全 文 ：中甲硝唑的有效含量，从此次试验数据可以看出，这样做一方
面可以有效消除羟苯乙酯的对于测定的干扰，另外一方面，这
种方法可以准确地测定该制剂中甲硝唑的有效含量。在整个
甲硝唑含量测定方法过程中，其操作简便快捷，而且测定结果
准确，稳定性好，可以有效地控制该制剂的质量，值得医院制
剂等相关科室的推广使用。
［ 参 考 文 献 ］
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［收稿日期］ 2013 － 01 － 28
川牛膝中杯苋甾酮的提取、分离及纯化工艺研究
孔飞飞1，郭良君1，谭兴起2
(1． 中国人民解放军第九八医院，浙江 湖州 313000;2． 中国人民解放军 102 医院，江苏 常州 213002)
［摘要］ 目的 研究从川牛膝中提取分离提纯杯苋甾酮的实用生产工艺。方法 生药材回流提取正交实验，大
孔树脂分离富集最佳条件筛选，硅胶柱层析纯化试验。结果 川牛膝药材用 70%乙醇加热回流提取两次为最佳提取
工艺;大孔树脂分离富集杯苋甾酮工序中，用 50%乙醇以 0． 8 BV /min 的速率洗脱为最佳分离工艺;硅胶柱层析纯化
工序中，以氯仿 － 90%乙醇(10∶ 1)为洗脱液为佳;最后经重结晶可得杯苋甾酮结晶。结论 川牛膝经提取、大孔树脂
分离、硅胶柱层析纯化获得杯苋甾酮的工艺简便、实用、经济，适用于小量生产。
［关键词］ 川牛膝;杯苋甾酮;分离和提纯;工艺学
［中图分类号］ R284． 2 ［文献标识码］ B ［文章编号］ 1008 － 8849(2013)18 － 2023 － 04
川牛膝是苋科植物川牛膝 Cyathula officinalis Kuan 的干
燥根。收载于《中国药典》(2005 版一部) ，具有逐瘀通经、通
利关节、利尿通淋功效。用于经闭癥瘕，胞衣不下，关节痹痛，
足痿筋挛，尿血血淋，跌扑损伤［1］。化学成分主要为甾酮类，
如杯苋甾酮(cyasterone)、头花蒽草甾酮等，其中杯苋甾酮在
川牛膝所含甾酮类成分中含量较大［2］，药理作用与功能主治
基本相吻合［3］。文献资料中关于牛膝的提取方法报道较
多［4 － 5］，而川牛膝的提取分离提纯工艺研究报道较少。杯苋
甾酮为川牛膝的有效成分(见图 1) ，因此笔者开展了川牛膝
中杯苋甾酮的提取分离和纯化的工艺研究，确定了最佳工艺
方法，现报道如下。
图 1 杯苋甾酮结构式
1 研究资料
1. 1 仪器 UV － 754 型紫外可见分光光度计 GR － 202AND
分析天平 Waters 高效液相色谱仪(515 泵、2487 紫外检测
器) ，7725i手动进样阀，针筒式微孔过滤器(0． 45 μm，天津市
腾达过滤器厂)RE － 201D旋转蒸发仪，SHZ －Ⅲ型循环水真
空泵，AS3120A超声仪，ZF － 1 三用紫外分析仪。
1. 2 药品与试剂 供试药材购于华东医药德清天润中药分
公司，经九八医院谭兴起博士鉴定为中药川牛膝;杯苋甾酮对
照品(自制，纯度为 99． 6%，HPLC － ELSD 归一化法测定) ;
D101 大孔树脂(天津制胶厂) ;色谱用硅胶(烟台江友硅胶开
发有限公司) ，甲醇，氯仿为分析纯，乙腈为色谱纯，95%乙醇
为医用，水为重蒸去离子水。
2 实验部分
2. 1 标准曲线的绘制
2. 1. 1 色谱条件 Symmetry C18 柱(3． 9 mm × 150 mm，4． 6
μm) ，流动相为乙腈 －水 －磷酸二氢钾(22∶ 78∶ 1． 36) ，流速 1
mL /min，检测波长:243 nm，柱温 室温。进样量 10 μL。在此
条件下，样品中杯苋甾酮峰与其对照品峰的保留时间基本一
致，且分离良好，无其他干扰，见图 2 ～图 3。
