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RP-HPLC法测定人参花中11个人参皂苷含量



全 文 :* 吉林省高校优秀青年科研人才春苗培育计划(201448)
** 通信作者 Tel:(0431)84510949:Email:jlndcyf@ 126. com
第一作者 Tel:(0431)84510949;E-mail:jilinzhangqiu@ 126. com
RP-HPLC法测定人参花中 11 个人参皂苷含量*
张金秋1,2,夏娟1,2,孙光芝1,3,穆静1,2,阮长春1,3,刘志1,3**
(1.吉林农业大学农业现代化综合技术研究所,长春 130118;2.吉林农业大学中药材学院,
长春 130118;3.吉林农业大学天敌昆虫应用技术工程研究中心,长春 130118)
摘要 目的:测定鲜人参花和人参花干品中 11 个人参皂苷的含量。方法:利用反相高效液相色谱法,使用 Cosmosil 5 C18-MS
(250 mm ×4. 6 mm,5 μm)分析柱,流动相为乙腈 - 0. 05 mol·L -1磷酸二氢钾溶液,梯度洗脱,流速 1 mL·min -1,柱温 25 ℃,检
测波长 203 nm。结果:丙二酰基人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rd及人参皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rd、Re、Rg1、Rg2质量浓度分别在 18. 83 ~
301. 20 μg·mL -1(r = 0. 999 1)、19. 01 ~ 304. 20 μg·mL -1(r = 0. 999 8)、18. 94 ~ 303. 00 μg·mL -1(r = 0. 999 3)、18. 79 ~
300. 60 μg·mL -1(r = 0. 999 4)、18. 56 ~ 297. 00 μg·mL -1(r = 0. 999 0)、18. 86 ~ 301. 80 μg·mL -1(r = 0. 999 1)、18. 94 ~
303. 00 μg·mL -1(r = 0. 999 5)、37. 58 ~ 601. 20 μg·mL -1(r = 0. 999 6)、37. 58 ~ 601. 20 μg·mL -1(r = 0. 999 1)、19. 05 ~
304. 80 μg·mL -1(r = 0. 999 3)、18. 68 ~ 298. 80 μg·mL -1(r = 0. 999 6)范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率
(n = 6)在 98. 3% ~ 102. 9%之间,RSD≤3. 0%。鲜人参花中 11 个人参皂苷平均含量为 10. 80%,其中丙二酰基人参皂苷的平
均含量为 3. 46%;人参花干品中 11 个人参皂苷含量为 10. 68%,其中丙二酰基人参皂苷的平均含量为 1. 21%。结论:本实验
方法简单,可高效地测定鲜人参花和人参花干品中 11 个人参皂苷的含量。
关键词:人参花;人参皂苷;丙二酰基人参皂苷;反相高效液相色谱法
中图分类号:R 917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2015)09-1596-05
doi:10. 16155 / j. 0254-1793. 2015. 09. 15
Determination of 11 kinds of ginsenosides from
Ginseng Bud by RP-HPLC*
ZHANG Jin-qiu1,2,XIA Juan1,2,SUN Guang-zhi1,3,
MU Jing1,2,RUAN Chang-chun1,3,LIU Zhi1,3**
(1. Institute of Agricultural Modernization,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;
2. College of Chinese Medicinal Material,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;
3. Engineering Research Center of Natural Enemy Insects,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)
Abstract Objective:To establish a method for the determination of 11 kinds of ginsenosides from both fresh and
dried Ginseng Bud.Methods:RP-HPLC was conducted on a Cosmosil 5 C18-MS column(250 mm × 4. 6 mm,5
