全 文 ：分析与检测
2013年第 39卷第 3期(总第 303期) 183
HPLC法测定浆水中有机酸的含量*
张培1，李昕1，刘芸2，刘晔玮1，骆姗1，邸多隆2，唐运昌1
1(兰州大学 公共卫生学院 营养与食品卫生研究所，甘肃 兰州，730000)
2(中国科学院兰州化学物理研究所 中科院西北特色植物资源化学重点实验室和甘肃省天然药物重点实验室，甘肃 兰州，730000)
摘 要 建立了高效液相色谱法测定浆水中 4 种有机酸含量的方法。色谱柱:Agilent ZORBAX SB-AQ 柱(250
mm ×4. 6 mm，5 μm) ;流动相:甲醇∶ 0. 01 mol /L KH2PO4 溶液(0. 5∶ 99. 5，pH = 2. 0) ;流速:0. 6 mL /min;柱温:30
℃;进样量:20 μL;DAD检测器;检测波长:210 nm。在优选的色谱条件下，所测的酒石酸、乳酸、乙酸、富马酸得
到较好的分离。日内精密度为 0. 6% ～ 1. 8%，日间精密度为 1. 7% ～ 4. 2%，回收率为 81. 0% ～ 116. 0%。
关键词 浆水，HPLC法，有机酸
第一作者:硕士研究生(通讯作者:刘晔玮副教授 E-mail:liuyw
@ lzu. edu. cn;邸多隆研究员 E-mail:didl@ licp. cas. cn)。
* 兰州市科技发展计划项目(2010 － 1 － 164) ;中国科学院“百人
计划”项目;国家自然科学基金项目(No. 20974116)
收稿日期:2013 － 01 － 18，改回日期:2013 － 02 － 07
浆水是我国西北地区极具特色的发酵食品，一般
是将原料(芹菜或苦苦菜等)先焯水后，再放入热水
中，用老浆水为引子，再加入面汤直至发酵成熟，汤汁
略呈乳白色，口味酸醇清香，多在夏季酿制。浆水具
有减肥、开胃、健身等功效［1 － 2］。
目前国内对于浆水的研究主要是浆水中微生物
的分离鉴定［3 － 5］，而对其中营养物质的研究较少。浆
水富含有机酸，其有机酸的含量和种类维持浆水的酸
碱平衡，影响浆水的口感及生物稳定性。适量的有机
酸能促进食欲，帮助消化，利于人体健康［6 － 7］。
高效液相色谱法分析有机酸简单快速，可同时
测定多种有机酸［8 － 9］，近年来不断有文献报道利用高
效液相色谱法测定发酵食品中有机酸的方法［10 － 12］。
本试验采用 HPLC 法，通过优化分析条件，建立了浆
水中有机酸含量的分析方法。
1 材料与方法
1. 1 样品
兰州市售浆水。
1. 2 主要试剂
甲醇(色谱纯) ，山东禹王集团;KH2PO4(AR) ，
西陇化工厂;超纯水，实验室自制;H3PO4(AR) ，天津
欧博凯化工;酒石酸(AR) ，上海圣宇化工;乙酸
(AR) ，烟台双双化工;乳酸(AR) ，天津光复精细化
工;富马酸(AR) ，郑州盛源化工。
1. 3 仪器及设备
Agilent 1200高效液相色谱仪系统(包括 G1311A
四元梯度泵、G1315B DAD 二极管阵列检测器、手动进
样器和 Agilent Chemstation 工作站) ;Agilent ZORBAX
SB-AQ 色谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，大连依利特
C18色谱柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ;高速离心机，上
海安亭科学仪器;高压抽滤机，奥特赛恩斯公司。
1. 4 实验方法
1. 4. 1 标准品溶液和样品溶液的制备
分别精密称取一定量酒石酸、乳酸、乙酸、富马
酸，用双蒸水配制成标准溶液;精密量取一定量各标
准溶液混合定容后，得到有机酸标准工作溶液，浓度
分别为酒石酸 0. 4 mg /mL，乳酸 6 mg /mL，乙酸 1 mg /
mL，富马酸 1 × 10 －3 mg /mL。
取适量浆水在 8 000 r /min 下离心 10 min，取上
清液备用。进样前溶液用 0. 45 μm微孔滤膜过滤。
1. 4. 2 色谱条件
色谱柱:Agilent ZORBAX SB-AQ 柱(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ;检测波长:210 nm;流动相:甲醇 ∶
0. 01 mol /L KH2PO4 溶液(体积比 0. 5 ∶ 99. 5，KH2PO4
溶液 pH =2. 0) ;流速:0. 6 mL /min;柱温:30 ℃;进样
量:20 μL。在优选的色谱条件下，将 1. 4. 1 项下制备
的标准品溶液和样品溶液分别进样分析(见图 1)。
2 结果与讨论
2. 1 色谱条件的优化
2. 1. 1 检测波长的选择
在 200 ～ 600 nm 对各有机酸标准品的光谱吸收
进行扫描，结果显示，λ = 210 nm时，各有机酸都有较
大吸收峰，所以选择 210 nm为检测波长。
DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2013.03.007
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
184 2013 Vol. 39 No. 3 (Tota l 303)
1-酒石酸，2-乳酸，3-乙酸，4-富马酸
图 1 标准品和样品的 HPLC色谱图
Fig. 1 The chromatogram of standard substance and sample
2. 1. 2 色谱柱的选择
选用 Agilent ZORBAX SB-AQ色谱柱(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm)和大连依利特 C18色谱柱(250 mm ×