2. 1. 2 对照品溶液的制备 精密称取杯苋甾酮 11． 30 mg，置
200 mL量瓶中，加 50%甲醇水溶解并稀释至刻度，摇匀。取
上述对照品溶液 5 mL于 50 mL量瓶中，用 50%甲醇水定容，
摇匀，即得(每 1 mL中含杯苋甾酮 5． 65 μg)。
2. 1. 3 供试品溶液的制备 精密称取 100 mg杯苋甾酮粗提
物，用 50%甲醇超声溶解，滤过，并定溶于 1 000 mL 量瓶中，
微孔滤膜过滤取续滤液待测。
·3202·现代中西医结合杂志 Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2013 Jun，22(18)
图 2 杯苋甾酮高效液相色谱图
图 3 对照品高效液相色谱图
2. 1. 4 线性关系考察 分别取上述对照品溶液 2，4，8，16，20
μL，进样测定，以对照品的进样量 X(μg)对峰面积积分值 Y
作图，得到一条直线。结果表明:杯苋甾酮在 0． 011 ～ 0． 113
μg范围内线性关系良好，其回归方程为:Y =1． 869 63e +006X －
551． 059(r = 0． 999 9)。见图 4。
图 4 线性回归关系图
2. 1. 5 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液，连续进样 5
次(每次 8 μL)进行测定，峰面积分别为:83 794． 3，82 116． 2，
82 814． 3，82 683． 7，83 352． 4，计算 RSD为 0． 7%。
2. 1. 6 重现性试验 取杯苋甾酮粗提物，按供试品溶液制备
方法同时制取 5 份供试溶液，各精密吸取 10 μL进样，峰面积
分别为:58 844． 5，58 773． 5，59 455． 7，58 336． 4，58 824． 2，测定
结果的 RSD为 0． 67%。
2. 1. 7 稳定性试验 对照品及供试品溶液避强光放置，每隔
4 h测定 1 次，结果表明在 24 h内均保持稳定。
2. 1. 8 加样回收率试验 精密称取杯苋甾酮粗提物 5 份，加
入一定量杯苋甾酮，按照样品溶液制备方法制得供试溶液，测
定含量，以杯苋甾酮计算加样回收率，结果加样回收率为 98．
65%，RSD为 1． 2%，n = 5。
2. 2 提取工艺的优化 目前川牛膝中甾酮类成分的提取分
离工艺研究较少，笔者参考牛膝的提取方法［6］，通过正交实
验对有机溶剂回流提取的方法进行了研究。
2. 2. 1 确定因素水平表 本试验考察提取用溶媒的量、回流
时间以及溶媒浓度(乙醇水)对浸膏得率的影响。因素水平
见表 1。
表 1 提取因素水平表
水平编号
A溶媒量 /倍
第 1 次 第 2 次
B提取时间 /h
第 1 次 第 2 次
C乙醇浓度 /%
1 8 6 1． 5 1 50
2 10 8 2 1． 5 70
3 12 10 2 2 95
2. 2. 2 具体操作 分别称取 100 g川牛膝药材按表 1 设计的
试验方案进行，选择 L9(33)正交表进行试验，所得提取液经
合并、过滤、浓缩，再置恒温干燥箱 90 ℃烘干，称质量，即得干
膏质量。
2. 2. 3 结果分析 所得样品质量及结果分析见表 2。
2. 2. 4 结论 通过上述试验可以发现，3 个因素对提取效率
的影响由大到小依次为 C ＞ B ＞ A，最优提取工艺的水平选定
为 A3B3C2，即理论上的最优提取方案。川牛膝用 70%乙醇
水加热回流提取 2 次，第 1 次加 12 倍量回流 2 h，第 2 次加 10
倍量回流 2 h。
按上述理论上的最优方案进行验证，以干膏收率为指标
进行考察，得到干膏收率为 30． 2(g /100 g) ，大于正交试验结
