全 文 ：收稿日期:2010-04-04;　修订日期:2010-06-20
基金项目:“产学研结合培养高素质复合型中药人才模式创新研究与实
践 ”课题资助(No.〔2007〕29)
作者简介:左爱仁(1976-),男(汉族),江西南昌人 ,现任江西中医学院基
础医学院讲师 ,硕士学位 ,主要从事中药药理研究工作.
东方肉穗草异鼠李素诱导 HepG2细胞凋亡研究
左爱仁 1 ,汪满红2 ,万春鹏 1 ,周寿然 1 ,王晓崴3 ,邱　彦 4
(1.江西中医学院基础医学院 ,江西 南昌　330006;2.江西省残疾人联合会 ,江西 南昌　330010;　
3.江西中医学院药学院 2007级中药科研实践班 ,江西 南昌　330006;　4.厦门大学医学院 ,福建厦门　361005)
摘要:目的 研究东方肉穗草中的主要抗癌活性成分之一异鼠李素诱导 HepG2细胞凋亡的机理。方法 采用 MTT法检
测异鼠李素对肝癌 HepG2细胞的抑制作用 , DAPI染色法对细胞凋亡进行形态学检测。结果 实验结果显示异鼠李素对
肝癌 HepG2细胞的增殖有明显抑制作用 ,呈浓度依赖性效应。异鼠李素处理 48h的 IC50为 60μmol/L。荧光显微形态学
检测显示异鼠李素处理 HepG2细胞后出现细胞凋亡的特征性变化。结论 研究表明东方肉穗草异鼠李素可以诱导肝癌
HepG2细胞凋亡。
关键词:东方肉穗草;　异鼠李素;　HepG2细胞;　细胞凋亡
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2011.02.075
中图分类号:R285.5　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2011)02-0427-02
　　东方肉穗草 Sarcopyramisbodinierivar.delicata属野牡丹科
(Melastomata-ceae)肉穗草属植物 , 主要分布在江西 、福建 、台湾
等地。东方肉穗草全草可药用 , 归肝 、脾 、胃经 , 具有清热解毒 、
清肝泻火之效 , 是治疗急性肝炎 、肺热咳嗽 、蛇头疔 、无名肿毒 、胃
肠炎等疾病的珍稀名贵中药 [ 1] , 在闽南地区民间应用极广。由
于近几年来肉穗草组织培养 [ 2]与扩繁技术及东方肉穗草林下栽
培技术 [ 3]的研究成功 , 使得东方肉穗草的大面积栽培成为可能 ,
从而解决了野生东方肉穗草资源稀少的问题。
东方肉穗草主要活性成分包括异鼠李素①、槲皮素②、异鼠
李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷③、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷④、异
鼠李素-3-O-(6″-乙酰基)-β -D-吡喃葡萄糖苷⑤、异鼠李素-3-O-
(2″-乙酰基)-β -D-吡喃葡萄糖苷⑥、槲皮素-3-O-(6″-乙酰基)-β-
D-吡喃葡萄糖苷⑦、槲皮素-3-O-(6″-反式-对香豆酰基)-β-D-吡
喃葡萄糖苷⑧等 [ 4 , 5] 。
异鼠李素化学名为 3, 4, 5, 7-四羟基 -3-甲氧基黄酮 ,又
名槲皮素 -3-甲醚 ,分子式为 C
16
H
12
O
7
;槲皮素化学名为 3, 3, 4
, 5, 7-五羟基黄酮 ,又名栎精 、槲皮黄素 , 分子式为 C15H10O7。至
今许多实验已证实 , 异鼠李素和槲皮素具有非常广泛的生理和药
理活性 , 如扩张冠状血管 、降低血脂 、抗血小板聚集 、保护心 、肝肾
等脏器损伤 、清除氧自由基 ,抗氧化等。近些年来 ,异鼠李素和槲
皮素对肿瘤的化学预防作用和治疗作用日益受到人们的重视 ,它
们都能显著地抑制人乳腺癌 、胃癌 、肺癌 、前列腺癌 、白血病 、宫颈
癌等多种癌细胞的生长 [ 6 ～ 12] 。作为两种有应用潜力的抗癌物
质 , 有关异鼠李素和槲皮素抗癌作用的分子机理也已进行较广泛
的研究 ,既有理论意义又有临床实用价值。因此 ,我们从抑制肿
瘤细胞增殖 , 诱导凋亡方面对异鼠李素抗 HepG2肝癌细胞作用
进行了研究。
1　材料与仪器
小牛血清 、PRMI1640液(含氨苄青霉素 , 链霉素各 100 μg/
ml)、MTT、 DAPI、伊文斯蓝均购买于 kayon公司;胰酶 ,上海蓝季
公司。二甲基亚砜 , 汕头西陇化工厂。人肝癌细胞株 HepG2 ,厦
