全 文 ：2012 年 1 月
第 27 卷第 1 期
中国粮油学报
Journal of the Chinese Cereals and Oils Association
Vol． 27，No． 1
Jan. 2012
黑大豆种皮花色苷对亚硝胺体
内外合成的阻断作用
吴 春 陈林林 李俊生
(哈尔滨商业大学食品工程学院省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)
摘 要 在模拟人体胃液的条件下，通过测定 N －二甲基亚硝胺(NDMA)的阻断率、NO －2 的形成量和清
除率，研究了黑大豆种皮花色苷(BSCA)体外对亚硝化反应的抑制活性;以血清谷丙转氨酶为测定指标，通过
动物试验考察了 BSCA体内对亚硝胺合成的阻断作用。结果表明，BSCA 能明显阻断亚硝胺的化学合成，其最
大阻断率为 85． 9%，对亚硝酸钠具有较好的清除活性，最大清除率为 70． 4%;其对硝酸盐还原酶还原 NO －3 为
NO －2 的抑制率可达 53． 7%。体内阻断亚硝胺合成的实验中，BSCA 组血清谷丙转氨酶显著低于对照组(P ＜
0． 01)。BSCA对亚硝胺的体内外合成均具有较强的阻断作用。
关键词 黑大豆种皮 花色苷 亚硝胺 阻断作用 体内外
中图分类号:TS202． 3 文献标识码:A 文章编号:1003 － 0174(2012)01 － 0025 － 04
基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究重点项目(12511z010)
收稿日期:2011 － 04 － 07
作者简介:吴春，女，1962 年出生，教授，食品化学
N －亚硝胺(NDMA)是一类强致癌物，它能引起
人和动物胃、肝脏等多种脏器的恶性肿瘤。正常情
况下人们直接从食物中摄入亚硝胺的量微乎其微，
但形成 NDMA类的前体物质硝酸盐或亚硝酸盐却广
泛存在于食物及产生于食物在体内的代谢过程中，
特别是亚硝酸盐在胃液中更易合成 NDMA［1 － 3］。因
此，阻断 NDMA合成和清除其前体亚硝酸盐是防癌
抗癌的有效途径。
黑大豆是传统的药食兼用的农产品资源，其种皮
富含花色苷类化合物，是天然色素的重要来源。目前
对黑大豆种皮花色苷(black soybean coat anthoc － ya-
nin，BSCA)的研究多集中在化学结构、稳定性、抗氧
化、清除自由基等方面［4 － 8］，而对亚硝化反应的抑制
活性方面的研究却鲜有报道。本试验以黑大豆为原
料提取花色苷，研究其体内外清除亚硝酸钠及对亚
硝胺合成的阻断作用，为寻找安全有效且具有较高
食用和药用价值的亚硝化反应抑制剂提供参考。
1 材料与方法
1． 1 原料与试剂
黑大豆种皮:市售黑龙江省绥化市产黑大豆，手
工剥取种皮，干燥后粉碎过 60 目筛，备用。
昆明种小鼠:由黑龙江省肿瘤研究所实验动物
中心。
氨基比林:锦州九州药业;谷丙转氨酶试剂盒:
南京建成生物工程研究所;硝酸盐还原酶提取液:实
验室自制;醋酸锌、无水乙醇等试剂均为分析纯。
1． 2 主要仪器
721 紫外可见分光光度计:上海光谱仪器有限公
司;XT220A电子天平:瑞士普利塞斯;W202B 升降恒
温水浴锅:上海申胜生物技术有限公司;PHS － 25 型
酸度计:上海伟业仪器厂;UV － VI 紫外透射分析仪:
北京智源通生物技术研究所。
1． 3 试验方法
1． 3． 1 黑大豆种皮花色苷的制备
取一定量黑大豆皮，按料液比为 1∶ 30(g /mL)加
入 60% (体积分数)的乙醇溶液混合均匀，用
0． 5 mol /L HCl将溶液 pH 调至 3，在 70 ℃浸提 1 h，
过滤，收集滤液;将滤渣按同样的条件重复浸提 2 次
过滤，合并 3 次滤液于 50 ℃下减压浓缩得到棕红色
黏稠的粗提液。粗提液用 AB － 8 大孔树脂分离纯
化，上样 pH 值为 1，上样量与树脂的体积比为 8 ∶ 1，
按 1 mL /min的流速上柱，静置 50 min 后，采用 70%
的乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱液量与树脂体积比为
8∶1。洗脱物经真空冷冻干燥成粉，试验前用双蒸水
