全 文 ：食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
166 2012 Vol. 38 No. 11 (Total 299)
高效毛细管电泳同时检测荸荠中的 4 种黄酮类物质
仰振中1，檀华蓉2，苏红晓1，王颖周1，陆宁1
1(安徽农业大学 茶与食品科技学院，安徽 合肥，230036)
2(安徽农业大学 生物技术研究中心，安徽 合肥，230036)
摘 要 采用毛细管电泳法分析荸荠中的黄酮类化合物，测定了芦丁、槲皮素、山奈酚和绿原酸的含量。研究了
缓冲液的种类、离子浓度、pH值、分离电压和运行温度等一系列电泳参数，得出优化的电泳条件为:缓冲液为 20
mmol /L磷酸二氢钾-20 mmol /L硼砂(pH 7. 8)，紫外检测波长 202 nm，分离电压 24 kV，运行温度 30℃。在此条
件下，上述 4 种物质在 7 min内即可分离，并在 3. 125 ～ 100 mg /L内有良好的线性关系，相关系数 R2 均在 0. 999
以上，相对标准偏差(RSD):迁移时间为 0. 78% ～ 0. 98%;峰面积为 6. 5% ～ 8. 6 %。在 5，10，20 mg /kg的添加水
平下，4 种物质的加标回收率为 80% ～98%。该方法简便、快速、重现性好，可推广应用于植物中 4 种黄酮类物
质的同时检测。
关键词 毛细管电泳，荸荠，黄酮类物质，分析检测
第一作者:硕士研究生(陆宁为通讯作者)。
收稿日期:2012 － 09 － 13，改回日期:2012 － 11 － 19
荸荠(Eleocharis tuberosa) ，也称马蹄，属莎草科
多年生浅水草本植物，广泛生长于安徽、江苏、广东、
浙江、湖南等地区，是一种独特的食药两用型经济作
物［1］。荸荠营养丰富，有很高的食用、药用价值，能
生津消滞、清热润肺、利气通化等［2，3］。
黄酮类化合物是植物次生代谢的产物，存在于自
然界的、具有 2-苯基色原酮结构的化合物。按结构
可分为黄酮醇、黄酮类、二氢黄酮类、花色素类、二氢
黄酮醇类、黄烷-3，4 二醇类、查尔酮、双苯吡酮类等
15 种［4 － 5］。黄酮类化合物具有抗衰老、清除自由基、
预防心血管疾病、防癌抗癌等功效，是极具开发潜力
的保健食品基料［6 － 9］。
许多研究证明，荸荠中含有大量的黄酮类化合
物［10 － 11］并且荸荠所具有的抑菌作用跟其黄酮类化合
物有关［12 － 13］。本研究以荸荠为原料，采用高效毛细
管电泳方法，对芦丁、槲皮素、山奈酚和绿原酸 4 种黄
酮类物质进行同时分离及测定，主要研究缓冲液的种
类、离子浓度、pH 值、运行温度和分离电压等电泳参
数对分离效果的影响。
1 材料与方法
1. 1 仪器与试剂
HC-3514 台式高速离心机(安徽中科中佳仪器有
限公司) ;高效毛细管电泳仪(P /ACETMMDQ，Beck-
man，USA)配有二极管阵列检测器和色谱工作站;
Seven Multi pH计(S40，Metter Toledo，CH) ;未涂层熔
融石英毛细管(60 cm ×75 μm，河北永年与锐沣色谱
器件有限公司) ;R 系列-旋转蒸发仪(上海申生科技
有限公司) ;Milli-Q 超纯水制备系统(Millipore，
USA)。
芦丁(纯度 ＞ 99. 8%) ，槲皮素(纯度 ＞ 99. 8%) ，
山奈酚(纯度 ＞ 99. 8%) ，绿原酸(纯度 ＞ 99. 8%) ，购
自阿拉丁试剂有限公司;硼砂、硼酸、KH2PO4、
K2HPO4、NaOH均为分析纯(国药集团化学试剂有限
公司) ，研究用水为超纯水。
样品来自安徽无为的荸荠，样品洗净晾干，切片
于 60℃热风干燥至干，研碎后 100 目筛筛分，密封储
存备用。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 溶液的配制
缓冲溶液:分别称取一定量的硼砂和 KH2PO4，
用超纯水溶解定容，配制成 20 mmol /L 磷酸二氢钾-
20 mmol /L硼砂的溶液，按一定比例混合，分别调 pH
值为 7. 0、7. 4、7. 8、8. 2、8. 6，过 0. 22 μm滤膜，备用。
标准溶液:精确称取芦丁、槲皮素、山奈酚、绿原
酸 4 种标准品各 10. 00 mg，用体积分数 80%甲醇溶
液溶解定容至 10 mL，分别配制成 1. 00 g /L 标准贮备
液;上机前混合 4 种标准贮备液并用 80%甲醇溶液
稀释，制得质量浓度分别为 100. 00、50. 00、25. 00、
12. 50、6. 25、3. 125 mg /L的标准混合工作液，备用。
样品溶液:取适量荸荠干粉加入体积分数 80%
乙醇水溶剂，料液比为 1∶ 20(g∶ mL) ，超声提取 2 次，
