全 文 ：收稿日期:2008-11-24
作者简介:巩克民(1979-), 男(汉族), 山东泰安人 , 硕士研究生 , E-mailgkm110016@ 126.com;赵怀清(1955-),
男(汉族), 辽宁锦州人 ,教授 , 主要从事中药质量控制方法研究 , Tel.024-23986250, E-mailzhaohq1955@126.com。
文章编号:1006-2858(2009)09-0720-04
HPLC法同时测定天麻头风灵胶囊中原儿茶酸
紫丁香苷和绿原酸的含量
巩克民 1 , 门金玉2 , 马丽丽 2 , 崔玉芹2 , 刘晓英 2 , 赵怀清 2
(1.盐城卫生职业技术学院 药学系 , 江苏 盐城 224000;2.沈阳药科大学 药学院 ,辽宁 沈阳 110016)
摘要:目的 建立同时测定天麻头风灵胶囊中原儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸含量的方法。方法 采用
HPLC法。色谱柱为 DiamonsilC18柱(200mm×4.6mm, 5 μm),流动相为甲醇-乙腈-0.05%磷酸溶
液(体积比 20∶5∶174),流速为 1.0mL·min-1 , 柱温为 35 ℃,检测波长为 281 nm。结果 原儿茶酸 、
紫丁香苷 、绿原酸质量浓度分别在 2.40 ～ 24.0 mg·L-1 、5.20 ～ 52.0 mg·L-1、 26.6 ～ 266 mg·L-1
内与峰面积呈良好的线性关系 , r分别为 0.999 6、 0.999 7、 0.999 5, 平均回收率分别为 101.0%
(RSD=0.86%, n=9)、100.3%(RSD=1.9%, n=9)、101.5%(RSD=1.4%, n=9)。结论 HPLC法
可用于天麻头风灵胶囊的质量控制。
关键词:天麻头风灵胶囊;原儿茶酸;紫丁香苷;绿原酸;高效液相色谱法
中图分类号:R917　　　文献标志码:A
　　天麻头风灵胶囊由天麻 、地黄 、玄参 、槲寄生 、
当归 、钩藤 、野菊花 、杜仲 、川芎 、牛膝等 10味药材
组成 ,收载于 《中华人民共和国卫生部药品标
准 》,具有滋阴潜阳 、祛风 、强筋骨之功效 ,用于顽
固性头痛 、长期手足麻木 、慢性腰腿酸痛等症。目
前在标准和文献中只收载了野菊花的定性鉴别反
应 [ 1-2] ,尚未见野菊花 、杜仲 、槲寄生中有效成分
含量测定的报道 。为进一步控制天麻头风灵胶囊
的质量 ,作者采用 HPLC法同时测定了天麻头风
灵胶囊中绿原酸(野菊花及杜仲)、原儿茶酸(槲
寄生)、紫丁香苷(槲寄生)的含量 ,力求为天麻头
风灵胶囊的质量控制提供依据 。绿原酸 、原儿茶
酸 、紫丁香苷的结构式见图 1。
Fig.1　Structuresofchlorogenicacid(a), protocatechuicacid(b)andsyringin(c)
1　仪器与材料
LC-10AT高效液相色谱仪 、SPD-10AT紫外检
测器(日本 Shimadzu公司), 2010色谱数据工作
站(浙江大学智能信息研究所),超声波仪(上海
冠特超声仪器有限公司),电子分析天平(北京塞
多利斯仪器系统有限公司)。
天麻头风灵胶囊 (批号分别为 070103、
070506、070812,市售),绿原酸 、原儿茶酸 、紫丁香
苷对照品(批号分别为 111574-200201、110809-
第 26卷 第 9期
2 0 0 9 年 9 月
沈　阳　药　科　大　学　学　报
JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity
Vol.26 　No.9
Sep.2009 p.720
200604、0753-9708,中国药品生物制品检定所),
乙腈 、甲醇(色谱纯 ,天津康科德科技有限公司),
甲醇(分析纯 ,天津康科德科技有限公司),磷酸
(分析纯 ,沈阳东兴试剂厂),氯仿(分析纯 ,天津
百世化工有限公司),二次蒸馏水(自制)。
2　方法与结果
2.1　色谱条件的选择
色谱 柱:DiamonsilODS柱 (200 mm ×
4.6mm, 5μm);流动相:甲醇-乙腈-体积分数为
0.05%的磷酸溶液(体积比 20∶5∶174);检测波
长:281 nm;流速:1.0 mL·min-1;柱温:35 ℃;进
样量:20μL。
2.2　溶液的制备
2.2.1　混合对照储备液
