全 文 ： 2009, Vol. 30, No. 14 食品科学 ※分析检测230
高效液相色谱-串联质谱法分离鉴定
黑莓花色苷
王卫东 1,2，李 超 1，许时婴 2,*
(1.徐州工程学院食品工程学院，江苏 徐州 221008；2.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122)
摘 要：利用高效液相色谱与二极管阵列检测器 /电喷雾质谱联用技术研究了黑莓中的花色苷类化合物，分离鉴定
出四种花色苷，均为矢车菊素花色苷。除了一种花色苷是由阿拉伯糖和矢车菊合成苷外，其他花色苷的糖基均为
葡萄糖，并且有两种花色苷和脂肪酸发生酰化。矢车菊 3-O-葡萄糖苷是黑莓中的主要花色苷，占全部色素含量
的 76.92%，矢车菊 3-O-阿拉伯糖苷、矢车菊 3-O-丙二酸酰葡萄糖苷和矢车菊 3-O-草酸酐酰葡萄糖苷含量依次为
5.57%、2.76%和 14.75%。
关键词：黑莓；花色苷；高效液相色谱 -串连质谱(HPLC/ESI-MS/MS)
High Performance Liquid Chromatography-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry
for the Analysis of Anthocyanins in Blackberry Fruit
WANG Wei-dong1,2，LI Chao1，XU Shi-ying2,*
(1. College of Food Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China；
2. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)
Abstract：The anthocyanin compositions in blackberry fruit were isolated using high performance liquid chromatography
(HPLC) equipped with a lichrospher C18 column and a DAD detector and characterized by UV spectrometry, gas chromatography
(GC) and electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS). A total of 4 anthocyanins were found to be isolated
on the C18 column. Among them were cyanidin (Cy) 3-O-glucoside (76.92%) , Cy 3-O-arabinoside (5.57%), Cy 3-O-
malonylglucoside（2.76%）and Cy 3-O-dioxalylglucoside (14.75%).
Key words：blackberry；anthocyanin；high performance liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass
spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS)
中图分类号：O657.63 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2009)14-0230-05
收稿日期：2008-10-28
作者简介：王卫东(1971－)，男，讲师，博士，研究方向为功能性食品添加剂及配料。E-mail：wwd.123@163.com
*通讯作者：许时婴(1940－)，女，教授，研究方向为功能性食品添加剂开发与应用。E-mail：syxu2005@hotmail.com
花色苷属于类黄酮化合物，具有黄烊盐离子的基本
结构，是果蔬及其产品呈现从红色到蓝色的物质基础，
具有抑制血小板凝固，预防血栓、心脏病，抗癌，延
缓衰老等作用[1-3]。黑莓(blackberry)富含花色苷和其他多
酚类物质，其提取物在体外具有很强的抗氧化活性[4]，据
报道，每100g黑莓果实中的花色苷含量为67.4～230mg[5]，
主要属于矢车菊类花色苷，其中含量最多的矢车菊 -3-O-
葡萄糖苷的含量占到花色苷总量的 80%以上[6-8]。此外，
Dugo等[9]在黑莓中发现了天竺葵和锦葵色素的花色苷。
由于黑莓品种繁多，且野生及人工改良的种类、成熟
度、气候以及种植条件都将导致花色苷含量和种类的极
大差异，加之花色苷类物质标准品少，因而，对它进
行检测分析很困难。本实验拟通过高效液相色谱连接光
电二极管阵列检测器和电喷雾质谱检测器联用技术(即液
质联用，HPLC-DAD-ESI-MS)得到花色苷类物质的紫外
光谱信息、分子量和分子结构的碎片信息，以期测定
黑莓中花色苷的成分及含量，为今后黑莓花色苷的研究
提供了一种准确且简便易行的方法。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器
黑莓单冻(individually quick frozen，IQF)，品种为
赫尔(Hull) 南京新得力食品有限公司。