μm)with the mobile phase of acetonitrile- 0. 05 mol·L -1 potassium dihydrogen phosphate solution by gradient elu-
tion at a flow rate of 1 mL·min -1 . The column temperature was maintained at 25 ℃,and the detection wave length
was 203 nm. Results:The linear response ranged from 18. 83-301. 20 μg·mL -1 for malonyl ginsenoside Rb1(r =
0. 999 1),19. 01-304. 20 μg·mL -1 for malonyl ginsenoside Rb2(r = 0. 999 8),18. 94-303. 00 μg·mL
-1 for mal-
onyl ginsenoside Rc(r = 0. 999 3),18. 79-300. 60 μg·mL -1 for malonyl ginsenoside Rd(r = 0. 999 4),18. 56-
297. 00 μg·mL -1 for ginsenoside Rb1(r = 0. 999 0),18. 86-301. 80 μg·mL
-1 for ginsenoside Rc(r = 0. 999 1),
18. 94-303. 00 μg·mL -1 for ginsenoside Rb2(r = 0. 999 5),37. 58-601. 20 μg·mL
-1 for ginsenoside Rd(r =
0. 999 6),37. 58-601. 20 μg·mL -1 for ginsenoside Re(r = 0. 999 1),19. 05-304. 80 μg·mL -1 for ginsenoside
Rg1(r = 0. 999 3)and 18. 68-298. 80 μg·mL
-1 for ginsenoside Rg2(r = 0. 999 6). The average recoveries(n = 6)
—6951— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015,35(9)
were between 98. 3%-102. 9%,and the RSD ≤3. 0% . In fresh Ginseng Bud,the contents of 11 kinds of ginsen-
osides was 10. 80%,and the content of malonyl ginsenosides was 3. 46%;in dried Ginseng Bud,the contents of 11
kinds of ginsenosides was 10. 68%,and the content of the malonyl ginsenosides was 1. 21% . Conclusion:The es-
tablished method is simple,fast and accurate,and can be applied for the determination of the content of 11 kinds of
ginsenosides from both fresh and dried Ginseng Bud.
Keywords:Ginseng Bud;ginsenosides;malonyl ginsenosides;RP-HPLC
人参花是五加科人参属多年生草本药用植物人
参(Panax ginseng C. A. Mey.)的花蕾,在我国具有
悠久的治疗疾病和保健历史。《本草纲目》中记载:
人参花性温和,味甘微苦,具有清热消炎、平肝清火、
解毒利咽、降血压等诸多药用功能。现代研究表明,
人参花中起主要药理活性的成分为人参皂苷。在人
参花皂苷的 HPLC 测定上,邱峰等[1]采用 HPLC 法
测得人参花中含有人参皂苷 Rb1、Re、Rd、Rc、Rb2、
Rg2、Rh1,三七皂苷 E,绞股蓝皂苷 XⅦ;王冠
[2]采用
HPLC法对人参花中人参单体皂苷的含量进行了分
析,结果表明,人参花中主要含有原人参二醇型皂苷
(人参皂苷 Rbl、Rb2、Rc、Rd)和原人参三醇型皂苷
(人参皂苷 Re、Rgl)。
人参皂苷中还有一类酸性人参皂苷—丙二酰基
人参皂苷,其含量很高,约占人参根总皂苷的 35% ~
60%[3 - 6]。药理研究表明,丙二酰基人参皂苷 Rb1
具有促进小鼠齿状突长时程增效作用和对神经生长
因子诱导体外培养鸡胚的背根神经突的外生长有增
强作用[7 - 8],丙二酰基人参皂苷提取物具有显著的
降血糖,调节脂代谢的作用[9]。由于该类皂苷极性
大,亲水性较强,极易溶于水,对热不稳定,易发生水
解反应,生成相应的中性人参皂苷,常规的高效液相
色谱(HPLC)法难以测定[10 - 12],目前 HPLC 测定人
参皂苷的方法多以测定中性人参皂苷(人参皂苷
Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rg1、Rb3、Rf、Rg3和 Rg2等)为
主[13 - 17],然而在人参花中有关丙二酰基人参皂苷的
研究未见报道。
本文建立了简单、准确的 RP-HPLC 方法,测
定了鲜人参花和人参花干品中 11 个皂苷的含量,
同时解释了 2 种不同人参花样品中丙二酰基人参
皂苷含量变化的原因,为人参花的开发利用提供
依据。
1 仪器与试药
日本岛津 LC-20A 高效液相色谱仪,紫外检测
器,LC-solution工作站。
酸性人参皂苷对照品丙二酰基人参皂苷 Rb1、
Rb2、Rc、Rd 为自制,经 IR、MS、NMR 鉴定,纯度为
99%;中性人参皂苷对照品人参皂苷 Rb1(批号
110704-200420)、Rb2(批号 111715 -200501)、Rc
(批号 07200-206)、Rd(批号 111818-381)、Re(批
号 110754-200421)、Rg1(批号 110703-200726)均
购于中国食品药品检定研究院,人参皂苷 Rg2购于
吉林大学药学院,纯度为 99. 65%。
鲜人参花 5 年生,采摘于抚松县吉林森工人参
良种繁育有限公司和白山市久年根参业有限公司 2
个不同 GAP基地,5 年生人参花干品购买于抚松万
良市场,经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴
定为五加科人参 Panax ginseng C. A. Mey.的花。
乙腈(美国 Fisher 公司)为色谱纯,其他试剂为
分析纯。
2 方法与结果
2. 1 供试品溶液的制备 将样品于 40 ℃下烘干粉
碎,过 40 目筛,精密称取 0. 5 g,用 80%甲醇水溶液
50 mL超声(250 W,40 kHz)提取 3 次,每次 20 min,
合并提取液,40 ℃浓缩至干,加 80%乙醇水溶液溶
解,定容于 50 mL量瓶中,摇匀,以 0. 45 μm 的滤膜
过滤,即得供试品溶液,4 ℃存储,备用。
2. 2 混合对照品溶液的制备 精密称取丙二酰基
人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rd 及人参皂苷 Rb1、Rc、
Rb2、Rd、Re、Rg1和 Rg2的对照品适量,加 80%乙醇
水溶液配制成每 1 mL 含上述成分分别为 0. 502、
0. 507、0. 505、0. 501、0. 495、0. 503、0. 505、1. 002、
1. 002、0. 508、0. 498 mg 的混合溶液,摇匀,即得混
合对照品储备液。精密取上述储备液 2 mL,加 80%
乙醇水溶液定容至 5 mL量瓶中,即得混合对照品溶
液,4 ℃存储,备用。
2. 3 色谱条件 色谱柱:Cosmosil 5 C18-MS(250
mm ×4. 6 mm,5 μm);流动相:乙腈(A)-0. 05 mol·
L -1磷酸二氢钾水溶液(B),洗脱梯度(0 ~ 22 min,
22%A;22 ~ 30 min,22% A→29% A;30 ~ 50 min,
29%A;50 ~ 60 min,29% A→35% A;60 ~ 70 min,
35%A→50%A);流速:1 mL·min -1;柱温:25 ℃;检
测波长:203 nm;进样量:20 μL;分析时间:70 min。
色谱图见图 1。
—7951—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015,35(9)
图 1 鲜人参花(A)、人参花干品(B)、对照品(C)的高效液相色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of fresh Ginseng Bud(A),dried Ginseng Bud(B) ,and reference substances(C)
1.人参皂苷 Rg1(ginsenoside Rg1) 2.人参皂苷 Re(ginsenoside Re) 3.丙二酰基人参皂苷 Rb1(malonyl ginsenoside Rb1) 4.丙二酰基人参皂苷 Rc(malonyl gin-
senoside Rc) 5.丙二酰基人参皂苷 Rb2(malonyl ginsenoside Rb2) 6.人参皂苷 Rg2(ginsenoside Rg2) 7.人参皂苷 Rb1(ginsenoside Rb1) 8.人参皂苷 Rc(gin-
senoside Rc) 9.丙二酰基人参皂苷 Rd(malonyl ginsenoside Rd) 10.人参皂苷 Rb2(ginsenoside Rb2) 11.人参皂苷 Rd(ginsenoside Rd)
2. 4 线性关系考察 精密吸取“2. 2”项下混合对
照品储备液适量,分别稀释成 5 个不同浓度的混合
对照品溶液,精确吸取 20 μL,按照“2. 1”项下条件
进样分析,记录各成分峰的峰面积,以峰面积 Y 对
质量浓度 X(μg·mL -1)进行线性回归,得回归方
程、线性范围和相关系数,结果见表 1。
表 1 11 个人参皂苷的回归曲线方程和相关系数
