全 文 ：千日红花色苷的酶法提取及纯化研究＊
徐　忠　薄　凯
(哈尔滨商业大学食品工程学院　哈尔滨　150076)
摘　要　采用酶法提取千日红花色苷 , 并用吸附层析技术对千日红花色苷进行纯化。从温度 、pH 值 、酶用量 、固
液比及提取时间方面确定其提取较适宜的工艺参数 ,利用硅胶进行分离纯化 , 并从径长比和层析柱温度两方面确
定其较适宜的分离纯化条件。研究结果表明 , 较适宜的提取条件是 , 温度 30℃, pH 值 6.8 , 酶用量 6.0 μg/ g , 固液
比为 1∶10 , 提取时间为 60 min , 较适宜的纯化条件为 , 径长比 1∶30 ,层析柱温度为 35℃。
关键词　千日红 , 花色苷 ,纯化
第一作者:博士 ,教授。
　＊　黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.10541076)
收稿日期:2006-01-23
　　花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合
物[ 1] ,广泛存在于植物的花 、果实 、茎 、叶和根等器官的细胞当
中 ,是一种天然食用色素 , 安全 、无毒[ 2] , 具有一定营养和药理
作用。
纤维素酶可使纤维素 、半纤维素等物质降解 , 从而增大胞
内有效成分向提取介质的扩散 , 可以提高色素提取效率[ 3] 。
具有成本低 , 提取条件温和 , 有效成分理化性质稳定 , 无有机
溶剂残留等优点。文中主要对千日红花色苷的酶法提取 、纯
化进行了初步研究 ,为综合利用千日红花卉 , 提高其附加值提
供理论依据。
1　材料与方法
1.1　主要材料
千日红干花(市售)。纤维素酶 、DNS 试剂 、磷酸缓冲液等
分析纯试剂。
1.2　主要仪器设备
SHZ-A 水 浴恒温振荡器 , 上海跃进 医疗器械 厂;
XT42000C 精密电子天平 , Precisa仪器有限公司;721-E 型分
光光度仪 , 上海精密科学仪器有限公司;HWC-51 型恒温水
槽 ,上海天平仪器厂;FW80万能粉碎机 ,天津市泰斯特仪器有
限公司。
1.3　试验内容
1.3.1　酶法提取千日红花色苷
1.3.1.1　工艺路线
千日红花瓣※干燥※粉碎※加入缓冲溶液※酶解※灭酶
※抽滤※调 pH 值※柱层析※真空浓缩※冷冻干燥※花色苷
成品
1.3.1.2　试验方法
预先对影响酶法提取千日红花色苷的温度 、pH 值 、酶用
量 、提取时间 、固液比进行试验 ,并以色价作为评价指标 , 筛选
出酶法提取千日红花色苷的较适宜工艺参数。
(1)温度的影响
取千日红干花粉 2 g , 20～ 40℃下酶解 , pH6.0 , 酶用量 2.0
μg/g ,千日红干花粉∶磷酸缓冲液=1∶15 , 酶解 60 min。酶解
后 2 000 r/min离心 , 取上清液 8 mL ,以 1∶4 比例稀释 ,测定其
色价。
(2)pH 值的影响
取千日红干花粉 2 g , 25℃下 ,酶用量 2.0 μg/g ,千日红干
花粉∶磷酸缓冲液=1∶15 , 分别在 pH4.0 、5.0 、6.0 、7.0 、8.0 的
条件下酶解 60min ,然后 2 000 r/ min 离心 , 取上清液 8 m L ,以
1∶4 比例稀释 ,测定其色价。
(3)酶用量的影响
取千日红干花粉 2 g , 25℃, pH6.0 , 千日红干花粉∶磷酸缓
冲液=1∶15 ,在酶用量 1.0 ～ 10.0 μg/g 的条件下酶解 60 min ,
然后 2 000 r/min离心 , 取上清液 8 mL ,以 1∶4 比例稀释 ,然后
测定其色价。
(4)时间的影响
取千日红干花粉 2 g , 25℃, pH6.0 , =1∶15 , 酶用量 2.0
μg/g 条件下 ,酶解 30 、60 、90 、120、150 min , 然后 2 000 r/ min
离心 , 取上清液 8 mL ,以 1∶4 比例稀释 , 测定其色价。
(5)固液比的影响
取千日红干花粉 2 g , 25℃, pH6.0 , 酶用量 2.0 μg/g ,酶解
60 min 条件下 ,千日红干花粉∶磷酸缓冲液为 1∶6 、1∶8 、1∶10、1
∶12、1∶14 、1∶16 进行酶解 , 酶解后 2 000 r/ min 离心 , 取上清液