配成所需浓度。
1． 3． 2 体外阻断 NDMA合成的浓度梯度试验
在模拟人体胃液的条件下，二甲胺与亚硝酸钠
在 37 ℃条件下，可适宜地生成二甲基亚硝胺，当往
中国粮油学报 2012 年第 1 期
BSCA中依次加入二甲胺与亚硝酸钠时，BSCA 优先
同亚硝酸钠作用，使得二甲胺不能与亚硝酸钠反应，
达到阻止亚硝胺生成的目的。据此可以比较相同条
件下生成亚硝胺量的多少来反映 BSCA 阻断能力的
强弱，生成亚硝胺量少，阻断能力就强，反之则弱。
在紫外光照射下，二甲基亚硝胺可分解成二甲
基仲胺和亚硝酸根，亚硝酸根与对氨基苯磺酸重氮
化后，再与 α －萘胺偶合生成红色化合物。用分光光
度计测出该化合物的吸光度值可计算上述反应液中
亚硝胺含量的多少。
精确称取 BSCA 0． 1 g 用少量蒸馏水溶解，定容
至 100 mL，质量浓度为 0． 001 g /mL，作为测试液。
准确吸取 BSCA 测试液各 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、
2． 5、3、3． 5、4． 0 mL于 25 mL比色管中，分别加入 pH
3． 0 的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液 5 mL，1 mmol /L
NaNO2 溶液 0． 5 mL，再加入 1 mmol /L 二甲胺
0． 5 mL，用蒸馏水定容至刻度，在 37 ℃下恒温 1 h。
用移液管吸取 1． 0 mL 上述反应液到 70 mm 的培养
皿中，加入 0． 5%的 Na2CO3 溶液 0． 5 mL，于黑布遮
盖的紫外分析仪上照射 15 min，取出后加入 1%的对
氨基苯磺酸和 0． 1%的 a －萘胺溶液各 1． 5 mL，加水
至溶液精确体积为 5． 0 mL，然后摇匀放置 15 min
后，用分光光度计在 525 nm 处测吸光度值(Ax) ，同
时做空白试验(A0) ，计算阻断率。
阻断率 =(A0 － Ax)/A0 × 100%
1． 3． 3 体外清除 NaNO2 的浓度梯度实验
亚硝酸盐在弱酸性的条件下，能与对氨基苯磺
酸重氮化后，再与盐酸萘乙二胺偶合生成红色的化
合物。准确吸取 BSCA 测试液各 0． 5、1． 0、1． 5、2． 0、
2． 5、3、3． 5、4． 0 mL 于 25 mL 比色管中，分别加入
5 mg /L的 NaNO2 标准液 2． 0 mL，pH 3． 0 的柠檬酸
一磷酸氢二钠缓冲液 5 mL，用蒸馏水定容至刻度，在
37 ℃下恒温 1 h。用移液管吸取 1． 0 mL反应溶液到
70 mm 的培养皿中，加入 0． 4% 对氨基苯磺酸
2． 0 mL，摇匀静置 5 min，再加入 0． 2%盐酸萘乙二胺
1． 0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀静置 15 min。在
确定的最大吸收波长 λmax = 540 nm 处测定吸光度
(Ax) ，同时做空白试验(A0) ，计算清除率。
清除率 =(A0 － Ax)/A0 × 100%
1． 3． 4 抑制硝酸盐还原酶还原 NO －3 为 NO
－
2 试验
取 0． 001 g /mL BSCA 测试液 0、0． 5、1． 0、1． 5、
2． 0、2． 5、3、3． 5、4． 0 mL 和 1． 0 mol /L 的硝酸钠
1． 0 mL分别加入 25 mL 比色管中，用蒸馏水补充至
9． 0 mL，再加入 1． 0 mL硝酸盐还原酶提取液后放入
37 ℃水浴锅中反应 30 min，取出立即加入 0． 8%对氨
基苯磺酸 1． 0 mL，0． 5% α －萘胺 1． 0 mL，室温下反
应 15 min 后比色，测定吸光度，按绘制的 NaNO2 标
准曲线(c = 8． 251 8 A － 1． 347 7，R = 0． 995。式中:c
为亚硝酸钠溶液的浓度 /μg /mL;A 为吸光度值;R 为
相关系数)计算 NO －2 的形成量，并以此来计算其抑
制率。
抑制率 IR =(N空 － N样)/N空
式中:N空、N样分别为未加入 BSCA 和加入 BSCA
的 NO －2 的形成量。
