全 文 ：EGTA 和 La3 + 对几种逆境诱导辣椒样半萜
环化酶基因表达的影响 3
何水林 3 3 　林文雄　陈如凯　(福建农业大学作物学院 ,福州 350002)
【摘要】　用钙离子螯合剂 EGTA 及细胞膜钙离子通道拮抗剂 La3 + 预处理辣椒叶片 ,以破坏辣椒叶片中的钙信
使系统 ,再用紫外线、CuCl2 、HgCl2 处理辣椒叶片 ,研究表明 EGTA 和 La3 + 预处理未能降低 CuCl2 、HgCl2 、UV 诱
导辣椒倍半萜环化酶活化的作用 ,EGTA 预处理反而对 CuCl2 、HgCl2 、UV 的诱导辣椒倍半萜环化酶活性作用有
一定的促进效应. 单独用 EGTA 处理也能诱导离体辣椒叶片表现出倍半萜环化酶活性. Northen Blot 分析结果
表明 ,EGTA 能诱导辣椒倍半萜环化酶基因转录. 研究表明 ,在辣椒倍半萜环化酶基因表达过程中 ,还存在钙信
使系统以外的信号传递途径 ;非生物诱发因子对倍半萜环化酶基因表达诱导作用与生物 Elicitor 的诱导作用在
信号传递上有差异.
关键词 　辣椒 　钙信使系统 　倍半萜环化酶 　基因表达 　非生物诱发因子
文章编号 　1001 - 9332 (2001) 02 - 0272 - 03 　中图分类号 　Q756 ,Q945 　文献标识码 　A
Effect of EGTA and La2 + on induction of sesquiterpene cyclase gene expression in leaves of Capsicum annuum by
several abiotic elicitors. HE Shuilin ,L IN Wenxiong and CHEN Rukai ( College of Crop Science , Fujian A gricultural
U niversity , Fuz hou 350002) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2001 ,12 (2) :272～274.
To destroy Ca2 + signal system ,the detached leaves of Capsicum annuum were pretreated with EGTA ,a commonly
used Ca2 + chelator ,or La3 + ,an ion which competitively inhibits Ca2 + movement through plasma membrane channels.
The induction of sesquiterpene cyclase gene expression in the pretreated pepper leaves under the treatments of CuCl2 ,
HgCl2 and UV was conducted in this paper. The result showed that no hindrance of sesquiterpene cyclase enzyme activ2
ity was detected in the EGTA or LaCl3 pretreated leaves ,compared to the controls treated with CuCl2 ,HgCl2 ,and UV
without the pretreatment ,while the pretreatment with EGTA enhanced the inductivity of the above exogenous abiotic
elicitors on the enzyme activity. The sesquiterpene cyclase activity was also detected in leaves treated with EGTA only ,
and the result of Northen Blot analysis indicated that the enhancement of EGTA on the enzyme activity was due to the
induction of EGTA on the gene transcription. It is suggested that there might exist other signal pipelines ,in addition to
the Ca2 + signal system in sesquiterpene cyclase gene expression in pepper leaves ,and the mechanism of induction of
abiotic elicitors on sesquiterpene cyclase in C. annuum differed from that of biotic elicitors.
Key words 　Capsicum annuum , Ca2 + signal system , Sesquiterpene cyclase , Gene expression , Abiotic elicitor.
　　3 福建省教委留学回国人员基金资助项目.
　　3 3 通讯联系人.
　　1999 - 07 - 07 收稿 ,1999 - 12 - 17 接受.
1 　引 　　言
Ca2 + 信使系统作为耦联胞外信号与胞内生理生
化过程的第二信使系统之一 ,参与了植物光合作用 ,植
物在各种逆境下的渗透调节、植物的光周期反应 ,细胞
伸长与激素平衡等植物生理过程[9 ] . 此外 ,在植物受
真菌或其它生物诱发因子作用而引发的防御反应中 ,
曾发现钙信使系统充当了耦联生物诱发因子和防御基
因被诱导表达信号传递过程的中介之一[3 ,7 ,8 ,10 ] ,但也
有相反的报道[6 ] . Chappell 等[1 ]在生物诱发因子作用
下的烟草悬浮细胞中分离出一种可扩散的能诱发倍半
萜植保素合成的终端信号因子. 迄今为止 ,对于植物防
御基因在非生物诱发因子 (elicitor) 作用下表达过程
中的钙信使系统的可能作用报道很少 ,而信号传递的
研究对于阐明诱发因子诱导植物防御基因表达的机
制 ,最终对信号传递环节加以操纵而强化植物防御基
因的表达从而提高植物抗病水平有重要的意义. 我们
曾用非生物的诱发因子 UV、CuCl2 、HgCl2 等诱导离体
辣椒叶片倍半萜植保素生物合成过程中的关键酶倍半
萜环化酶[2 ,11 ]基因表达 ,使其表现出倍半萜环化酶活
性[5 ] .为了进一步阐明辣椒倍并萜植保素代谢的分子
生态学机制 ,本文对上述非生物诱发因子作用下钙信
使系统的可能作用进行了研究和探讨.
2 　材料与方法
211 　供试村料
所用辣椒品种为韩国主栽品种之一的 Subiche ,由韩国庆
尚北道辣椒研究中心惠赠 ,EGTA、La Cl3 等试剂或药品分别为
Sigma、Asham 等公司产品 ,探针标记试剂盒为 Stratagene 产品.
212 　研究方法
21211 辣椒植株的栽培 　辣椒种子经次氯酸钠 (1 %) 消毒处理
应 用 生 态 学 报 　2001 年 4 月 　第 12 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Apr. 2001 ,12 (2)∶272～274
1h 后 ,用蒸馏水浸泡 1d (25 ℃下) . 然后播种盛有消毒的水稻土
的塑料盘中 ,待幼苗长到 5 叶左右 ,移栽到直径 20cm、深 30cm
的盛消毒水稻土的盆子中 ,置于 25 ℃,16h 光/ 8h 暗的温室中 ,
待植株长到 10 片叶子时 ,取样分析 ,每个样品为 3 片叶子.
21212 逆境胁迫及钙离子拮抗剂处理 　分别于 10 叶期和开花
结果期取倒数第 3 和第 4 片功能叶 ,用直径为 1cm 打孔器取叶
片组织用于钙离子拮抗剂、离子通道阻塞剂和非生物诱发因子
处理. 采用诱导倍半萜酶活性较大的 UV 自动交联处理 45s、
2mM CuCl2 、2mM HgCl2 诱导辣椒倍半萜环化酶活性 ,以考察
钙离子拮抗剂对上述逆境诱导辣椒倍半萜环化酶基因表达的
可能效应. 在 UV 处理前 1h ,将 5 片小叶圆片浸入 2mM EGTA
或 2Mm LaCl3 中抽滤 1h ,UV 处理后浸入蒸馏水中培养 ; Cu2
Cl2 、HgCl2 处理前 ,将叶小圆片在 EGTA 和 La3 + 溶液中抽滤
1h ,然后在 CuCl2 、HgCl2 溶液中浸泡 4h 后 ,置于盛蒸馏水的培
养皿中于 25 ℃遮光培养到规定的时间收取 ; EGTA 处理 ,将辣
椒 10 叶期的功能叶和开花后的功能叶的小圆叶片浸入不同
EGTA 中 ,置于 25 ℃遮光培养到规定的时间收取. 收取后的叶
片用蒸馏水冲洗后置于 - 70 ℃冰箱中保存 ,待分析.
21213 酶活性测定、RNA 提取和 Northern Blot 分析 　倍半萜环
化酶活性的测定按 Vogeli 等[11 ]的方法进行 ,RNA 的提取按苯
酚/ 氯仿进行 ;探针标记用 It2prime Kit 随机引物试剂盒按厂家
的说明书进行标记. Northern Blot 分析参照 Sambrook 等的方
法进行 ,在含有甲醛的凝胶上进行 RNA 电泳 ,将变性 RNA 转
移到 Zeta2probe GT 尼龙膜上 (Bio2RAD) ,用 Prime2It kit 标记探
针 ,用磷酸缓冲液 (磷酸缓冲液 ,7 % SDS ,1M EDTA ,1 %BSA)
60 ℃预杂 4h 以后 ,将已标记的探针加入到杂交袋中 60 ℃杂交
16h ,用 2 ×SSC(含 1 % SDS)在 55 ℃下洗膜 2 ×10min ,再用 0. 1
×SSC(含 0. 1 % SDS)在 55 ℃下洗膜 2 ×10min ,待凉干后用 Ⅹ
感光片在 - 70 ℃放射自显影 72h.
3 　结果与分析
311 　LaCl3 和 EGTA 对逆境诱导倍半萜环化酶活性
的影响
从图 1 可见 , EGTA、LaCl3 对 UV、HgCl2 、CuCl2
诱导倍半萜环化酶酶活性没有表现出抑制作用. 用
2mM 的 LaCl3 预处理 ,未能降低 HgCl2 、CuCl2 、UV 等
对离体辣椒叶片酶活性的诱导作用 ,而 EGTA 却对
HgCl2 、CuCl2 、UV 等对离体辣椒叶片酶活性的诱导有
促进作用 ,EGTA 预处理的辣椒叶片在 HgCl2 、CuCl2 、
UV 的作用下的倍半萜环化酶活性比未进行预处理的
辣椒叶片倍半萜环化酶活性高.
312 　EGTA 处理对辣椒倍半萜环化酶活性的影响
从图 2 可看出 , EGTA 本身能诱导倍半萜环化酶
表达 ,在处理浓度范围内 ,辣椒倍半萜环化酶活性随着
EGTA 浓度升高而提高. EGTA 诱导倍半萜酶受 EG2
TA 浓度和辣椒植株的发育进程影响 ,开花前的 10 叶
期的叶片在 2mM EGTA 的作用下 ,被诱导的酶活性
最高 ,而开花后的叶片 ,用 0. 5mM EGTA 处理诱导的
倍半萜环化酶活性最高 (图 3) .
图 1 　钙离子拮抗剂 EGTA、LaCl3 对非生物诱发因子诱导倍半萜环化
酶酶活性的影响
Fig. 1 Effects of EGTA and LaCl3 on the induction of the cyclase activity in
pepper leaves by abiotic elicitors.
图 2 　EGTA 处理 36h 后辣椒叶片倍半萜环化酶酶活性
Fig. 2 Activity of sesquiterpene cyclase in pepper leaves under EGTA treat2
ment for 36h.
图 3 　不同浓度 EGTA 处理 36h 后不同生育期辣椒叶片倍半萜环化酶
酶活性
Fig. 3 Sesquiterpene cyclase activity of pepper leaves in different develop2
ment stage under different concentration of EGTA treatment for 36h.
Ⅰ1 开花前叶片 Leaf before flowering , Ⅱ1 开花后叶片 Leaf after flower2
ing.
313 　EGTA 对倍半萜环化酶基因 mRNA 积累的诱导
以 SCCCA # 1 作探针 ,对从 EGTA 处理的辣椒叶片
中提取的总 RNA 进行 Northern Blot 分析 ,结果见图 4.
从图 4 可以看出 ,在 EGTA 作用下 ,辣椒叶片细胞中有
倍半萜环化酶基因的 mRNA 的合成和积累 ,0～48h 内 ,
mRNA 的积累 12h 即达到较高水平 ,一直持续到 48h.
3722 期 　　　　　　　　　　何水林等 : EGTA 和 La3 + 对几种逆境诱导辣椒样半萜环化酶基因表达的影响 　　　　　　　　　
图 4 　EGTA 处理后辣椒叶片中倍半萜环化酶基因 mRNA 的合成和积累
Fig. 4 Induction of sesquiterpene cyclase mRNA in EGTA treated Capsicu2
um annum leaves. The leaves were collected at the indicated time points for
total RNA isolation ; total RNA sample (5μg) were size fractioned by elec2
trophoresis and transferred to nylon membranes ,then probed with SCCCA
# 1 , the blot was Ⅹautographed for 72h.
4 　讨 　　论
411 　Ca2 +信使系统
Ca2 + 在生物许多信号传递过程中充当第二信使
作用 ,耦联细胞外信号与胞内生理生化反应. 植物细胞
在外界真菌或其它诱发因子或逆境作用下 ,产生跨细
胞膜的 Ca2 + 流 ,使细胞内 Ca2 + 骤升 ,Ca2 + 与钙调蛋白
结合 ,激化其它蛋白质如磷酸激酶 ,由此启动植物体内
一系列反应 ,包括植物的防御反应如植保素的合成等.
