全 文 ：实验研究／论著
狼毒大戟提取液治疗Ｌｅｗｉｓ肺癌机制的探讨
杨柯　王义善　林思祥　仝德勇
滨州医学院附属解放军第１０７医院肿瘤中心，山东 烟台２６４００２
【摘要】　目的：探讨狼毒大戟提取液优化治疗非小细胞肺癌的机制。方法：收集狼毒干预２４ｈ后的细胞，流式细胞技术
分析肿瘤细胞周期及凋亡率；ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测Ｃａｓｐａｓｅ－９ｍＲＮＡ的表达。收集对数生长期细胞接种至Ｃ５７ＢＬ／６小鼠
右侧腋窝下，随机分组，腹腔给药后计算抑瘤率；流式细胞技术分析肿瘤细胞周期及凋亡率；ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测Ｂｃｌ－２
ｍＲＮＡ和Ｂａｘ　ｍＲＮＡ的表达，抗氧化能力检测法检测ＣＡＴ和ＳＯＤ的表达。结果：体内外实验显示，狼毒大戟能明显促
进肿瘤细胞的凋亡，将细胞周期阻滞在Ｓ期，并能明显促进Ｂａｘ　ｍＲＮＡ、抑制Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ的表达；体内实验也显示狼毒
大戟可以明显提高机体抗氧化能力。结论：狼毒大戟在促进肿瘤细胞凋亡的同时可以提高机体抗氧化能力，充分体现了
狼毒大戟优化治疗肿瘤的优势，前景广阔，值得进一步研究，为临床应用提供依据。
【关键词】　狼毒大戟；Ｂｃｌ－２；Ｂａｘ；凋亡；周期；优化治疗
中华肿瘤防治杂志，２０１２，１９（１８）：１３７２－１３７６
Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｒｅａｔｉｎｇ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ＬＤＥ　ｆｏｒ　Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ
ＹＡＮＧ　Ｋｅ，ＷＡＮＧ　Ｙｉ－ｓｈａｎ，ＬＩＮ　Ｓｉ－ｘｉａｎｇ，ＴＯＮＧ　Ｄｅ－ｙｏｎｇ
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｏ．１０７　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　ＰＬＡ　Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　ｔｏ　Ｂｉｎｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ　２６４００２，Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ
［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］　ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ：Ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　Ｌａｎｇ－ｄｕ　ｅｘｔｒｃｔ（ＬＤＥ）ｆｏｒ　Ｌｅｗｉｓ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ．ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｂｙ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ，Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＬＤＥ　ｉｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　２４ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｎ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ
