对其
提取工艺进行优化研究。利用Design Expert软件，对酶解花色苷产量的二次多项数学模型解逆矩阵分析表明：在
加酶量 0.21%、酶解时间 1.46h、酶解温度 42.7℃工艺条件下，酶解黑莓汁里花色苷产量最高，其最大提取产量
预测值为 0.645mg/g，与实测值相符。对花色苷含量、Hunter颜色值(L*、C*、h)进行两两线性相关分析，相关
程度表明，C* 值可在一定程度上表征花色苷含量。
关键词：黑莓；花色苷；果胶酶；响应面法
Response Surface Methodology as an Approach to Optimize Process Parameters for Pectinase Treatment of
Black Berry Slurry for Anthocyanin Extraction
LU Feng-bo1，LIU Gui-ling2，WANG Shuo1，HAN Yong-bin1,*，LI Wei3
(1. Key Laboratory of Food Processing and Quality Control, Ministry of Agriculture, Nanjing Agricultural University, Nanjing
210095, China；2. College of Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；3. Nanjing Lishui Science and
Technology Bureau, Lishui 211200, China)
Abstract ：To optimize the extraction of anthocyanins from black berry slurry based on pectinase treatment, a Box-Behnken
experimental design for three pectinase hydrolysis conditions (namely, pectinase loading and reaction time and temperature) was used
to provide experimental data for creating a quadratic regression model reflecting the relationship between the extraction yield of
anthocyanins and the hydrolysis conditions and based on this, response surface methodology was used to optimize these hydrolysis
conditions. The Design Expert software was employed to inversely resolve the created quadratic regression model, the results indicated
that pectinase loading of 0.21%, reaction time of 1.46 h and reaction temperature of 42.7 ℃ were found optimum and that under the
optimized conditions, the predicted value of the maximum extraction yield of anthocyanins was 0.645 mg/g, in close agreement with the
experimental value. Analysis of pairwise linear correlation among the content of anthocyanins and Hunter colour L*, C* and h values
was carried out, and it was found that C* value could represent the content of anthocyanins to a certain extent.
Key words：blackberry；anthocyanins pigment；pectinase；response surface methodology
中图分类号：TQ243.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)16-0011-05
收稿日期：2010-01-11
基金项目：江苏省自然基金项目(BK 2009649)；国家科技服务企业项目(2009GJC10019)