8 m L ,以 1∶4 比例稀释 , 然后测定其色价。
1.3.1.3　花色苷色价的测定
花色苷色价=A 530·N
其中:A530为千日红花色苷在 530 nm 处的吸光度值;N
为比色时稀释的倍数。
1.3.2　千日红花色苷的分离与纯化
采用 100 ～ 200目的层析用硅胶进行分离纯化 ,分别从径
长比和层析柱柱温 2 个方面 , 以色价作为评价指标 ,考察关于
千日红花色苷的较适宜的纯化条件。
1.3.2.1　径长比的影响
选用的固定内径为 1.5 cm ,柱温为室温 , 分别在径长比1∶
5、1∶10 、1∶15 、1∶20、1∶25 、1∶30 的条件下对千日红花色苷进行
分离纯化 , 测定其色价。
1.3.2.2　柱温的影响
分离与提取
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在径长比为 1∶5 的条件下 , 分别在 20 ～ 50℃的条件下进
行分离纯化 ,然后测定其色价 , 并找出较适宜的纯化温度。
1.3.2.3　千日红花色苷可见光谱的绘制
在较适宜的酶解和纯化工艺条件下得到的千日红花色
苷 ,按照 1∶4 的比例进行稀释 , 测定 400 ～ 600 nm 范围内的吸
光度值 ,绘制可见吸收光谱。
2　结果与讨论
2.1　酶法提取千日红花色苷试验结果
2.1.1　温度的影响
　　由图 1知 , 在一定温度范围内 , 随着温度的升高 , 千日红
花色苷的色价也随着升高 , 这主要是由于温度的升高使纤维
素酶的活力增强 ,提高了酶解反应的速度 , 加快了纤维素的降
解 ,使花色苷得以释放 , 30℃与 35℃的结果接近 , 高于 35℃后
色价迅速降低 ,综合考虑 , 确定较适宜的提取温度为 30℃。
图 1　酶解温度对花色苷取的影响
2.1.2　pH 值的影响
由图 2 知 , pH 值在 6 ～ 7时花色苷的色价最高 ,继续对 pH
在 6.0、6.2 、6.4、6.6、6.8、7.0 条件下酶解的试验结果进行考
察 ,结果如图 3 所示 , pH 值为 6.8 时 ,所得花色苷色价最高 ,这
是因为在酶的最适 pH 值条件下 , 降解反应速率是色价的最高
值。同时 pH 值对花色苷本身的稳定性和显色也有较大的影
响。
图 2　酶解 pH 值对花色苷提取的影响
图 3　酶解 pH 值对花色苷提取的影响
2.1.3　酶用量的影响
反应速率随酶用量的增加而提高 , 试验结果表明 ,反应速
率与酶浓度为直线图形 ,但当酶用量超过一定量时 , 酶解反应
饱和反应速率不再增加。如图 4 所示。酶用量在 1.0 ～ 4.0
μg/ g时 , 花色苷色价增长缓慢 ,酶用量在 4.0 ～ 6.0 μg/ g 之间
时 ,花色苷色价迅速上升 , 酶用量超过 6 μg/ g时 ,增长趋于平
缓 ,因此 ,较适宜的酶用量为 6.0 μg/g。
图 4　酶用量对花色苷提取的影响
2.1.4　时间的影响
　　由图 5 知 , 花色苷色价随酶解时间的延长而增加 ,当时间
增加到一定值后 , 色价则不再增加 , 较适宜的酶解时间为 60
min。
图 5　酶解时间对花色苷提取的影响
2.1.5　花色苷色价与固液比的关系
试验结果表明 , 在一定的固液比范围内 , 随着千日红与缓
冲液质量比的增加 , 花色苷色价也随之增加 , 如图 6 所示 , 当
固液比在 1∶1 ～ 1∶10 时 ,花色苷色价迅速上升 , 在 1∶10 ～ 1∶16
时 ,花色苷色价呈递减趋势。因为在酶解过程当中随着固液
比的增加 , 液体在千日红细胞内的扩散能力增强 , 有利于酶对
千日红花纤维的降解 , 使得千日红细胞迅速破坏 , 但是随着固
液比增加 , 酶的浓度也随之减少 , 酶解反应速率也随之降低 ,
因此判断较适宜的酶解固液比为 1∶10。
2.2　千日红花色苷的分离与纯化
以硅胶为吸附层析介质 ,从径长比与层析柱柱温方面考
察千日红花色苷较适宜的分离纯化条件。
2.2.1　径长比的影响
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION INDUSTRIES
140　 2006 Vol.32 No.8(Total 224)
图 6　酶解固液比对花色苷提取的影响
室温下 ,在固定内径为 1.5 cm , 径长比为1∶5 、1∶10、1∶15 、