每次 60 min。合并离心取滤液，浓缩备用。
分析与检测
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1. 2. 2 预处理方法
用 20 mmol /L 磷酸二氢钾-20 mmol /L 硼砂(pH
7. 8)的缓冲液，未涂层熔融石英毛细管柱(60 cm ×
75 μm) ，于 30℃、24 Kv恒压下进行电泳分离，在 202
nm 波长下检测。毛细管柱使用前用 1 mol /L、0. 1
mol /L NaOH、超纯水分别清洗 20 min。每次换样后，
用 0. 1 mol /L NaOH、超纯水、缓冲液冲洗毛细管 2、3、
3 min，以保证研究的重复性［14 － 16］。
2 结果与讨论
2. 1 分离条件的确定
2. 1. 1 检测波长的确定
图 1 为 4 种物质标准溶液在 190 ～ 300 nm 波长
内的紫外扫描图。结果表明，芦丁和槲皮素的特征吸
收峰为 200 ～ 210 nm，山奈酚的特征吸收峰为 200 ～
220 nm，而绿原酸的特征吸收峰为 190 ～ 205 nm。综
合考虑，选择用 202 nm 作为 4 种黄酮类物质的最佳
检测波长。
1 －绿原酸，2 －芦丁，3 －槲皮素，4 －山奈酚;
图 2 ～图 7 同。
图 1 四种黄酮类物质的紫外光谱图
2. 1. 2 缓冲液体系的确定
缓冲溶液体系的选择对毛细管电泳分离效果有
十分明显的影响。本研究分别考察了硼砂-硼酸、磷
酸二氢钾-硼砂、磷酸二氢钾-磷酸氢二钾、硼酸-磷酸
氢二钾 4 种不同的缓冲体系对 4 种物质分离效果的
影响。结果表明，硼砂-硼酸和硼酸-磷酸氢二钾缓冲
体系不能完全分离这 4 种物质;磷酸二氢钾-磷酸氢
二钾的迁移时间明显较长;而磷酸二氢钾-硼砂缓冲
体系中的峰形较理想，灵敏度较高。因此，选择磷酸
二氢钾-硼砂作为本研究的运行缓冲液。
2. 1. 3 缓冲液离子浓度的确定
在 pH值为 7. 8 的基础上，考察了 20、30、40、50、
60 mmol /L 5 个离子浓度的磷酸二氢钾-硼砂缓冲体
系对 4 种物质分离效果的影响，结果如图 2 所示，结
果表明，离子浓度的变化对各物质的分离度有着很大
的影响，当离子浓度达到 30 mmol /L 以上时，绿原酸
和芦丁的分离度均降到了 1. 2 以下。同时，当离子浓
度过小时，电渗流会较小。综合考虑，选择 20 mmol /
L作为最佳的离子浓度。
图 2 离子浓度对分离度的影响
2. 1. 4 缓冲液 pH值的影响
考察了 20 mmol /L 磷酸二氢钾-20 mmol /L 硼砂
缓冲液的 pH值为 7. 0、7. 4、7. 8、8. 2、8. 6 时对 4 种物
质分离效果的影响，结果如图 3 所示。图 3 结果表
明，当 pH值为 7. 0、7. 4、7. 8 时，4 种物质的分离度都
在 1. 5 以上。因此本研究选择 pH 7. 0、7. 4、7. 8 为正
交研究因子。
图 3 pH值对分离度的影响
2. 1. 5 分离电压的影响
在其他条件相同的情况下，考察了分离电压分别
为 20、22、24、26、28 和 30 kV时对 4 种物质的分离度
和迁移时间的影响，结果见图 4。图 4 显示，电压对
分离度也有一定的影响，当分离电压为 20、22、24 和
26 kV时，各物质的分离度均大于 1. 5;并且随着分离
电压的减小，迁移的时间延长，当电压为 20 kV时，最
后 1 种物质的迁移时间已较长。同时考虑分离度和
迁移时间，本研究选择分离电压 22、24 和 26 kV为正
交研究因子。
2. 1. 6 分离温度的影响
分离温度不仅影响着分离的重现性，而且对分离
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图 4 分离电压对(A)迁移时间和(B)分离度的影响
度和迁移时间都有一定的影响，本研究考察了分离温
度分别为 20、22、24、26、28 和 30℃时对 4 种物质的分
离度的影响，结果如图 5 所示。当温度为 20、22、26、
30℃时，4 种物质的分离度都达到了 1. 5 以上。而当
温度为 20℃时，迁移时间较长。综合考虑，本研究选
择分离电压 22、26 和 30℃为正交研究因子。
图 5 分离温度对分离度的影响
2. 1. 7 正交研究
由 2. 1. 3 ～ 2. 1. 6 单因素试验可得，pH 值、分离
电压和分离温度对分离效果的影响较大，因此将缓冲
液体系的 pH 值、分离电压和分离温度作为 3 个因
素，每个因素选取 3 个水平，即 L9(3
3)确立最佳的毛
细管电泳分离条件，结果见表 1。
正交实验结果表明，第 2 组实验中的 4 种黄酮
类物质间最小分离度达到了 1. 5 以上，并且迁移时间