1． 3． 5 体内阻断亚硝胺合成试验
健康 68 周龄小鼠，体重 18 ～ 22 g，雌雄各半，适
应环境喂养一周后按体重随机分成正常组，对照组，
BSCA高、中、低剂量组，每组 10 只。对照组灌胃亚
硝酸钠和氨基比林混合液 10 mL /(kg·d) (10 mL内
含 27． 3 mg 亚硝酸钠和 81． 9 mg 氨基比林) ，BSCA
高、中、低剂量组灌胃亚硝酸钠和氨基比林和不同量
的 BSCA的混合液 10 mL /(kg·d) ，正常组灌胃同体
积0． 9%生理盐水，每天灌胃一次，共 5 d，第 6 天摘取
眼球取血，2 500 r /min离心 20 min分离制备血清，用
赖氏法在 505 nm下测定血清中谷丙转氨酶的含量。
2 结果分析
2． 1 黑豆皮花色苷的提取及纯化后得率
由 20 g黑豆皮粉末按 1． 3． 1 方法对黑豆皮中花
色苷进行提取及纯化，经真空旋转浓缩，真空干燥后
分别得酒红色粉末，测定粉末质量，计算出提取及纯
化后黑豆皮花色苷的得率见表 1。
表 1 黑豆皮花色苷得率
提取后 纯化后
得率 /% 7． 125 3． 017
2． 2 体外对 NDMA合成的阻断作用
BSCA体外对NDMA合成的阻断作用结果见图1。
图 1 BSCA对 NDMA合成的阻断作用
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第 27 卷第 1 期 吴 春等 黑大豆种皮花色苷对亚硝胺体内外合成的阻断作用
由图 1 可以看出，BSCA对 NDMA合成具有明显
的阻断作用，随着样液浓度的增加，BSCA 对 NDMA
合成的阻断率出现明显的梯度变化，当加样量在
0． 5 ～ 2． 5 mL时，阻断率由 44． 2%上升至 74． 6%，随
着加样量的增加其作用增强，当加入量达到 3 mL
后，阻断能力基本不变。说明 BSCA可有效地阻断亚
硝胺的合成。最大阻断率可达 85． 9%，出现在加样
量为 4 mL处。
2． 3 体外对亚硝酸钠的清除作用
BSCA体外对 NaNO2 的清除作用结果见图 2。
图 2 BSCA对 NaNO2 的清除作用
由图 2 可以看出，BSCA对 NaNO2 的清除作用效
果与其浓度成正相关关系。随 BSCA取样量的增加，
其对亚硝酸钠的清除率逐渐增加，当加样量达到
2． 5 mL后，再继续增加 BSCA，清除率变化很小。这
时清除率最大可达 70． 4%，说明 BSCA 可有效地清
除亚硝酸钠。
2． 4 抑制硝酸盐还原酶还原 NO －3 为 NO
－
2 试验
食物中硝酸盐在人体内经存在于胃液内的多种
硝酸盐还原菌(含有硝酸盐还原酶)作用转变成亚硝
酸盐，从而成为在体内形成亚硝胺的前体物质。试
验结果表明 BSCA具有抑制硝酸盐还原酶还原 NO －3
为 NO －2 的作用，结果见图 3。
由图 3可以看出，在 BSCA添加量在0． 5 ～3． 5 mL
图 3 BSCA对硝酸盐还原酶还原 NO －3 为 NO －2 的抑制作用
范围内时，随着 BSCA 加入量的增大，对硝酸盐还原
酶还原 NO －3 为 NO
－
2 的抑制率逐渐增大。随后增大
加入量抑制率不再改变，其最大抑制率为53． 7%。
2． 5 体内对 NDMA合成的阻断作用
以血清谷丙转氨酶为指标测定，考察 BSCA体内
阻断 NDMA合成的作用效果，结果见表 2。
由表 2 数据可知，给药组血清谷丙转氨酶较对
照组明显降低，其中高剂量组血清谷丙转氨酶接近
正常组，且 BSCA的浓度与血清谷丙转氨酶的量存在
剂量效应关系。
表 2 黑大豆种皮花色苷体内阻断 N －二甲基亚硝胺合成
的效果(x ± s，n = 10)
组别 小鼠数量
NaNO2 /
mg /(kg·d)
氨基比林 /
mg /(kg·d)
黑大豆种皮
花色苷 /
mg /(kg·d)
高剂量组 10 27． 3 81． 9 80
中剂量组 10 27． 3 81． 9 40
低剂量组 10 27． 3 81． 9 10
对照组 10 27． 3 81． 9
正常组 10 － －
组别
谷丙转氨酶
karmenU 与正常组相比 与对照组相比
高剂量组 39． 454 0 ± 3． 143 7 ＊＊ ##