作者简介：卢锋波(1984—)，男，硕士研究生，主要从事生物技术与食品资源开发研究。E-mail：2008108067@njau.edu.cn
*通信作者：韩永斌(1963—)， 男，教授，博士，主要从事农产品加工与综合利用方面的研究。E-mail：hanyongbin@njau.edu.cn
黑莓(Rubus spp.)属蔷薇科(Rosaceae)、悬钩子属
(Rubus)、实心聚合果类，原产北美，其果实成熟后颜
色紫黑，柔软多汁，味酸甜，可鲜食或制成果汁、果
酒等加工品。我国自 1986年引种以来，黑莓栽培面积
迅速扩大[1]。黑莓果实中除含有丰富的VE及多种微量元
素和氨基酸，还含有大量的花色苷类色素[2]。矢车菊花
色苷具有较好的抗氧化和清除自由基等生物活性，可以
降低心脏病、癌症和其他慢性病的发生率[ 3 -7 ]，王卫东
等[8]研究表明黑莓中主要含有矢车菊 -3-葡萄苷，因此具
有很高的经济利用价值。
果胶酶制剂是产果胶酶、纤维素酶和蛋白酶等复合
酶，能降解果胶、纤维素和蛋白质等，降低果浆的黏
度，提高果汁的澄清度和出汁率[ 9 ]。目前，我国对用
果胶酶酶解黑莓汁的研究虽有报道，但对其酶解工艺参
2010, Vol. 31, No. 16 食品科学 ※工艺技术12
数的研究仅停留在单因素[10]或简单正交试验[11]方面，忽
略了酶解过程中各因素之间的交互作用。响应面法已被
广泛地用于色素提取的优化[12-14]，但在酶解工艺研究方
面报道较少。本研究选加酶量、酶解温度和酶解时间 3
个因素进行中心组合设计，利用响应面法优化酶解黑莓
汁花色苷产量的最佳酶解工艺参数，从而为酶解黑莓汁
提高其花色苷产量提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
赫尔黑莓果实(Hull) 江苏南京市新得力食品有限公
司，2008年 6月 25日收获，迅速速冻后于－ 18℃下保
存备用 )。
果胶酶(30000U/g) 和氏璧生物技术有限公司；无
水乙醇、盐酸(分析纯)。
1.2 仪器与设备
TDL-40B离心机 上海安亭科学仪器厂；UV-2803
紫外可见分分光光度计 美国尤尼克公司；CR-400色差
计 日本柯尼克美能达公司。
1.3 方法
1.3.1 单因素试验
黑莓果实打浆，准确称取 50 g 黑莓果浆，按质量
比加入一定量的果胶酶，一定温度下恒温浸提一定时
间，4000r/min离心，取黑莓汁，定容至 50mL，取 1mL，
用酸化乙醇(95%乙醇:1.5mol/L HCl=85:15，V/V)定容，
测定 530nm处吸光度，计算花色苷产量(mg/g黑莓浆)。分
别考察加酶量 0、0.1、0.2、0.3、0.4%(m/m)，酶解温
度 2 0、3 0、4 0、5 0、6 0、7 0℃，酶解时间 0、0 .5、
1、1.5、2、2.5h对酶解所得黑莓浆花色苷产量的影响。
1.3.2 果胶酶酶解提取黑莓花色苷响应面试验
510、700nm处测定吸光度，以矢车菊 -3-葡萄苷表示总
花色苷含量。并用色差计测定黑莓花色苷提取液的 L*、
a*、b* 值，计算 L*、C*、h值。
花色苷含量m/(mg/ L)=A×MW×DF×1000/(ε×1) (1)
A=(A510－A700)pH1.0－(A510－A700)pH4.5 (2)
C*= a*2＋ b*2；h=arctan(b*/a*) (3)
式中：M W 为矢车菊 - 3 - 葡萄苷相对分子质量，
449.2g/mol；DF为稀释倍数；ε为摩尔消光系数 26900L/
(mol·cm)；1为光程长 /c m；L* 为色素溶液的明度，
h 为颜色色调，C * 为颜色饱和度。
1.4 统计分析方法
试验均重复三次，采用 SAS 9.1.3软件进行多重比
较分析(显著性水平为 0 . 0 5、不同字母表示有显著差
异)、线性相关分析。采用Design-Expert7.0软件进行二
次多元回归拟合。
2 结果与分析
2.1 果胶酶用量对黑莓浆花色苷产量的影响
因素 代码
编码水平
－ 1 0 1
加酶量 /% A 0.1 0.2 0.3
酶解温度 /℃ B 40 50 60
酶解时间 /h C 0.5 1 1.5
表 1 因素水平编码
Table 1 Variables and levels in the response surface design
由表 2 可知，当果胶酶酶解温度 50℃、酶解时间
1h时，随着果胶酶用量由 0增加到 0.2%，黑莓果浆花
色苷产量逐渐增加，且有显著差异。当果胶酶用量≥
0.2% 时，不同组间花色苷产量无显著差异。
2.2 酶处理温度对黑莓浆花色苷产量的影响
由表 3可知，当果胶酶用量为 0.2%，酶解时间为
1h 时，随着温度的升高，黑莓果浆花色苷产量呈增加
后降低的趋势；其中，在 20～40℃之间，黑莓果浆花
色苷产量逐渐增加，且彼此之间差异显著，这可能是
因为随着温度的升高，果胶酶活力逐渐增加，更多
的果胶被降解，更多的花色苷色素分子从细胞壁中