最短。因此最佳的毛细管电泳分离条件为:缓冲液为
20 mmol /L磷酸二氢钾-20 mmol /L硼砂(pH 7. 8) ，分
离电压为 24 kV，运行温度为 30℃。在此最佳的分离
条件下对 4 种物质进行分离，结果见图 6。
表 1 正交试验表 L9(3
3)
试验
号
pH
值
电压 /
kV
柱温 /
℃
迁移
时间 /
min
分离度(R)
绿原酸
-芦丁
芦丁-
槲皮素
槲皮素-
山奈酚
1 7. 0 26 30 5. 383 1. 184 2. 572 3. 152
2 7. 8 24 30 6. 508 1. 710 3. 157 1. 847
3 7. 4 22 30 6. 550 1. 488 2. 196 6. 238
4 7. 0 24 26 9. 346 1. 354 7. 211 1. 304
5 7. 8 22 26 7. 129 2. 302 5. 110 1. 603
6 7. 4 26 26 7. 308 2. 636 6. 142 2. 382
7 7. 0 22 22 9. 525 1. 842 5. 751 4. 262
8 7. 8 26 22 7. 033 2. 565 5. 722 2. 902
9 7. 4 24 22 8. 042 3. 156 5. 103 5. 724
图 6 四种黄酮类物质混合标准液的电泳图谱
2. 2 标准曲线的建立
在最佳的电泳条件下分别对质量浓度为 3. 125、
6. 25、12. 5、25、50 和 100 mg /L 的 4 种黄酮类物质的
混合标准液进行电泳分析，以混合标准液的质量浓度
为横坐标，以各物质的对应峰面积为纵坐标建立相应
的标准曲线，结果见表 2。
表 2 标准曲线和线性范围
标品名 回归方程
线性范围 /
(mg·L －1)
相关系数
(R2)
绿原酸 y = 478. 99x － 829. 5 3. 125 ～ 100 0. 999 1
芦丁 y = 693. 93x － 1 625. 7 3. 125 ～ 100 0. 999 5
槲皮素 y = 1 081. 1x － 1 016. 6 3. 125 ～ 100 0. 999 2
山奈酚 y = 372x + 1 618. 3 3. 125 ～ 100 0. 999 2
由表 2 可知，当混合标准液的浓度在 3. 125 ～
100 mg /L时，4 组分具有良好的线性关系，相关系数
均在 0. 999 以上。因此本方法可作为荸荠中 4 黄酮
类物质的检测。
2. 3 精密度和回收率研究
2. 3. 1 精密度研究
在最佳的电泳条件下，取 12. 5 mg /L混合标准液
连续进样 6 次，记录 4 物质的迁移时间和峰面积，考
分析与检测
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察其重复性。结果如表 3，迁移时间的 RSD(n = 6)小
于 1%;峰面积的 RSD(n = 6)小于 9%，说明该方法
有着良好的重现性和准确性。
表 3 四种物质峰面积和迁移时间的精密度
标品名
相对峰面积
平均值 RSD /%
迁移时间 /min
平均值 RSD /%
绿原酸 5 160. 4 7. 3 4. 534 0. 98
芦丁 7 040. 5 6. 5 5. 057 0. 96
槲皮素 12 510. 1 8. 6 5. 872 0. 78
山奈酚 6 301. 1 8. 5 6. 517 0. 88
2. 3. 2 回收率研究
在荸荠提取液中加入不同浓度的标准混合液，然
后按照最佳电泳条件进行加标回收率研究，结果见表
4。在 5，10，20 mg /kg 的添加水平下，4 种物质的加
标回收率为 80% ～98%。
表 4 加标回收率研究结果
组分 加标浓度 /(mg·L －1) 加标回收率 /%
绿原酸 20 84
10 88
5 91
芦丁 20 82
10 93
5 98
槲皮素 20 80
10 82
5 89
山奈酚 20 85
10 88
5 96
2. 4 样品的测定
取同一批的荸荠粉提取液样品，在最佳的分离条
件下重复进样 5 次，记录各个峰面积并取平均值。从
图 7 和表 5 中可以看出:荸荠中含有芦丁、槲皮素、山
奈酚和绿原酸这 4 种黄酮类物质。其中绿原酸的含
量为 69. 6 μg /g，芦丁的含量为 95. 6 μg /g，槲皮素的
含量为 198. 2 μg /g，山奈酚的含量为 41. 1 μg /g。
表 5 4 种黄酮类物质的含量
组分 峰面积
提取液浓度 /
(mg·L －1)
样品含量 /
(μg·g － 1)
绿原酸 2 504 6. 96 69. 6
芦丁 5 006 9. 56 95. 6
槲皮素 20 411 19. 82 198. 2