取原儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸对照品适量 ,
精密称定 , 分别置 25 mL量瓶中 , 用体积分数
50%的甲醇溶解并稀释至刻度 ,摇匀 ,制成质量浓
度分别为 0.120、0.260、1.330 g·L-1的对照溶液
1、2、3;分别吸取对照溶液 1、2、3各 5 mL,置同一
25mL量瓶中 ,用体积分数 50%的甲醇稀释至刻度 ,
摇匀 ,即得混合对照储备液。每 1 mL含原儿茶酸
0.024mg、紫丁香苷 0.052mg、绿原酸 0.266mg。
2.2.2　供试溶液
取天麻头风灵胶囊 10粒 ,倾出内容物研细 ,
取约 1.0 g粉末 ,精密称定 ,置具塞锥形瓶中 ,精
密加入甲醇 30 mL,密塞 ,超声处理 30 min,放冷 ,
4 000 r·min-1离心 10 min后取上清液 ,旋转蒸
干 ,残渣用 10 mL水溶解 ,溶液用氯仿萃取 2次 ,
每次 20 mL;弃去氯仿层 ,水层旋转蒸干 ,残渣用
流动相溶解并转移至 10 mL量瓶中 ,稀释至刻
度 ,摇匀 ,过 0.45μm微孔滤膜 ,取续滤液即得供
试溶液 。
2.2.3　阴性溶液
按处方比例依据天麻头风灵胶囊制备工艺分
别制备不含野菊花 、杜仲和槲寄生的阴性对照供
试品 ,按 “2.2.2”条方法操作 ,得阴性溶液。
2.3　系统适用性试验
按 “2.1”条色谱条件 ,分别取混合对照储备
液 、供试溶液 、阴性溶液进样分析 ,色谱图见图 1。
按原儿茶酸峰计算理论塔板数不低于 8 200,按紫
丁香苷峰计算理论塔板数不低于 8 000,按绿原酸
峰计算理论塔板数不低于 8 000 ,原儿茶酸 、紫丁
香苷和绿原酸色谱峰对称因子均在 0.95 ～ 1.05
之间 ,与相邻色谱峰的分离度均大于 1.5。阴性
对照品对样品测定无干扰 ,结果见图 2。
1—Protocatechuicacid;2—Syringin;3—Chlorogenicacid
Fig.2　HPLCchromatogramsofchemicalreferencesubstances(a), sample(b), samplewithoutFlosChrysanthenciIn-
diciandCortexEucommiae(c), samplewithoutHerbaVisci(d)
2.4　线性关系考察
精密量取混合对照储备液 1、2、4、6、8 mL,分
别置 10 mL量瓶中 ,用体积分数 50%的甲醇稀释
至刻度 ,摇匀 ,得系列标准对照溶液 。分别精密吸
721第 9期 巩克民等:HPLC法同时测定天麻头风灵胶囊中原儿茶酸 紫丁香苷和绿原酸的含量
取标准系列对照溶液和混合对照储备液进样分
析 ,记录色谱峰面积 。分别以质量浓度(ρ)为横
坐标 ,以峰面积(A)为纵坐标 ,进行线性回归。原
儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸回归方程分别为 A=
2.788 ×107ρ+3.063 ×103 , r=0.999 6;A=
2.348×107ρ-5.600 ×102 , r=0.999 7;A=
7.888×106ρ+1.475×102 , r=0.999 5。结果表
明 ,原儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸质量浓度分别在
2.40 ～ 24.0 mg·L-1、5.20 ～ 52.0 mg·L-1、26.6 ～
266mg·L-1内与峰面积呈良好的线性关系。
2.5　精密度试验
取同一混合对照溶液 ,原儿茶酸 、紫丁香苷 、
绿 原 酸 的 质 量 浓 度 分 别 为 96.0、 20.8、
106.4 mg·L-1 ,按 “ 2.1”条色谱条件 , 重复进样
6次分析 ,原儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸的峰面积
RSD分别为 0.59%、0.37%、0.11%(n=6),表明
仪器精密度良好 。
2.6　重复性试验
取同一批号 (070506)样品 ,按 “ 2.2.2”条制
备供试溶液 ,在 “ 2.1”条色谱条件下分析 ,原儿茶
酸 、紫丁香苷 、绿原酸含量的 RSD分别为 1.2%、
0.75%、0.51%(n=6),表明方法重复性良好 。
2.7　稳定性试验