门大学医学院邱彦博士惠赠。东方肉穗草由福建永春林业局提
供 , 经该局高级工程师邹秀红鉴定 , 原植物为 Sarcopyramisbodi-
nierivar.delicata。
CO2培养箱 ,美国 Thermo公司;血球计数板 , 上海医用光学
仪器厂;离心管 , 比利时 OrangeScientific公司;细胞培养瓶及 96
孔培养板 , 比利时 OrangeScientific公司;微量移液器 , 美国 Ep-
pendorf公司;一次性注射器 , 上海金塔医用器材有限公司;高速
离心机 ,美国 Eppendorf公司;酶标仪 , 美国 Thermo公司;电子天
平 , 梅特勒-托利多仪器上海有限公司;超净工作台 , 苏州安泰空
气技术有限公司;倒置显微镜 , 日本 OlympusLeica显微镜。
2　方法
2.1　异鼠李素提取与分离方法 称取干燥的东方肉穗草全草
(SB)10 kg, 粉碎后以 70%乙醇室温浸提 3次(每次 7 d),合并滤
液减压浓缩 ,得总浸膏 1.81 kg。取浸膏 1.8 kg悬浮于 15 L蒸馏
水中 , 依次用石油醚 、氯仿 、醋酸乙酯 、正丁醇分别萃取 3次 ,回收
溶剂后得石油醚部分(SBA)55 g,氯仿部分(SBB)60 g, 醋酸乙酯
部分(SBC)160g及正丁醇部分(SBD)280g。将 155gSBC用 2 L
蒸馏水溶解 ,过滤 , 滤渣蒸干后称重为 57 g, 滤液(98 g)经 D101
大孔树脂柱 ,以不同含量的乙醇进行梯度洗脱 , 得到 5个部分 , 分
别为水洗脱部分(SBC-A)18.65 g, 30%乙醇洗脱部分(SBC-B)
44.4 g, 50%乙醇洗脱部分(SBC-C)13.76 g, 70%乙醇洗脱部分
(SBC-D)2.9 g,乙醇洗脱部分(SBC-E)2.4 g。
70%乙醇洗脱部分(2.9 g)经反复 SephadexLH-20柱色谱进
一步分离纯化 ,甲醇洗脱 , 得到 3种化合物 ,经结构鉴定 [ 4] , 分别
为异鼠李素 (isorhamnetin) 、槲皮素 (quercetin)和 山萘酚
(kaempferol)。
2.2　肝癌细胞 HepG2的复苏 、传代培养和冻存 细胞复苏:将液
氮冻存细胞迅速投入 37℃水浴 , 不断晃动 , 使其快速融化。 然
后 , 将细胞悬液移入已含有 5 ml细胞培养液的离心管中 , 离心
1 000 r· min-1 ×10min洗涤细胞。加 5 ml新鲜的 RPMI1640完
全培养基重悬细胞并移入细胞培养皿 ,于 5%CO2的 37℃的孵箱
中静置培养 ,每天更换一次培养液。
细胞传代培养:待细胞基本长满培养皿底部时 , 弃去培养液 ,
加 PBS洗两遍。然后加过滤除菌的 0.25%胰蛋白酶 1ml消化细
胞(1 ～ 3 min), 待大部分细胞贴壁变松 , 但还未脱落时 , 终止消
化 , 弃去胰酶。加新鲜含血清 10%的 RPMI1640完全培养基 20
ml, 用弯头吸管反复吹打细胞至细胞完全悬浮 , 分装成 4个培养
瓶 , 实现细胞传代和扩大培养。
细胞冻存:扩培悬浮细胞经过离心 , 吸取上清液后 ,再加新鲜
培养基 3.6 ml,再加无菌的 DMSO液 0.4ml, 分装成两个 2 ml的
冻存管 。依次在 4℃, -20℃冻存 1 h,然后 -80℃长期保存 。
2.3　MTT法测定异鼠李素对肝癌细胞 HepG2生长的影响 实验
原理:MTT法是抗肿瘤药物体外筛选中常用的一种方法 , MTT法
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2011VOL.22NO.2 时珍国医国药 2011年第 22卷第 2期
(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)是 Mosmnna1983年报道
的 , 以后此方法得到迅速发展并在临床上得以应用。其检测原理
为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT还原为水不
溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中 , 而死细胞无
此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒 ,用酶联免疫