中剂量组 54． 126 3 ± 2． 178 0 ＊＊ ##
低剂量组 76． 973 2 ± 4． 102 3 ＊＊ ##
对照组 120． 179 0 ± 3． 3108 0 ＊＊
正常组 34． 897 5 ± 1． 032 7 ##
注:＊＊P ＜ 0． 01，与正常组对照;##P ＜ 0． 01，与对照组对照
3 讨论与结论
通过对 BSCA体内外抑制亚硝化反应的活性研
究，表明 BSCA 能清除亚硝酸钠、阻断亚硝胺的合成
和明显降低血清谷丙转氨酶含量。由于在体内酸性
环境中，亚硝酸盐与仲胺合成亚硝胺，亚硝胺通过血
液循环进入肝细胞中，破坏肝细胞，致使肝组织中的
谷丙转氨酶进入血液中。而 BSCA 正是通过清除亚
硝酸盐来阻断亚硝胺的合成，从而起到保护肝组织
免受亚硝胺的侵害，降低血清谷丙转氨酶的作用。
黑大豆资源丰富，研究其在防癌方面的作用具有较
好的开发应用前景。
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Inhibition of Nitrosamine Synthesis by Black Soybean Coat
Anthocyanin in Vivo and Vitro
Wu Chun Chen Linlin Li Junsheng
(Key Laboratory of Food Science and Engineering，College of Food Engineering，
Harbin University of Commerce，Harbin 150076)
Abstract The activity of black soybean coat anthocyanins (BSCA)on inhibiting nitrosation was studied by
measuring the blocking rate on synthesis of N － nitrosodimethylamine ，formation rate and clearance rate of NO2 and
providing simulated test human gastric juice conditions． The in vivo activity of blocking synthesis of nitrosamine was
investigated by taking animal experiment，and taking serum GPT as a test index． The results showed that BSCA had
obvious capability of blocking chemical nitrosamine synthesis． The maximum blocking rate of NDMA was 85． 9%，the
activity of scavenging sodium nitrite was relatively good． The maximum eliminating rate of nitrite sodium was 70． 4% ．
BSCA can prohibit 53． 7% of the reducing of nitrate reductase (from NO3
－ to NO2
－)． During the process of bloc-
king synthesis of nitrosamine，the serum GPT in BSCA group was significantly lower than that in control group (P ＜
0． 01)． BSCA has strong inhibiting effect on blocking nitrosamine synthesis in vivo and vitro．
Key words black soybean coat，anthocyanin，nitrosamine，inhibition，vivo and vitro
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