山奈酚 3 150 4. 11 41. 1
3 结论
(1)研究了同时分离检测荸荠中 4 种黄酮类物
质芦丁、槲皮素、山奈酚和绿原酸的最佳电泳条件，
即:缓冲液为 20 mmol /L磷酸二氢钾-20 mmol /L硼砂
图 7 荸荠提取液的电泳图谱(A)和加标电泳图谱(B)
(pH 7. 8) ，紫外检测波长为 202 nm，分离电压为 24
kV，运行温度为 30℃;在此条件下，4 种物质在 7 min
内即可完全分离。
(2)用建立的毛细管电泳方法，分离测定了荸荠
中 4 种黄酮类物质的含量:绿原酸的含量为 69. 6 μg /
g，芦丁的含量为 95. 6 μg /g，槲皮素的含量为 198. 2
μg /g，山奈酚的含量为 41. 1 μg /g。该方法简便、快
速、重现性好，可推广应用于植物中 4 种黄酮类物质
的同时检测。
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Analysis and Determination of Four Flavonoids in Water Chestnut
by High Performance Capillary Electrophoresis
Yang Zhen-zhong1，Tan Hua-rong2，Su Hong-xiao1，Wang Ying-zhou，Lu Ning1
1(College of Tea ＆ Food Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
2(Biotechnology Center，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China)
ABSTRACT Capillary electrophoresis (CE)method has been developed for the determination of flavonoids and the
content of rutin，quercetin，kaempferol，Chlorogenic acid in water chestnut． Based on the effects of composition and
concentration of running buffer，pH，separation temperature and separation voltage，the optimal conditions were found
as:the running buffer consisted of 20 mmol /L KH2PO4-20 mmol /L borax，the UV detection wavelength was 202 nm，
separation voltage was 24 kV，separation temperature was 30℃ ． Under these optimal chromatographic conditions，the
four flavonoids can be separated within 7 minute． Moreover，the calibration curves of the concentrations of four fla-
vonoids and their corresponding peak areas showed good linearity in the range 3． 125 from 100 mg /L． The correlation
coefficient was above 0． 999． The RSD of migration times was between 0． 78% and 0． 98%，and the RSD of peak are-
as was between 6． 5% and 8． 6 % ． At the spiked concentration of 5． 0，10． 0，20． 0 mg /kg，the average recoveries of
the four flavonoids ranged from 80% to 98% ． This method is very simple，rapid，good repeatability and can be ap-
plied to the determination of four flavonoids in plants．
Key words high performance capillary electrophoresis，water chestnut，flavonoids，analysis