甲醇(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司；L-鼠
231※分析检测 食品科学 2009, Vol. 30, No. 14
李糖、L- 阿拉伯糖、D- 木糖、D- 甘露糖、D- 葡萄糖
和D-半乳糖标准品 Sigma公司；其余化学试剂均为分
析纯。
Waters 2690高效液相色谱 -质谱联用仪、Waters 996
DAD检测器 美国Waters公司；Agilent 6890型气相
色谱仪 美国安捷伦公司；14A型 ShimadzuGC-2010气
相色谱仪(配以氢火焰离子化检测器) 日本岛津公司。
1.2 方法
1.2.1 花色苷提取
花色苷为水溶性色素，在中性或者碱性溶液中不稳
定，因此常用含有 0.1%～1%(V/V)的盐酸甲醇或乙醇溶
液提取，其中酸有利于提高花色苷的稳定性，防止非
酰基化的花色苷的降解。然而在提取液浓缩除去甲醇或
乙醇的过程中，由于盐酸浓度的提高可能导致花色苷的
降解。用丙酮提取花色苷的效率更高，重复性更好，
而且在真空浓缩时使用的温度更低，因此本实验采用丙
酮提取黑莓中的花色苷，提取液用 Sep-Pak C18小柱纯化
后进行HPLC-DAD-ESI-MS分析。
黑莓花色苷和多酚的提取参考 Trappey等[10]的方法
进行。分别称取 1 0g 黑莓果肉、黑莓种子或者黑莓浆
(将冷冻黑莓在 4℃解冻后打浆)，加入 20ml 丙酮，超声
10min(超声波功率 350W)。布氏漏斗抽滤后，残渣用
70%(V/V)丙酮重复提取，直到提取液清澈无色。合并
提取液，与氯仿以 1:2(V/V)混合，上层水相在 30℃下真
空浓缩除去丙酮，用水定容到 25ml。
1.2.2 花色苷纯化
将 Sep-Pak-C18固相微萃取小柱依次用含有 0.01%盐
酸的甲醇、乙酸乙酯和 0.01%盐酸的水各 5ml活化，取
2ml花色苷提取液吸附在小柱上，用氮气吹 3min后，先
用 0.01%盐酸的水 10ml洗去柱子上吸附的糖、蛋白等水
溶性物质，再用 5m l 乙酸乙酯洗脱非花色苷多酚类物
质，花色苷用 0.01%盐酸的甲醇洗脱收集。将甲醇洗脱
液在 40℃下浓缩至干，溶解于 1ml含有 0.01%盐酸的甲
醇中，以备液相色谱和质谱的测定。
1.2.3 花色苷水解
将3ml 1.2.1节中所得的提取液用C18小柱纯化后，浓
缩至干，加入 6mol/L的盐酸溶液 3ml，充入氮气并加
塞，在 100℃的水浴中加热水解 45min后立即用冰水冷
却。将水解液吸附在 Sep-Pak-C 18小柱上，糖基部分用
0.01%的盐酸水溶液洗脱收集，花色素部分用 0.01%的
盐酸甲醇溶液回收。
1.2.4 花色苷糖基部分的鉴定
水解回收的含糖基部分冷冻干燥，将干燥后的糖
基加入试管中，再加入 10mg的盐酸羟胺和 0.5ml的吡
啶，摇匀后于 90℃加热 30min，冷却，再加入 0.5ml的
乙酸酐摇匀，在 90℃加热 30min，冷却后用于气相色
谱分析。
色谱分析采用气相色谱仪(配以氢火焰离子化检
测器 )；色谱柱为石英毛细管柱( D B - 1 7 0 1，3 0 m ×
0.53mm)，汽化室温度 250℃，检测器温度 260℃；空
气流量 400ml/min，H2流量 47ml/min，氮气压力64.9kPa，
流量 10ml/min；分流比为 30:1，进样量 0.5μl；程序升
温：起始温度 120℃，停留 2min，以 10℃/min升温至
190℃，停留 2min，以3℃/min 升温至240℃，停留5min。
1.2.5 液相色谱和质谱条件
液相色谱条件：色谱柱：Lichrospher C18柱(2.0×
250mm，5μm)；流动相：A 液为甲醇，B 液为 0.4%
的甲酸。线性梯度洗脱：0～30min，A 液从 5 % 升至
4 0%；3 0～4 0 mi n，A 液从 4 0% 升至 8 0 %。流速：
0.3ml/min。柱温 35℃，进样量 10μl。DAD 检测器，
200～700nm全扫描。
质谱条件：正离子扫描(ESI+，m/z 200～1200)，毛
细管电压：3.99kV；锥孔电压：25V；光电倍增器电压：
650V；离子源温度：100℃；脱溶剂气温度：250℃。
2 结果与分析
2.1 黑莓花色苷提取液的液相色谱和紫外光谱
100
50
0
1
相
对
丰
度
(%
)
时间(min)
5 10 15 20 25 30
23
4
图1 黑莓花色苷提取物的高效液相色谱图(检测波长520nm)
Fig.1 HPLC chromatogram of blackberry anthocyanin extract
(detected at 520 nm)
图 1为黑莓花色苷提取物以 520nm为检测波长时的
高效液相色谱图，检测到 4个主要的色谱峰，各个色谱
峰的保留时间、光谱信息和相对含量见表 1。由表 1可
峰 保留时间 λVis-max* A440/Aλ 相对含量
号 (min) (nm) (×100) (%)
1 15.5 516 33.81 76.92
2 18.0 519 32.57 5.57
3 18.7 519 33.31 2.76
4 19.2 519 31.86 14.75
表1 黑莓花色苷提取物的液相色谱和光谱特性