4. 6 mm，5 μm) ，对样品在 2 种色谱柱上的不同色谱
行为进行了比较。结果显示，采用 C18色谱柱，在不同
比例甲醇- KH2PO4 溶液、不同 pH 值不同浓度的
KH2PO4 溶液作为流动相时样品中各有机酸均很难
完全分离(见图 2)。而采用 AgilentZORBAX SB-AQ
色谱柱，在一定的条件下样品中各有机酸分离结果较
好(见图 1B) ，故选用 AgilentZORBAX SB-AQ柱。
2. 1. 3 缓冲溶液浓度的选择
精密称取一定量的 KH2PO4，分别配制成浓度为
0. 005 mol /L，0. 01 mol /L，0. 02 mol /L的缓冲溶液，考
察缓冲液浓度对样品中各有机酸分离效果的影响。
结果表明，当 KH2PO4 溶液浓度为 0. 01 mol /L 时，各
有机酸分离效果较好(见图 1B、图 3)。
1-酒石酸，2-乳酸，3-乙酸，4-富马酸
图 2 C18色谱柱样品色谱图
Fig. 2 The sample chromatogram of C18 column
1-酒石酸，2-乳酸，3-乙酸，4-富马酸
图 3 浓度为 0. 005 mol /L，0. 02 mol /L的 KH2PO4 缓冲溶液色谱图
Fig. 3 The chromatogram of KH2PO4 buffer solution concentration at 0. 005 mol /L and 0. 02 mol /L
2. 1. 4 pH值的选择
以 0. 01 mol /L KH2PO4 溶液作流动相，用 H3PO4
调节流动相 pH 值分别为 4. 0、3. 0 和 2. 0，考察流动
相 pH值对样品中有机酸分离的影响。结果表明，当
pH =2 时，各有机酸分离效果较好(见图 1B、图 4)。
2. 2 方法学验证
2. 2. 1 线性方程、线性范围和检出限
配制一系列不同浓度的有机酸标准品溶液，按
1. 4. 2 色谱条件分析，以被检测物的峰面积为纵坐标
(Y) ，标准品溶液浓度为横坐标(X)进行线性回归;
检出限以信噪比(S /N)大于 3 时的检测浓度计算。4
种有机酸的线性方程、相关系数(R2)和检出限见表
分析与检测
2013年第 39卷第 3期(总第 303期) 185
1。从表 1 可以看出，在酒石酸、乳酸、乙酸、富马酸的
浓度分别为 0. 003 ～ 0. 1 mg /mL，0. 48 ～ 24 mg /mL，
0. 02 ～ 0. 9 mg /mL，0. 001 ～ 0. 07 mg /mL范围内，4 种
有机酸呈现良好的线性关系。
图 4 pH = 3 和 pH = 4 样品的色谱图
Fig. 4 The chromatogram of sample at pH = 3 and pH = 4
表 1 4 种有机酸的回归方程、相关系数、
线性范围与检出限(n =3)
Table 1 The linear equation，related coefficient，range of
linearity and detection limit of the four organic acids(n =3)
名称 回归方程 相关系数
线性范围/
(mg·mL－1)
检出限/
(mg·mL－1)
酒石酸 y = 3 780x － 0. 421 8 0. 998 8 0. 003 ～ 0. 1 0. 001
乳酸 y = 988. 97x + 20. 166 0. 997 8 0. 48 ～ 24 0. 008
乙酸 y = 1 528. 9x + 1. 032 7 0. 999 8 0. 02 ～ 0. 9 0. 002
富马酸 y = 263 107x － 374. 92 0. 995 0 0. 001 ～ 0. 07 0. 000 01
2. 2. 2 方法精密度考察
按 1. 4. 1 条件处理样品后，按 1. 4. 2 色谱条件连
续测定 5 次，考察日内精密度;连续进样 3 d，考察日
间精密度。结果见表 2。从表 2 可以看出，4 种有机
酸的日内精密度的 RSD%小于 2%，日间精密度的
RSD%小于 5%，由此表明该液相色谱检测方法精密
度良好。
表 2 4 种有机酸的精密度考察
Table 2 The relative standard deviations investigation
of the four organic acids
有机酸
RSD /%
日内精密度(n = 5) 日间精密度 (n = 3)
酒石酸 1. 8 2. 0
乳 酸 0. 8 3. 0
乙 酸 0. 6 1. 7
富马酸 1. 3 4. 2
2. 2. 3 回收率考察
精确量取样品适量，在其中精确加入标准品混合
溶液，按 1. 4. 2 色谱条件进样分析，回收率结果见表
3。回收率实验的结果显示该样品方法可以满足分析
的要求。
表 3 回收率考察(n =5)
Table 3 The investigation of the recoveries(n =5)
有机酸
样品中
有机酸含量 /
(mg·mL －1)
有机酸
加入量 /
(mg·mL －1)
实测值 /
(mg·mL －1)
平均回收
率 /%
酒石酸 0. 048 2 0. 073 2 0. 123 1 102. 3
乳酸 4. 912 5 7. 300 0 10. 848 5 81. 0
乙酸 0. 275 0 0. 412 5 0. 754 1 116. 0
富马酸 0. 001 7 0. 000 8 0. 002 5 84. 2
2. 3 样品测定
精确量取样品适量，按 1. 4. 1 条件处理样品后，
按 1. 4. 2 色谱条件测定样品中 4 种有机酸含量，结果
分别为:酒石酸 0. 048 2 mg /mL;乳酸 4. 912 5 mg /