按 “2.2.2”条方法制备供试溶液 1份 ,室温
放置 ,按 “ 2.1”条色谱条件 ,在 0、4、8、12、24 h分
别进样分析 。结果表明 ,原儿茶酸 、紫丁香苷 、绿
原酸室温放置 24 h内稳定 , RSD分别为 1.4%、
1.0%、1.9%(n=5)。
2.8　回收率试验
取已知含量 (批号 070506)的供试品约
0.5g,共 9份 ,精密称定 ,以低 、中 、高 3个质量浓
度分别精密加入原儿茶酸 、紫丁香苷和绿原酸对
照溶液 ,每一质量浓度取 3份 ,按 “ 2.2.2”条制备
供试溶液 ,在 “2.1”条色谱条件下进样分析 ,记录
色谱图 , 测定加样回收率 , 结果见表 1。其中
moriginal、mfound、Recovery均为同一质量浓度 3份的
平均值 。
Table1　Recoveriesofprotocatechuicacid, syringinandchlorogenicacidinTianmatoufenglingcapsules(n=9)
Component moriginal/mg madded/mg mfound/mg Recovery/% Meanrecovery/% RSD/%
0.111 4 0.057 6 0.169 3 100.5
Protocatechuicacid 0.111 7 0.115 2 0.228 0 101.0 101.0 0.86
0.111 5 0.172 8 0.287 0 101.6
0.169 8 0.083 2 0.252 2 99.0
Syringin 0.170 2 0.166 4 0.335 7 99.4 100.3 1.9
0.169 9 0.249 6 0.425 6 102.5
1.353 0 0.665 0 2.034 0 102.3
Chlorogenicacid 1.356 0 1.330 0 2.711 0 101.9 101.5 1.4
1.353 0 1.995 0 3.353 0 100.3
2.9　供试品含量测定
取 3批天麻头风灵胶囊样品 ,每批 3份 ,按
“ 2.2.2”条制备供试溶液 ,在 “2.1”条色谱条件下
进样分析 ,记录色谱图 ,按外标法计算样品中原儿
茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸的含量 ,结果见表 2。
Table2　Content(c)ofprotocatechuicacid, syringinandchlorogenicacidinTianmatongfenglingcapsules(n=3)
BatchNo. Protocatechuicacidc/(mg·g-1) RSD/%
Syringin
c/(mg·g-1) RSD/%
Chlorogenicacid
c/(mg·g-1) RSD/%
070103 0.223 5 0.70 0.325 5 0.33 2.698 0.32
070506 0.231 1 1.1 0.383 3 0.44 2.922 0.49
070812 0.223 0 0.75 0.334 3 0.82 2.701 0.38
3　讨论
a.测定波长的选择 。分别配制一定质量浓
度的原儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸对照溶液 ,在波
长 200 ～ 400 nm内扫描 ,原儿茶酸在 281 nm处有
最大吸收 ,紫丁香苷和绿原酸在 281 nm处均有较大
吸收。综合考虑最终确定 281nm为测定波长。
b.流动相条件的选择 。文献 [ 3-5]曾采用
在流动相中加入三氟乙酸或梯度洗脱的方法测定
紫丁香苷的含量。但三氟乙酸对仪器伤害较大 ,
而梯度洗脱操作烦琐 。本实验中比较了不同比例
的甲醇 -磷酸系统以及甲醇-乙腈 -磷酸系统等度洗
722 沈　阳　药　科　大　学　学　报 第 26卷　
脱的方法。结果 ,在使用甲醇 -乙腈 -磷酸系统时 ,
紫丁香苷和绿原酸可以达到满意的分离效果。由
于原儿茶酸和绿原酸具有弱酸性 ,在流动相中加
入适量的酸 ,可以抑制峰脱尾现象 。实验对体积
分数 0.02%、0.05%、0.1%的磷酸溶液进行了考
察 。结果 ,使用体积分数 0.02%的磷酸时 ,色谱
峰拖尾较严重;体积分数 0.05%和 0.1%的磷酸
都能很好的抑制峰拖尾 。考虑到色谱柱的耐受