溶出[ 1 6 ]。因此，适当提高酶解温度有利于花色苷色素
的溶出。在 40～60℃之间，花色苷产量先增加后降低，
可能是因为较高温度使得果胶酶活力下降或高温使得花
色苷发生部分降解[17 ]。
2.3 酶处理时间对黑莓浆花色苷产量的影响
由表 4 可知，当果胶酶用量为 0.2%、酶解温度 50℃
时，随着果胶酶酶解时间的延长，黑莓果浆花色苷产
量先逐渐升高后下降。其中，0～1 h 之间，花色苷产
量逐渐增加，且彼此差异显著；当果胶酶酶解时间延长
注：不同字母表示差异显著(P ＜ 0 . 05 )，下同。
果胶酶用量/% 0 0.1 0.2 0.3 0.4
花色苷产
0.192± 0.004c 0.210± 0.005b 0.230± 0.007a 0.235± 0.006a 0.230± 0.002a
量/(mg/g)
表 2 果胶酶用量对黑莓浆花色苷产量的影响
Table 2 Effect of pectinase loading on the extraction yield of
anthocyanins
在单因素试验的基础上，运用Box-Behnken设计，
以花色苷产量(mg/g黑莓浆)、L*、C*、h值为响应值，
以加酶量(A)、酶解温度(B)、酶解时间(C)为自变量，通
过响应面分析对黑莓果浆的酶解条件参数进行优化，因
素水平及编码见表 1。
1.3.3 花色苷含量及Hunter颜色参数测定
花色苷含量的测定采用 pH示差法[15]，取一定体积
花色苷提取液，分别用 pH1 .0、4 .5 的缓冲溶液定容，
13※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 16
到 1h以上时，花色苷产量逐渐降低，但彼此差异不显
著。这可能是因为在 50℃花色苷发生了轻微降解。
2.4 响应面分析试验
时间 /h 0 0.5 1 1.5 2 2.5
花色苷产量 /(mg/g) 0.253± 0.003c 0.288± 0.001b 0.307± 0.004a 0.302± 0.005a 0.299± 0.006a 0.298± 0.004a
表 4 酶处理时间对黑莓浆花色苷产量的影响
Table 4 Effect of reaction time on the extraction yield of anthocyanins
编号 加酶量 温度 时间 花色苷产量/(mg/g) 明度L* 色度C* 色角h
1 －1 －1 0 0.542±0.002 31.00± 0.18 31.24± 0.05 10.93± 0.12
2 1 －1 0 0.615±0.005 30.47± 0.10 32.34± 0.07 12.98± 0.07
3 －1 1 0 0.511±0.004 31.34± 0.10 30.88± 0.07 9.53± 0.13
4 1 1 0 0.564±0.003 30.72± 0.09 31.02± 0.03 12.02± 0.03
5 －1 0 －1 0.529±0.007 31.28± 0.07 31.14± 0.11 10.60± 0.09
6 1 0 －1 0.585±0.005 31.21± 0.14 31.33± 0.09 10.27± 0.01
7 －1 0 1 0.549±0.006 31.00± 0.04 31.37± 0.07 8.87± 0.18
8 1 0 1 0.589±0.003 30.54± 0.09 32.37± 0.05 12.72± 0.07
9 0 －1 －1 0.585±0.003 30.37± 0.11 32.54± 0.06 13.03± 0.06
10 0 1 －1 0.630±0.005 31.31± 0.06 32.35± 0.18 13.92± 0.05
11 0 －1 1 0.643±0.004 30.20± 0.04 32.37± 0.07 13.99± 0.09
12 0 1 1 0.561±0.007 30.36± 0.07 32.31± 0.01 13.49± 0.14
13 0 0 0 0.644±0.006 29.32± 0.09 32.35± 0.09 13.92± 0.07
14 0 0 0 0.585±0.005 29.49± 0.07 32.88± 0.15 13.85± 0.08
15 0 0 0 0.616±0.002 29.31± 0.06 32.28± 0.03 13.24± 0.11
16 0 0 0 0.618±0.007 29.35± 0.15 32.99± 0.04 14.03± 0.15
17 0 0 0 0.626±0.004 29.31± 0.07 32.35± 0.02 13.30± 0.05
表 5 响应面试验设计与结果
Table 5 Response surface central composite design arrangement and
experimental results