果中的最高值 29． 9，说明优化是成功的。
表 2 正交试验结果
试验号
因素
A B C
干膏收率 /
(g /100 g)
1 1 1 1 19． 9
2 1 2 2 26． 1
3 1 3 3 25． 4
4 2 1 2 24． 3
5 2 2 3 26． 0
6 2 3 1 23． 2
7 3 1 3 24． 4
8 3 2 1 26． 6
9 3 3 2 29． 9
∑Ⅰ 71． 4 68． 6 69． 7
∑Ⅱ 73． 5 78． 5 80． 3
∑Ⅲ 80． 9 78． 6 75． 8
极差 9． 5 10． 1 10． 6
2. 3 大孔吸附树脂分离富集杯苋甾酮粗提物最佳条件筛选 大
孔吸附树脂是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的非离子型
有机高分子聚合物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、选
择性好、吸附容量大、易再生、使用寿命长、节省费用等优点，
近年来在天然产物尤其是水溶性化合物的提取分离中应用广
·4202· 现代中西医结合杂志 Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2013 Jun，22(18)
泛［7］。笔者采用大孔吸附树脂分离富集杯苋甾酮，得到杯苋
甾酮粗提物，方法方便有效。
2. 3. 1 实验方法 采用 D －101 型大孔吸附树脂分离富集杯
苋甾酮粗提物，对树脂的吸附和解吸工艺参数进行了筛选。
主要研究大孔吸附树脂对杯苋甾酮的动静态吸附容量及 pH
值、吸附流速、洗脱剂等吸附和解吸影响因素，采用 HPLC 法
测定其中杯苋甾酮的含量作为指标。
2. 3. 2 工艺参数筛选
2. 3. 2. 1 树脂预处理 新买大孔吸附树脂先用 95%乙醇漂
洗至无煤油味(加热回流 2 h) ，再用水漂洗至漂洗液无色透
明，装柱。大孔树脂再生时用 2% NaOH 浸泡 24 h 后水洗至
中性，再用 5% HCL浸泡 24 h后用水洗至中性即可。
2. 3. 2. 2 大孔吸附树脂对杯苋甾酮动态吸附容量的测定
采用 TLC法检测大孔吸附树脂是否达到饱和吸附。取川牛
膝药材提取液通过大孔吸附树脂柱后流出液作为供试品溶
液，1 g /L杯苋甾酮溶液作为对照品溶液，各吸取 10 μL 点样
于硅胶 G薄层板上，以氯仿 － 90%乙醇(5∶ 1)混合液为展开
剂，10%硫酸 －乙醇溶液为显色剂。当树脂吸附饱和后，流出
液中会含有杯苋甾酮，供试溶液在与对照品溶液 TLC 图谱相
应的位置上，会显示相同的紫红色斑点。
川牛膝提取液通过吸附树脂柱(树脂量 10 g) ，流速 0． 8
BV /min。TLC 法检测显示，提取液上柱 3． 5 L 吸附饱和。用
水漂洗树脂至流出液澄清透明，用 5 BV 体积分数 50%乙醇
洗脱，流速 0． 5 BV /min，洗脱液烘干至恒重，得杯苋甾酮粗提
物 486． 5 mg，杯苋甾酮质量分数为 9． 3%，约 45． 2 mg。故树
脂对杯苋甾酮动态吸附量为 4． 52 mg /g。
2. 3. 2. 3 大孔吸附树脂对杯苋甾酮静态吸附量的测定 由
于大孔吸附树脂动态吸附时吸附能力强于静态吸附，故树脂
静态吸附饱和量要小于其动态吸附饱和量，即 2． 2 项下最佳
提取条件得到的川牛膝提取液 3． 5 L足以使 10 g树脂静态条
件下达到吸附饱和。
取 10 g经过预处理的树脂置于 3． 5 L 川牛膝提取液中，
不断搅拌 2 g，静置过夜后，从提取液中滤出树脂，按 2. 3. 2. 2
项方法操作，得杯苋甾酮提取物 381． 2 mg，杯苋甾酮质量分数