Table 1 Liquid chromatographic and spectral characteristics of
anthocyanins from blackberry
注：* .可见光区最大吸收波长。
Vis-max
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100
50
0
222.6
相
对
丰
度
(%
)
波长(nm)
200 400 600
279.6
515.6
峰 1
100
50
0
199.6
相
对
丰
度
(%
)
波长(nm)
200 400 600
峰 2
220.6
279.6
518.6
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
波长(nm)
200 400 600
峰 3
220.6 279.6
518.6
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
波长(nm)
200 400 600
峰 4
518.6
280.6
212.6
图2 色谱峰1、2、3、4的紫外-可见吸收图谱
Fig.2 UV-Vis spectra of peaks 1, 2, 3 and 4 (see Fig.1)
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
m/z
200 400 600
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
5 10 15 20 25 30
时间(min)
20.45
213.3
287.3
图3 花色苷水解后花色素的HPLC(检测波长520nm)和ESI+-MS图
Fig.3 HPLC chromatogram and ESI+-MS spectrum of cyanidin in
blackberry anthocyanins (detected at 520 nm)
30
26
22
18
14
10
6
2
电
压
(m
V
)
时间(min)
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
11
.5
63
16
.2
30
图4 花色苷经酸水解后糖基的气相色谱图
Fig.4 Gas chromatogram of sugar moiety in blackberry anthocyanins
合物。
花色苷的紫外吸收光谱还可提供花色苷元、糖基取
代模式的信息。花色苷分子中 C3羟基总是以糖基化形
式存在，进一步的糖基化可以发生在 C5上的羟基，也
可能发生于 C7、C3、C5上的羟基。根据 Harborne[11]
的研究，花色苷的 A440与 AλVis-max的比值与糖基的取代位
置有关，C3，C5取代双糖花色苷的 A440/AλVis-max值是C3
取代单糖花色苷的一半，因此根据 AλVis-max与A440的比值，
结合查阅相关文献就可以判断糖基的位置。由表 1 可
见，四种花色苷的 A 440/AλVis -max值都在 30%以上，根据
Hong等[12]的研究，双糖花色苷的 A440/AλVis-max值小于 20%，
因此这些较高的值表明糖取代基处在花色苷的C3或C7
上的羟基。四个色谱峰在 300～330nm处都没有明显的
吸收峰存在，说明花色苷分子中的糖没有和羟基苯乙烯
酸发生酰化，有可能存在脂肪酸酰化(如果有酰化基团
存在) [11 ,13]。
2.2 花色苷酸水解后的糖基和配基
花色苷在盐酸的作用下，糖基被水解，糖苷配基
(水解产物的非糖部分，即花色素)的液相色谱图见图 3。
从图 3 可以看出，黑莓中花色苷的糖苷配基只有一种。
由于花色素分子中不再含有糖基，极性减弱，所以保
留时间延长到 20.45min。从质谱图中可以看出，此花色
素的分子离子[M]+为m/z287.3，对应于矢车菊花色素的
分子量。黑莓中只有矢车菊类花色苷存在，使得在鉴
别黑莓产品的真伪上更为方便，因为在其中掺入葡萄或
草莓的成分，都会出现更多种类的花色苷。
见，峰 1(保留时间 15.5min)占了总峰面积的 76.92%， 峰
2、3、4分别占总峰面积的 5.57%、2.76%和 14.75%。
紫外 -可见光谱很早就被人们应用于花色苷的结构
鉴定。花色苷是类黄酮化合物，在 280nm和 520nm左
右的两个波长处有特征吸收峰，而干扰花色苷分析的其
他类黄酮化合物(如黄酮、黄烷酮、黄酮醇、黄烷醇等)
在紫外区 300～350nm和 240～285nm有特征吸收峰，因
此通过测定多酚类物质的最大吸收波长即可判断其是否
为花色苷类多酚。图 1中四个色谱峰的紫外 -可见光谱
图见图 2。由图 2可知，这四个色谱峰在 510～520nm
处都有最大吸收，因此可以确定它们都是花色苷类化
233※分析检测 食品科学 2009, Vol. 30, No. 14
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
m/z
200 400 600 800 1000 1200
213.3
287.2
449.2
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HOO
O
OH
O+
峰 1
图5 黑莓花色苷(峰1和峰2)ESI+-MS图及结构