注：*、** 和 ** * 分别表示 0 .0 5、0 .0 1、0 .0 01 水平上差异显著。
花色苷产量 明度 L* 色度C* 色调 h
β0 0.62 29.36 32.57 13.67
A 0.028** －0.210** 0.304 1.008***
B －0.015 0.211** －0.241 －0.246
C 0.002 －0.259*** 0.133 0.156
回归系数
A2 －0.051*** 0.987*** －1.020*** －2.648***
B2 －0.009 0.540*** －0.180 0.345
C2 －0.004 0.665*** 0.002 -0.405
AB －0.005 －0.023 －0.240 0.110
AC －0.004 －0.098 0.203 1.045**
BC －0.032* －0.195* 0.033 －0.348
R2 0.910 0.989 0.866 0.965
模型 P值 0.0063** ＜ 0.0001*** 0.0222* 0.0003***
表 6 回归模型方差分析
Table 6 Analysis of variances for the created regression model
对果胶酶酶解过程中的加酶量(A)、酶解温度(B)、
酶解时间(C)进行 3因素 3水平响应面分析试验，试验设
计与结果见表 5。利用Design Expert软件对表 5数据进
行二次回归拟合。
对上述回归模型进行方差分析(表 6 )，结果表明，
模型都是显著的(P＜ 0.05)，回归模型的决定系数分别为
0.910、0.989、0.866和 0.965，说明这些模型能分别解
释 91%、98 .9%、86 .6%、96 .5%的变化。因此，可
用这些模型对果胶酶酶解黑莓浆所得花色苷产量与其颜
色参数进行分析和预测，对实践具有指导意义。
2.5 果胶酶酶解提取黑莓浆花色苷产量的响应面优化
利用Design Expert软件对表 6数据进行二次多元回
归拟合，所得二次回归方程的响应面等高线见图 1～3。
图 1 温度和加酶量对黑莓浆花色苷产量的影响
Fig.1 Contour plot reflecting the interactive effects of reaction
temperature and pectinase loading on the extraction yield of
anthocyanins
0.538479
0.556582 0.592789
0.574686
0.610893
0.592789
0.61862
0.600615
0.624657
0.627163
0.628503
60
55
50
45
40
温
度
/℃
加酶量 /%
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
温度 / ℃ 20 30 40 50 60 70
花色苷产量 /(mg/g) 0.189± 0.003d 0.217± 0.006c 0.237± 0.004b 0.253± 0.005a 0.240± 0.002b 0.240± 0.003b
表 3 酶处理温度对黑莓浆花色苷产量的影响
Table 3 Effect of reaction temperature on the extraction yield of anthocyanins
从图 1可以直观地看出，当酶解时间 1h时，温度
一定时，随着果胶酶用量的增加，黑莓浆花色苷产量
先增加后减小；而当果胶酶添加酶量一定时，花色苷产
量随着温度的升高逐渐降低。可见，添加适量果胶酶，
适当提高温度有利于花色苷的溶出，而温度较高则不利
于花色苷提取。
当果胶酶用量为 0 .2% 时，温度低于 50℃时，随
着酶解时间的延长，花色苷产量逐渐增加；而酶解温
度高于 55℃时，随着酶解时间的延长，黑莓浆花色苷
产量呈下降趋势，这是由于高温导致了花色苷发生部分
2010, Vol. 31, No. 16 食品科学 ※工艺技术14
图 2 时间和温度对黑莓浆花色苷产量的影响
Fig.2 Contour plot reflecting the interactive effects of reaction
temperature and time on the extraction yield of anthocyanins
0.638922
0.628503
0.627163
0.624657
0.622095
0.61862
0.592729
0.600615
0.610893
0.614804
0.61862
0.616561
0.615872
0.574686
0.592789
0.600615
0.610893
0.614804
0.616561
0.615872
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