为 9． 5%，约 36． 2 mg。故树脂对杯苋甾酮静态吸附量为 3． 62
mg /g。
2. 3. 2. 4 pH对大孔吸附树脂吸附杯苋甾酮的影响 取 6 份
500 mL牛膝提取液，调至不同 pH，分别通过装有 10 g预处理
后树脂的树脂柱，吸附流速 0． 8 BV /min，吸附结束后，按
2. 3. 2. 2项方法用 8 BV体积分数 70%乙醇洗脱。结果表明:
pH对树脂吸附杯苋甾酮的影响不大。但酸性条件下，提取液
杂质含量较低，既增加树脂吸附量，又保护树脂，见表 3。
2. 3. 2. 5 吸附流速对大孔吸附树脂吸附杯苋甾酮的影响
取 5 份 10 g处理后的树脂装柱，5 份 500 mL川牛膝提取液分
别以不同吸附流速上柱，按 2. 3. 2. 2 项方法用 8 BV体积分数
70%的乙醇洗脱。结果表明:吸附流速小于 1． 2 BV /min 时，
吸附流速对树脂吸附杯苋甾酮影响不大，为提高实验效率，吸
表 3 pH对大孔吸附树脂吸附杯苋甾酮的影响
项目 2 4 6 7 8 10
提取液色泽 浅褐 浅褐 浅褐 褐色 深褐 褐色
提取液中沉淀   + － － －
杯苋甾酮粗提物 /mg 142． 2 160． 6 196． 4 187． 3 190． 2 201． 5
杯苋甾酮 /mg 10． 5 11． 2 15． 3 15． 1 14． 2 13． 5
注:+表示有沉淀;越多表示沉淀越多;－表示没有沉淀。
附流速可取 1． 2 BV /min，见表 4。
表 4 吸附流速对大孔吸附树脂吸附杯苋甾酮的影响 mg
项目 0． 2 0． 4 0． 6 0． 8 1． 2
杯苋甾酮粗提物 182． 2 160． 6 169． 4 157． 5 148． 5
杯苋甾酮 14． 5 14． 2 13． 5 13． 2 12． 9
2. 3. 2. 6 不同洗脱溶液对杯苋甾酮洗脱的影响 取 8 份 10
g处理后的脂装柱，8 份 500 mL牛膝提取液分别上柱，吸附流
速 0． 8 BV /min，按 2. 3. 2. 2 项方法，分别用不同溶剂与水混合
配成不同体积分数的洗脱溶液 5 BV定量洗脱。结果表明:不
同体积分数的溶剂的洗脱能力不同，体积分数 50%乙醇洗脱
效果都较好，见表 5。
表 5 不同洗脱溶液对杯苋甾酮洗脱的影响 mg
项目 0 10 20 30 40 50 60 70
粗取物 70． 5 80． 1 85． 1 131． 2 140． 5 153． 3 167． 2 163． 5
杯苋甾酮 0 4． 6 7． 2 9． 3 11． 5 13． 5 13． 7 13． 1
2. 3. 2. 7 洗脱溶液用量对杯苋甾酮洗脱的影响 取 8 份 10
g处理后的树脂装柱，8 份 500 mL牛膝提取液分别上柱，吸附
流速 1． 2 BV /min，按 2. 3. 2. 2 项方法，分别用不同体积洗脱溶
液洗脱。结果表明:体积分数 50%乙醇，5 BV 就可以把树脂
吸附的杯苋甾酮全部洗脱下来，见表 6。
表 6 洗脱溶液用量对杯苋甾酮洗脱的影响 mg
项目 2 3 4 5 6 7 8 9
粗取物 80． 5 103． 5 128． 6 145． 5 146． 2 144． 6 145． 2 143． 9
杯苋甾酮 7． 3 9． 7 11． 3 12． 7 12． 4 12． 3 12． 2 12． 1
2. 3. 3 最佳吸附和解吸条件 D101 型大孔吸附树脂彩云对
杯苋甾酮动态吸附量为 28． 9 mg /g，静态吸附量为 21． 2 mg /g。
树脂富集分离杯苋甾酮，pH 6 左右，提取液杂质含量较低，既
增加树脂吸附量，又保护树脂。吸附流速在 1． 2 BV /min以下