Fig.5 ESI+-MS spectra and structure of blackberry anthocyanins
(peaks 1 and 2)
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
m/z
200 400 600 800 1000 1200
287.2
535.3
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O+
HOO
O
O
O O
峰 3
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
m/z
200 400 600 800 1000 1200
287.3 峰 4
593.4
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
OO
O
OOOO
O
O+
图6 黑莓花色苷(峰3和峰4)ESI+-MS图及结构
Fig.6 ESI+-MS spectra and structure of blackberry anthocyanins
(peaks 3 and 4)
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
m/z
200 400 600 800 1000 1200
285.1
447.1
591.3
609.3
623.3 934.5 1185.8
图7 黑莓花色苷(峰4)ESI- MS图
Fig.7 ESI-MS spectrum of blackberry anthocyanin (peak 4)
花色苷水解后的糖基部分用气相色谱检测，结果
如图 4所示，图 4中两个色谱峰的保留时间为 11.563min
和 16.230min。根据标准糖样的保留时间，确定糖基是
阿拉伯糖和葡萄糖。对峰面积进行归一化定量，其含
量分别占总糖基的 8.25%和 91.75%。
2.3 花色苷的质谱分析
图 1中峰 1的质谱图见图 5，其分子离子[M+H]+为
m/z 449.2，碎片离子为 m/z 287.2，是由分子离子失去
了一个质量数为 162的中性碎片(脱水六碳糖基)而得。对
应于矢车菊葡萄糖苷或者其他六碳糖苷。由于花色苷用
盐酸水解后的糖中六碳糖只有葡萄糖，因此峰 1所代表
的花色苷是葡萄糖和矢车菊形成的苷。花色素分子中的
游离 3-羟基可破坏发色团的稳定性，因此它总是以糖基
化形式存在。综上所述，确定峰 1为矢车菊 3-O -葡萄
糖苷。到目前为止，矢车菊 3-O-葡萄糖苷被认为是黑
莓中最常见和含量最高的花色苷[8]。
峰 2的分子离子[M+H]+为m/z 419.2(图 5)，碎片离
子为 m/z 287，是由 m/z 419.2失去一个质量数为 132的
中性碎片而形成。132正是五碳糖和花色素成苷时失去
一分子水时的质量数。结合花色苷水解物的气相色谱
图，可知此五碳糖为阿拉伯糖。和峰 1 的花色苷一样，
只有一个糖时，成苷位置在 3位，因此峰 2为矢车菊 3-
O-阿拉伯糖苷。Dugo等[9]和Wada等[14]也认为黑莓中与
矢车菊成苷的五碳糖是阿拉伯糖，但 Sapers等[15]则认为
五碳糖是木糖。
峰 3的分子离子[M+H]+为m/z 535.3(图 6)，碎片离
子为 m/z 287，由 m/z 535失去一个质量数为 248的中性
碎片而形得。由于黑莓花色苷水解后的糖基只有葡萄糖
和阿拉伯糖，所以这个中性碎片中的糖基可能是葡萄糖
或者阿拉伯糖。如果是葡萄糖，则这个中性碎片可能
为葡萄糖(质量数 162)和丙二酸(质量数 86)酰化形成的；
如果 248的中性碎片由阿拉伯糖形成，则它可能与苹果
酸(质量数 116)发生酰化。迄今为止，关于黑莓中的酰
化花色苷尚未有苹果酸酰化的报道，因此推断峰 3为矢
车菊 3-O-丙二酸酰葡萄糖花色苷，与 Fang-Chiang[16]的
报道一致。
峰 4的分子离子[M+H]+为m/z 593.4(图 6)，碎片离
子为 m/z 287，由m/z 593失去一个质量数为 306的中性
碎片而得。由于花色苷正离子质谱图中碎片信息很少，
所以对峰 4的分析又参照了其负离子质谱图(图 7)。从负
100
50
0
相
对
丰
度
(%
)
m/z
200 400 600 800 1000 1200
287.2 峰 2
419.2
OH
OH
OH
OH
OH
OH
HO
O
O+
O
213.2
2009, Vol. 30, No. 14 食品科学 ※分析检测234
离子质谱图可以看出，峰 4的[M-H]－ m/z为 591.3，碎
片离子m/z 285是矢车菊素的负离子，m/z 447是矢车菊
素 -脱水葡萄糖的负离子，由分子离子失去质量数为 144
的碎片形成，因此推断峰 4为矢车菊 3-O-草酸酐酰葡萄
糖花色苷。
3 结 论
采用高效液相色谱 -电喷雾质谱联用技术可有效地
分离分析黑莓中花色苷类物质。实验结果表明，黑莓
中存在的花色苷为矢车菊 3-O-葡萄糖苷、矢车菊 3-O-阿
拉伯糖苷、矢车菊 3-O-丙二酸酰葡萄糖花色苷和矢车菊
3-O-草酸酰葡萄糖花色苷。矢车菊 3-O-葡萄糖苷为主要
的花色苷，其含量约占黑莓花色苷总量的 80%。
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