检测仪在 490nm波长处测定其光吸收值 , 可间接反映活细胞数
量。在一定细胞数范围内 , MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
实验操作步骤:
(1)细胞传代 , 用血球计数板计数。
(2)将细胞悬液稀释成 1×105 /ml,每孔加 100 μl于 96孔培养板
中 , 继续培养。
(3)24 h后吸去培养基加药 ,每孔 200μl。异鼠李素终浓度为 20,
40, 60, 80μmol/L和 100 μmol/L, 每组设 5个复孔。
(4)分别培养 48h后加入 20 μlMTT(5 mg/ml),混匀并放培养箱
培养。
(5)4h后吸去上清 ,加入 150μlDMSO溶解蓝紫色沉淀。
(6)在振动仪上振动 30min, 490nm下酶标仪读数。统计数据并
计算抑制率。
肿瘤细胞生长抑制率(%)=(1-实验组平均 OD值 /对照组平均
OD值)×100%
2.4　DAPI染色检测异鼠李素诱导 HepG2细胞的凋亡形态 实
验原理:DAPI即 4, 6-二脒基-2-苯基吲(4, 6-diamidino-2-phenylin-
dole), 是一种能够与 DNA中大部分 A, T碱基相互结合的荧光染
料 , 常用与荧光显微镜观测。因为 DAPI可以透过完整的细胞
膜 , 它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
实验操作步骤:
(1)细胞传代计数同上。将细胞悬液浓度调至 1×105 /ml。
(2)于 15mm一次性培养皿中放 2 ～ 3片无菌盖玻片 , 然后加入 5
ml细胞悬液。
(3)24 h后弃去培养液加入药物。
(4)培养 48h后 , 细胞用 PBS或 D-Hanks缓冲液漂洗 3遍 , 然后
用预冷的 95%乙醇固定 15 ～ 30 min,取出后晾干。
(5)1%醋酸作用 30 s, PBS冲洗 1 min。滴加 100 ng/ml的 DAPI
染液染色 10min。
(6)流水冲去染液 , 滤纸吸除多余水分 ,加一滴荧光封片液 , 置于
荧光显微镜下观察 , 激发波长 360 ～ 400 nm。
3　结果
3.1　MTT法测定异鼠李素对 HepG2细胞生长的影响 异鼠李素
对人肝癌 HepG2细胞的增殖有明显的抑制作用 , 随用药浓度增
加而增强 , 呈浓度依赖性效应(表 1及图 1)。 60 μmol/L的异鼠
李素处理 48h对 HepG2的抑制率可达 50%左右;而 100 μmol/L
浓度时的抑制率达到了 80%。异鼠李素对 HepG2的抑制率随浓
度的增加而增加。
表 1　异鼠李素对 HepG2细胞生长抑制作用结果
异鼠李素浓度 C/μmol· L-1 抑制率(%)
20 16.6
40 35.1
60 49.5
80 61.3
100 81.8
3.2　DAPI荧光染色检测异鼠李素诱导 HepG2细胞的凋亡形态
用 DAPI染色 , 活细胞核呈蓝绿色荧光 , 细胞质呈橙红色荧光。
凋亡细胞核呈蓝绿色浓聚在核膜内侧 ,可见细胞膜呈泡状膨出及
凋亡小体。 对照组绝大多数细胞结构正常 , 无明显皱缩(图
2A)。而异鼠李素处理 HepG2细胞 48 h后 , 大多数细胞出现皱
缩 , 细胞核固缩 ,体积变小 , 细胞内出现明显的凋亡小体形态(见
图 2B)。说明异鼠李素对 HepG2细胞具有凋亡诱导作用。
图 1　异鼠李素浓度与抑制率的关系
(A:DMSO处理 B:60μmol/L异鼠李素处理 ,箭头示凋亡细胞(400×)
图 2　异鼠李素浓度与抑制率的关系
4　讨论
本实验通过 MTT法 、细胞形态学观察等方法研究了异鼠李
素对细胞增殖的影响。结果发现异鼠李素能抑制人 HepG2细胞
的增殖 ,随异鼠李素浓度增加 , 抑制率增加 , 即存在剂量依赖关
系。从我们的实验结果可以看出 ,异鼠李素处理过的细胞在形态
学上与阴性对照组(DMSO处理)比较 , 出现凋亡的特征性变化 ,
可见典型的凋亡小体;因此 , 我们进一步证实了异鼠李素的抗肿
瘤活性是通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来实现的。综上所
述 , 东方肉穗草黄酮类物质对肿瘤有一定的调节作用 , 为其药理
研究以及临床应用提供一定的参考。
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