时
间
/h
40 45 50 55 60
温度 /℃
降解[18-21]；当酶解时间较长时，花色苷产量随温度的升
高逐渐降低。
图 3 时间和加酶量对黑莓浆花色苷产量的影响
Fig.3 Contour plot reflecting the interactive effects of reaction time and
pectinase loading on the extraction yield of anthocyanins
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
时
间
/h
0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
加酶量 /%
0.556582
0.574686
0.592789
0.601674 0.616038
0.616893
0.620969
0.620197
0.619315
0.618282
0.601674
0.610893
0.616038
当果胶酶用量 0.2%时，温度一定时，随着酶解时
间的延长，花色苷产量先增加后降低；当酶解时间一定
时，随着果胶酶用量的增加，花色苷产量先增加后降
低。可见，添加适量果胶酶，适当的酶解时间，有
利于黑莓浆中花色苷的溶出。
2.6 验证实验
证性试验表明，在此条件下的提取产量高于另外随机两
组的提取产量。
2.7 花色苷含量与Hunter颜色值(L*、C*和 h值)的相
关性分析
L* C* h AC
L*
1.000 －0.731 －0.697 －0.634
0.0009 0.0019 0.0062
C*
－0.731 1.000 0.867 0.740
0.0009 ＜ 0.001 0.0007
h
－0.697 0.867 1.000 0.792
0.0019 ＜ 0.001 0.0001
AC
－0.634 0.740 0.792 1.000
0.0062 0.0007 0.0001
注：AC 为花色苷含量，线性相关系数下为相关程度显著性水平(P值)。
表 8 线性相矩阵及相关程度显著性水平
Table 8 Linear correlation matrix and significance levels
试验 酶添加量 /%(m/m) 温度 /℃ 时间 /h
花色苷产量 /(mg/g)
实际值 预测值
最优条件 0.21 42.7 1.46 0.635± 0.024 0.645
随机 1 0.2 40 1 0.617± 0.018 0.624
随机 2 0.2 60 0.5 0.597± 0.03 0.62
表 7 验证实验结果
Table 7 Results of validation experiments for the optimized hydrolysis
conditions
采用 SAS 9.1.3 软件对表 5的 17组试验数据进行线
性相关分析，计算其 Pearson相关系数及相关程度显著
性水平。由表 8 可知，花色苷含量与 L *、C *、h 值
具有一定的线性相关性(P＜ 0.05)，其中，花色苷含量
与 h值线性相关程度最高，正相关，相关系数达 0.792；
花色苷含量与 L*值负相关、h*值正相关，相关系数分
别为－ 0.634、0.740。L*值与 C*值负相关，C*值与
h值相关系数为 0 .867，呈较高程度的正相关。可见，
L*、C * 值可以在一定程度上反映花色苷含量的多少：
L*值越低，即越暗，颜色越浓，花色苷含量越多，C*
值越大，颜色越饱和，花色苷含量越多；另外，L *、
C * 和 h * 值有一定程度的相关性，因此，在实际生产
中可以用 C*值来简便有效地表征花色苷含量。
3 结 论
本实验用响应面法对黑莓浆的果胶酶酶解条件参数
进行优化。建立的黑莓浆花色苷产量的二次多项数学模
型具有显著性(P=0.0063)，决定系数为 0.910。对此模型
解逆矩阵得果胶酶最佳酶解条件为：加酶量 0.21%、酶
解时间 1.46h、酶解温度 42.7℃，花色苷最大产量预测
值为 0.645mg/g。花色苷含量与 Hunterh颜色参数(L*、
C*和 h值)有一定程度的线性相关性，L*、C*和 h值
有一定程度的线性相关性，实际生产中可以用 C*值来
简便有效地表征花色苷含量。
参 考 文 献 ：
[1] 孙醉君, 顾姻, 蔡剑华. 黑莓引种十年回顾与展望[J]. 江苏林业科技,
1998, 25(3): 46-48.
通过对果胶酶酶解黑莓浆花色苷产量的二次多项式
数学模型解逆矩阵，得出黑莓果浆花色苷产量在果胶酶
添加量为 0.21%、酶解时间 1.46h、酶解温度 42.7℃的条
件下达到最大，其最大提取产量预测值为 0.645mg/g。验
15※工艺技术 食品科学 2010, Vol. 31, No. 16
[2] 吴文龙, 李维林, 闾连飞, 等. 黑莓、树莓在南京地区的引种究[J].