mL;乙酸 0. 275 0 mg /mL;富马酸 0. 001 7 mg /mL(见
表 3) ，表明浆水中有机酸以乳酸含量明显高于其他 3
种有机酸的含量为特征。
3 讨论
(1)建立了浆水中酒石酸、乳酸、乙酸、富马酸含
量的 HPLC测定方法。结果表明，该方法简单、快速、
可靠。
(2)本试验曾使用依利特 C18柱分离浆水中的有
机酸，发现只有当甲醇 ∶ 0. 01 mol /L KH2PO4(v ∶ v =
0. 5∶ 99. 5)时各有机酸分离效果较好，但是流动相中
水的比例大于 80%时，会影响 C18色谱柱的使用寿
命。有文献报道［13］，C18色谱柱不适用于分离多种有
机酸。ZORBAX SB-AQ柱通过对传统的 C18柱改性，
具有亲水性的表面，用于浆水中有机酸含量的测定得
到了理想的结果。
(3)许多缓冲溶液在 210 nm 处都有吸收，而磷
酸缓冲液在 210 nm处几乎无吸收，可作为有机酸测
定的流动相，故本试验选择 KH2PO4 作为缓冲液。缓
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTATION INDUSTRIES
186 2013 Vol. 39 No. 3 (Tota l 303)
冲溶液浓度越高，酸的存在形式越稳定，但当缓冲
溶液的浓度过高时，离子强度增大，对组分分离不
利，同时影响色谱柱的寿命，增加了流动相的本底
吸收，降低了测定的灵敏度［14］。本试验分别选择缓
冲液浓度为 0. 005 mol /L，0. 01 mol /L，0. 02 mol /L 考
察对样品分离效果的影响，当缓冲液浓度为 0. 005
mol /L时，乳酸出现前展现象，当缓冲液浓度为 0. 02
mol /L时，各有机酸分离效果和浓度为 0. 01 mol /L时
相似，但高浓度磷酸盐会影响色谱柱寿命，最终确定
KH2PO4 浓度为 0. 01 mol /L。
(4)通过调节流动相的 pH值可抑制解离增加保
留［15］。本试验用 H3PO4 调节流动相 pH 值分别为
4. 0、3. 0 和 2. 0，当 pH = 3 时乳酸出现前展现象且未
达到基线分离，pH =4 时乳酸的峰和前一个未知酸峰
未完全分离，出现遮掩现象，当 pH = 2 各有机酸的分
离效果较好。
参 考 文 献
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Determination of organic acids in Jiangshui by high
performance liquid chromatography
Zhang Pei1，Li Xin1，Liu Yun2，Liu Ye-wei1，Luo Shan1，Di Duo-long2，Tang Yun － chang1
1(Institute of Nutrition and Food Hygiene，of Public Health，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China)
2(Key Laboratory of Chemistry of Northwestern Plant Resources and Key Laboratory for Natural Medicine of
Gansu Province，Lanzhou Institute of Chemical Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 73000，China)
ABSTRACT A HPLC method for rapid determination of four organic acids in Jiangshui was developed in this pa-
per． Agilent ZORBAX SB-AQ column(250 mm ×4. 6 mm，5μm)was used at 30℃ ． The mobile phase was CH3OH
∶ 0. 01 mol /L KH2PO4(0. 5∶ 99. 5，pH =2. 0)． The flow rate was 0. 6 mL /min and the detection wavelength was set at
210 nm． The injection volumes were 20 μL for each run． Based on the above optimizing chromatogram conditions，
four organic acids，including tartaric acid，lactic acid，acetic acid and fumaric acid，were separated satisfactorily．
The intra-day and inter-day precision (RSD%)for the analytes ranged from 0. 6% to 1. 8% and from 1. 7% to
4. 2%，respectively． The average recovery factors were from 81. 0% to 116. 0% ． The results showed that developed
method was successfully applied for the detection and isolation of four organic acids in Jiangshui．
Key words Jiangshui，HPLC，organic acid