性 ,最终确定流动相为甲醇 -乙腈-体积分数
0.05%磷酸溶液(体积比 20∶5∶74)。
c.提取方法的选择 。分别采用甲醇和质量
分数 25%的盐酸超声提取 ,发现甲醇的提取率
高 。但由于天麻头风灵胶囊药味组成复杂 ,杂质
较多 ,用甲醇超声提取夹带较多杂质 ,干扰测定。
为消除杂质的干扰 ,用甲醇超声提取后 ,再用氯仿
萃取 ,获得了满意的结果。
4　结论
采用 HPLC法同时测定了天麻头风灵胶囊中原
儿茶酸 、紫丁香苷 、绿原酸的含量。原儿茶酸 、紫丁
香苷 、绿原酸质量浓度分别在 2.40 ～ 24.0mg·L-1 、
5.20 ～ 52.0mg·L-1 、26.6 ～ 266mg·L-1内与峰面
积呈良好的线性关系 ,相关系数分别为 0.999 6、
0.999 7、 0.999 5 , 平均回收率分别为 101.0%
(RSD=0.86%, n=9)、 100.3%(RSD=1.9%,
n=9)、101.5%(RSD=1.4%, n=9)。 HPLC法
可用于天麻头风灵胶囊的质量控制 。
参考文献:
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中国实验方剂学杂志 , 2006, 12(2):71.
Simultaneousdeterminationofcontentsofprotocate-chuicacid, syringinandchlorogenicacidinTianma
toufenglingcapsulesbyHPLC
GONGKe-min1 , MENJin-yu2 , MALi-li2 , CUIYu-qin2 , LIUXiao-ying2 , ZHAOHuai-qing2
(1.DepartmentofPharmacy, YanchengHealthProfessionalTechnologyColege, Yancheng224000, China;
2.SchoolofPharmacy, ShenyangPharmaceuticalUniversity, Shenyang110016, China)
Abstract:ObjectiveTodevelopaHPLCmethodforthedeterminationofprotocatechuicacid, syringinand
chlorogenicacidinTianmatoufengling(traditionalChinesemedicines)capsules.MethodsThechromato-
graphicseparationwasachievedonaDiamonsilC18(200mm×4.6mm, 5μm)columnwithamobilephase
ofmethanol-acetonitrile-0.05% phosphoricacidsolution(V∶V∶V=20∶5∶174).Theflow ratewas
1.0mL·min-1 andthecolumntemperaturewas35 ℃.ResultsThecalibrationcurvewaslinearwithinthe
rangeof2.40-24.0mg·L-1(r=0.999 6)forprotocatechuicacid, 5.20-52.0 mg·L-1(r=0.999 7)for
syringinand26.6-266mg·L-1(r=0.999 5)forchlorogenicacid, respectively.Therecoveriesofprotocat-
echuicacid, syringinandchlorogenicacidwere101.0%(RSD=0.86%, n=9), 100.3%(RSD=1.9%,
n=9)and101.5%(RSD=1.4%, n=9), respectively.ConclusionsThemethodisaccurate, sensitiveand
specific.ItcanbeusedforthequalitycontrolofTianmaoufenglingcapsules.
Keywords:Tianmatoufenglingcapsule;protocatechuicacid;syringin;chlorogenicacid;HPLC
723第 9期 巩克民等:HPLC法同时测定天麻头风灵胶囊中原儿茶酸 紫丁香苷和绿原酸的含量