Tab. 1 Regression curves equations and correlation coefficients of 11 kinds of ginsenosides
人参皂苷
(ginsenoside)
回归方程
(regression equation)
线性范围
(linear range)/(μg·mL -1)
r
丙二酰基人参皂苷(malonyl ginsenoside) Rb1 Y =4. 12 × 106X -8. 73 × 103 18. 83 ~ 301. 20 0. 999 1
Rb2 Y =4. 32 × 106X -2. 41 × 103 19. 01 ~ 304. 20 0. 999 8
Rc Y =4. 43 × 106X -5. 32 × 103 18. 94 ~ 303. 00 0. 999 3
Rd Y =4. 58 × 106X -3. 12 × 103 18. 79 ~ 300. 60 0. 999 4
人参皂苷(ginsenoside) Rb1 Y =4. 59 × 106X -6. 56 × 103 18. 56 ~ 297. 00 0. 999 0
Rc Y =4. 12 × 106X -5. 89 × 103 18. 86 ~ 301. 80 0. 999 1
Rb2 Y =4. 18 × 106X -9. 88 × 103 18. 94 ~ 303. 00 0. 999 5
Rd Y =4. 42 × 106X -5. 86 × 103 37. 58 ~ 601. 20 0. 999 6
Re Y =5. 23 × 106X -8. 43 × 103 37. 58 ~ 601. 20 0. 999 1
Rg1 Y =5. 52 × 106X -3. 47 × 103 19. 05 ~ 304. 80 0. 999 3
Rg2 Y =5. 17 × 106X -5. 66 × 103 18. 68 ~ 298. 80 0. 999 6
2. 5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 20
μL,按照“2. 3”项色谱条件连续进样 6 次,测定峰面
积。结果丙二酰基人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rd 及人
参皂苷 Rb1、Rc、Rb2、Rd、Re、Rg1和 Rg2峰面积的
RSD 分别为 1. 1%、1. 2%、1. 3%、1. 8%、1. 3%、
1. 7%、2. 3%、2. 6%、1. 4%、1. 5%、1. 6%。表明精
—8951— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015,35(9)
密度良好。
2. 6 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液,分别
于 0、2、4、8、10 h 进样测定峰面积。结果丙二酰基
人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rd 及人参皂苷 Rb1、Rc、
Rb2、Rd、Re、Rg1 和 Rg2 峰面积的 RSD 分别为
0. 75%、1. 0%、1. 3%、0. 93%、1. 7%、1. 5%、1. 4%、
1. 6%、1. 7%、2. 0%、2. 0%。表明供试品溶液中 11
个成分在 10 h内稳定。
2. 7 重复性试验 取同一人参花样品,分别按照
“2. 1”项下方法平行制备 6 份供试品溶液,分别精
密吸取 20 μL,按照上述色谱条件进样测定。结果
丙二酰基人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc、Rd 及人参皂苷
Rb1、Rc、Rb2、Rd、Re、Rg1和 Rg2峰面积的 RSD 分别
为 2. 5%、1. 8%、2. 6%、2. 2%、0. 91%、1. 2%、
1. 2%、1. 3%、1. 3%、2. 0%、2. 1%。表明供试品重
复性良好。
2. 8 加样回收率试验 精密称取人参单体皂苷对
照品适量,加 80%乙醇水溶液配制成每 1 mL 含丙
二酰基人参皂苷 Rb1 0. 58 mg、Rc 0. 62 mg、Rb2 0. 83
mg、Rd 0. 82 mg 及人参皂苷 Rb1 1. 73 mg、Rc 1. 99
mg、Rb2 1. 36 mg、Rd 5. 06 mg、Rg1 2. 11 mg、Re 9. 78
mg 和 Rg2 0. 95 mg的混合对照品溶液。准确称取已
知含量的批次 1 的干人参花样品粉末 0. 25 g,分别
加入上述混合对照品溶液 1 mL,按“2. 1”项下方法
平行制备 6 份供试溶液,按上述色谱条件进样测定
并计算回收率,结果见表 2。
表 2 11 个人参皂苷回收率考察结果(n =6)
Tab. 2 Results of recovery tests of the 11 kinds of ginsenosides
人参皂苷
(ginsenoside)
样品量
(content)
/mg
加入量
(added)
/mg
测定量