1∶20、1∶25 、1∶30 的条件下对千日红花色苷进行分离纯化试验
结果如图 7 所示 , 随着层析柱长度的增加 , 分离纯化效果越
好 ,柱长由 7.5 cm 增至 45 cm 时 , 千日红花色苷的色价由 2.8
上升到 3.7。
图 7　柱长对花色苷纯化的影响
2.2.2　层析柱柱温对于花色苷分离纯化的影响
选用长度为 7.5 的层析柱 , 结果如图 8 所示 , 当柱温从
20℃上升到 35℃时 ,所得花色苷色价迅速上升 , 当温度上升到
40℃以后花色苷色价增长趋于平缓 , 综合考虑 , 本试验采用
35℃作为千日红花色苷柱层析纯化的较适宜的温度。其中可
能是因为随着温度的上升 , 分子运动速度加快或者使得固定
相与要分离组分的吸附解析能力增强 ,但随着温度的上升 , 花
色苷呈现出不稳定的一面 ,因此色价迅速降低 。
图 8　层析柱柱温对花色苷纯化的影响
2.3　千日红花色苷可见吸收光谱
　　如图 9 所示 , 在可见光范围内 ,在 530nm 处有最大吸光度
值。
图 9　千日红花色苷可见吸收光谱
3　结　论
研究结果表明较适宜的提取条件是:30℃, pH6.8 , 酶用量
6.0μg/ g , 固液比为 1∶10 , 提取时间为 60 min , 较适宜的纯化
条件为 , 径长比 1∶30(内径为 1.5), 层析柱温度为 35℃。
参 考 文 献
1　庞志申.花色苷研究概况[ J] .北京农业科学 , 2000(5):37～ 42
2　赵超英 ,姚慢.葡萄籽提取原花青素的营养保健功能[ J] .中国食品
卫生杂质 , 2000 , 12(6):38～ 41
3　邱业先 ,王桃云.野菊花黄色素提取工艺研究[ J] .食品与发酵工
业 , 2002 , 28(3):33～ 36
Study on the Enzyme Extraction and Purification of Gomphrenag lobosa L
Xu Zhong　Bo Kai
(College of Food Engineering , Harbin Universi ty of Commerce , Harbin 150076 , China)
ABSTRACT　The study used enzyme methods to ex tract Antocyanins of Gomphrenag lobosa L and used the methods of adsorb chro-
matography for the purification of anthocyanins of Gomphrenag lobosa L.To identify the optimal processing parameter based on tempera-
ture , pH value , solid to liquid ra tio , time and the consumption of the enzyme , we also used silicagel to separate and purify the antho-
cyanins of the Gomphrenag lobosa L , and to de termine desirable processing parameter from the slenderness ratio and temperature.The
results showed that the optimum technology parameter of enzyme ex traction w ere 30℃, the pH value is 6.8 , solid- to-liquid ratio is 1∶10 ,
the consumption of enzyme is 6.0μg/ g , enzymolosis time is 60min , and optimal conditions of the purification were slenderness ratio 1∶30
a t 35℃.
Key words　Gomphrenag lobosa L , antocyanins , purification
分离与提取
2006年第 32卷第 8期(总第 224期) 141