江苏林业科技, 2006, 33(2): 13-15.
[3] ELISIA I, HU C, POPOVICH D G, et al. Antioxidant assessment of an
anthocyanin-enriched blackberry extract [J]. Food Chemistry, 2007, 101
(3): 1052-1058.
[4] NETZEL M, STRASS G, KAUL C, et al. In vivo antioxidative capacity
of a composite berry juice[J]. Food Research Internationa, 2002, 35(2/3):
213-216.
[5] FRANCIS F. Food colourants: anthocyanins[J]. Critical Reviews in
Food Science and Nutrition, 1989, 28(4): 273-314.
[6] JACKMAN R L,YADA R Y, et al. Anthocyains as food colorants-a
review [J]. Food Biochem, 1987, 11(3): 201-247.
[7] SANCHEZ-MORENO C, LARRAURI J A, SORRENTI V, et al. Free
radical scavenging capacity and inhibition of lipid oxidation of wines,
grape juices and related popyphenolic constituents [J]. Food Research
International, 1999, 32: 407-412.
[8] 王卫东, 李超, 许时婴. 高效液相色谱 -串联质谱法分离鉴定黑莓花
色苷[J]. 食品科学, 2009, 30(14): 230-234.
[9] SARIOGLU K, DEMIR N, ACAR J. The use of commercial pectinase
in the fruit juice industry, part 2: determination of the kinetic behavior of
immobilized commercial pectinase[J]. Journal of Food Engineering,
2001, 47(4): 271-274.
[10] 张丽华，韩永斌，孙晶, 等. 低温果胶酶处理对黑莓汁率和几个
理化指标的影响[J]. 食品工业科技, 2005(11): 82-84.
[11] 徐怀得, 史清华, 侯东丽. 黑莓饮料加工技术研究[J]. 西北农业学报,
2004, 13(1): 98-100.
[12] 范龚健, 韩永斌, 顾振新, 等. 用响应面法优化红甘蓝色素提取工艺
参数[J]. 南京农业大学学报, 2006, 29(1): 103-107.
[13] 郑辉杰, 李志强, 刘伟, 等. 响应面法优化番茄红素提取工艺研究[J].
北方园艺, 2009(2): 5-8.
[14] FAN Gongjian, HAN Yongbin, GU Zhenxin. Composition and colour
stability of anthocyanins extracted from fermented purple sweet potato
culture[J]. LWT, 2008, 41(8): 1412-1416.
[15] GIUSTI M M, WORSLTAD R E. Characterization and measurement of
anthocyanins by UV-visible spectroscopy. Current protocols in food
analytical chemistry[M]. New York: Wiley, 2001.
[16] CAPOTMOVA D, DRDAK M. Comparison of some commercial petic
enzyme preparations applicable in wine technology[J]. Czechoslovak J
Food Sci, 2002, 20(4): 131-134.
[17] BAKOWSKA A, KUCHARSKA A Z, OSZMIANSKI J. The effects of
heating, UV irradiation, and storage on stability of the anthocyanin–
polyphenol copigment complex[J]. Food Chemistry, 2003, 81(3): 349-
355.
[18] BUCHER J, KOPONEN J, SUUTARINEN M, et al. Effect of enzymei-
aided pressing on anthocyanins yield and profiles in bilberry and
blackcurrant juices[J]. Journal of Food Science and Agriculture, 2005, 85
(15): 2458-2556.
[19] OLIVER D. Polyphenol interactions. The copigmentation case: thermo-
dynamic data from temperature variation and relaxation kinetics[J]. Can
J Chem, 1992, 70: 2174-2189.
[20] CEMEROGLU B, VELIOGLU S, ISIK S. Degradation kinetics of
anthocyanins in sour cherry juice and concentrate[J]. Journal of Food
Science, 1994, 59(6): 1216-1218.
[21] KIRCA A, CEMEROLU B. Degradation kinetics of anthocyanins in
blood orange juice and concentrate[J]. Food Chemistry, 2003, 81(4):
583-587.
＜