对树脂吸附效果影响不大，为提高实验效率，吸附流速可取
1． 2 BV /min。体积分数 50%乙醇洗脱效果较好，4 BV就可以
把树脂吸附的杯苋甾酮全部洗脱下来。由于试验中洗脱流速
太小，最大流速仅为 0． 4 BV /min，故洗脱流速取 0． 4 BV /min。
故 D101 型大孔吸附树脂富集分离杯苋甾酮的最佳条件为:
pH6 左右，吸附流速 1． 2 BV /min，体积分数 50%乙醇 5 BV洗
脱，洗脱流速 0． 4 BV /min。
2. 4 分离与纯化 称取按 2． 3 分离富集工艺后得到的杯苋
甾酮粗提物 100 mg，将粗提物研磨成细粉，加入甲醇超声提取
数次，直到残留固体经 TLC 色谱检测，在与杯苋甾酮色谱相
·5202·现代中西医结合杂志 Modern Journal of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine 2013 Jun，22(18)
同的位置上，不显明显的紫红色斑点，提取液经拌样装硅胶
柱，加压层析，分离得白色结晶约 10 mg，此白色结晶在 TLC
图谱上显示一个斑点，见图 5。
图 5 杯苋甾酮分离图
2. 4. 1 TLC分析方法 分别称取牛膝提取物和蜕皮甾酮适
量，制成 5． 0 g /L供试品溶液和 1． 0 g /L对照品溶液。吸取供
试品溶液和对照品溶液各约 10 μL，在硅胶 G薄层板上点样，
不同展开剂展开，10%硫酸乙醇溶液显色。3 种 TLC 展开剂
分别为:氯仿 － 95%乙醇(10∶ 1)、氯仿 － 95%乙醇(7． 5∶ 1)、
氯仿 － 95%乙醇(5∶ 1) ，Rf 值分别为:0． 19，0． 46，0． 59。因此
笔者采用氯仿 － 95%乙醇(10∶ 1)为流动相。
2. 4. 2 柱层析方法 以硅胶 G 为固定相，氯仿 － 95%乙醇
(10∶ 1)混合液为流动相，称取适量提取物，甲醇拌样，铺于固
定相上层，以流动相为洗脱剂洗脱。经 TLC 检测，收集洗脱
液，回收可得白色结晶性粉末，经鉴定为杯苋甾酮。
2. 4. 3 杯苋甾酮的重结晶 经过甲醇反复重结晶，可得杯苋
甾酮结晶，纯度为 99． 6%，HPLC － ELSD归一化法测定。
3 讨 论
从川牛膝中得到杯苋甾酮的纯品方案为:川牛膝用 70%
乙醇水加热回流提取 2 次，第 1 次加 12 倍量，回流 2 h，第 2
次加 10 倍量回流 2 h，合并提取液，回收乙醇;用水稀释后，过
滤，上大孔吸附树脂吸附，吸附流速 1． 2 BV /min，分别用水
洗、10%乙醇水洗脱，弃去，最后用 50%乙醇水 5 BV 洗脱，洗
脱流速 0． 4 BV /min，回收至干，得杯苋甾酮粗提物;杯苋甾酮
粗提物经柱层析，用氯仿 － 95%乙醇(10 ∶ 1)洗脱，经甲醇反
复重结晶可得纯品。
加热回流提取川牛膝，有效成分提取效率高，乙醇便于回
收，节省成本。大孔树脂法分离川牛膝提取液，具有操作简
便、省时、吸附选择性高，吸附能力强等优点，且树脂可以再生
利用。所得杯苋甾酮粗提物中，杯苋甾酮含量高，便于分离纯
化。加压柱层析，笔者采用氯仿 － 95%乙醇(10 ∶ 1)洗脱剂，
分离效果好。笔者参考文献［8 － 11］资料，采用高效液相色
谱法测定川牛膝提取物中杯苋甾酮的含量，方法简单易行，适
合川牛膝提取物的质量控制。
本研究通过正交试验法对川牛膝的提取工艺进行了优
化，对大孔吸附树脂分离富集杯苋甾酮粗提物最佳条件进行
筛选，最后找到合适的纯化和结晶方法得到杯苋甾酮纯品。
该工艺简单易行，适用于大量制备，为杯苋甾酮的进一步研究
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