前人对植物防御反应研究表明钙离子信使系统参与了
植物对外界诱导响应的信号传递链节[3 ,10 ] ,例如 ,用
Ca2 +拮抗剂处理烟草悬浮细胞能阻止 Cryptogein 对
细胞间隙的碱化、活性氧的产生和植保素 Capsidiol 的
合成等后续反应[8 ] . 用紫外线、CuCl2 、HgCl2等诱发因
子处理离体辣椒叶片 ,发现这些诱发因子能诱导辣椒
叶片表达辣椒倍半萜植保素生物合成过程中关键酶倍
半萜环化酶活性 ,各种诱发因子在诱导辣椒倍半萜环
化酶的最初反应上有一定差异 ,例如活性氧的产生是
植物较早发生的响应之一 ,并认为参与植物防御基因
表达的诱导 ,在紫外线处理下活性氧的产生是对细胞
内的抗氧化酶系的影响而导致活性氧的产生和清除之
间的失衡所致 ;但在 CuCl2 、HgCl2 的作用下主要与植
物螯合态的硫醇的形成造成 GSH 含量减少而 GSSG
含量的增加有关[5 ] . 本研究中用 EGTA 和 LaCl3 破坏
辣椒叶片的钙信使系统 ,未能抑制 CuCl2 、HgCl2 和紫
外线对辣椒倍半萜环化酶活性的诱导作用 ,表明跨细
胞膜的 Ca2 + 流的产生并不是以上逆境对辣椒倍半萜
环化酶活性的诱导作用的必不可少的条件. 用 EGTA
处理离体辣椒叶片能诱导离体辣椒叶片表现倍半萜环
化酶基因转录和表达酶活性 ,则进一步支持这一看法.
本研究结果与 Kendra 等人的结果一致[6 ] . 由于钙信使
系统位于各种诱发因子诱导植物抗性反应的上游 ,如
果该系统是倍半萜环化酶基因诱导表达的必需信号系
统 ,则在该系统被破坏时 ,后续的包括 EGTA 对倍半
萜环化酶表达的促进作用都应该被中断. 因此 ,可以排
除 EGTA 对辣椒倍半萜环化酶基因表达的双重作用
问题. 故推测还有除了钙信使系统外的替代信号传递
途径参与了信号传递.
412 　植物信使系统的启动与诱发因子和目标防御基
因的特异性
钙信号系统的破坏对植物不同防御反应基因表达
的影响有差异 ,而且与所受的诱发因子也有一定关
系[2～4 ] .例如 ,Vogeli 等人用 Ca2 + 或钙调蛋白抑制处理
烟草悬浮细胞 ,能阻止 Phytophthora parasitica 的细胞生
产物对烟草悬浮细胞中倍半萜环化酶基因转录水平及
酶活性均降低 ,但却使 PAL (苯丙氨酸解氨酶)基因转录
水平和酶活性有所提高[2 ] ; Litte ( 1989) 和 Smith 等
(1989) 用 EGTA 和 LaCl3 处理苜蓿悬浮细胞 ,能降低
V . albo2atrum 真菌诱导对 PAL 活性的诱导作用[3 ] . 这
些研究表明不同植物、同一植物不同植保素代谢中 ,钙
信使系统的作用有一定差异. 但迄今为止 ,对各种信号
传递途径及其各环节还有许多未解之谜.
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作者简介 　何水林 ,男 ,1965 年出生 ,博士 ,副教授 ,现主要从事
作物种植制度与植物分子生态学研究. 已发表论文 20 篇. E2
mail :shlhe @pub5. fz. fj. cn
472 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　12 卷