(detected)
/mg
回收率
(recovery)
/%
RSD
/%
丙二酰基人参皂苷(malonyl ginsenoside) Rb1 0. 55 0. 58 1. 14 102. 9 1. 4
Rb2 0. 85 0. 83 1. 69 100. 6 2. 7
Rc 0. 65 0. 62 1. 28 100. 2 2. 7
Rd 0. 80 0. 82 1. 63 101. 0 2. 8
人参皂苷(ginsenoside) Rb1 1. 70 1. 73 3. 45 101. 2 3. 0
Rc 1. 98 1. 99 3. 96 100. 3 2. 0
Rb2 1. 38 1. 36 2. 74 100. 4 1. 9
Rd 5. 08 5. 06 10. 19 101. 1 1. 5
Re 9. 78 9. 78 19. 42 98. 7 1. 4
Rg1 2. 10 2. 11 4. 28 102. 0 2. 7
Rg2 0. 95 0. 95 1. 89 98. 3 2. 3
2. 9 样品测定 按照“2. 1”项下方法制备供试品
溶液,按上述色谱条件分别进样 20 μL,以外标法计
算皂苷含量,结果见表 3。
表 3 人参皂苷的测定结果(%,n =3)
Tab. 3 Determination of ginsenosides in Ginseng Bud
样品
(sample)
批次
(batch)
丙二酰基人参皂苷(malonyl ginsenoside) 人参皂苷(ginsenoside)
Rb1 Rc Rb2 Rd Rb1 Rc Rb2 Rd Rg1 Re Rg2
11 个人参皂苷
(11 kinds of
ginsenosides)
鲜人参花(flesh
Ginseng Bud)
1 0. 64 0. 73 0. 59 1. 17 0. 56 0. 66 0. 58 0. 68 0. 40 3. 77 0. 20 9. 98
2 0. 83 0. 64 0. 77 1. 54 0. 49 0. 74 0. 77 0. 80 0. 50 4. 28 0. 25 11. 61
干人参花(dried
Ginseng Bud)
1 0. 22 0. 26 0. 34 0. 32 0. 68 0. 79 0. 55 2. 03 0. 84 3. 91 0. 38 10. 32
2 0. 28 0. 37 0. 29 0. 53 0. 81 1. 03 0. 76 1. 79 0. 77 4. 11 0. 20 10. 94
3 0. 20 0. 18 0. 21 0. 25 0. 72 0. 96 0. 72 1. 89 0. 64 4. 01 0. 29 10. 07
4 0. 35 0. 30 0. 36 0. 42 0. 63 0. 86 0. 83 2. 32 0. 85 3. 82 0. 42 11. 16
5 0. 25 0. 23 0. 28 0. 41 0. 78 0. 90 0. 64 2. 25 0. 62 4. 21 0. 34 10. 91
3 讨论
3. 1 人参花中皂苷含量的测定 本实验采用 RP-
HPLC法,以乙腈-0. 05 mol·L -1磷酸盐为流动相,
同时测定了人参花中 11 个人参皂苷,结果表明鲜人
参花和人参花干品中 11 个人参皂苷总含量相当,在
鲜人参花和人参花干品中含量的质量分数分别为
10. 80%和 10. 68%。
11 个人参皂苷在各样品中含量均很高,且鲜人
—9951—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015,35(9)
参花和人参花干品中均检测到丙二酰基人参皂苷的
存在,鲜人参花中丙二酰基人参皂苷的平均含量为
3. 46%,占 11 个人参皂苷的 32. 01%;人参花干品
中丙二酰基人参皂苷的平均含量为 1. 21%,占 11
个人参皂苷的 11. 33%。
3. 2 丙二酰基人参皂苷在人参花中的含量变化 丙
二酰基人参皂苷是人参中的原苷,含量很高,水溶性
较强。该类皂苷采用常规的 HPLC 方法难以测定,
本研究采用乙腈-0. 05 mol·L -1磷酸盐为流动相测
定了鲜人参花和人参花干品中 11 个人参皂苷,结果
表明 11 个人参皂苷总含量差异不大,但丙二酰基皂
苷含量差异较大,质量分数分别为 3. 64% 和
1. 21%,这与丙二酰基人参皂苷的热不稳定性相关。
在一定温度下,丙二酰基人参皂苷 Rb1、Rb2、Rc 和
Rd发生水解反应,降解成相应的中性人参皂苷
Rb1、Rb2、Rc 和 Rd;且这种降解随着人参的不同储
存时间、加工和提取方法而发生动态变化[19]。因而
在本研究中鲜人参花中丙二酰基人参皂苷含量明显
高于人参花干品,其原因可能是从鲜人参花到人参
花干品需要经过烘干、储存等过程,丙二酰基人参皂
苷发生了转化。
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(本文于 2015 年 2 月 6 日收到)
—0061— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015,35(9)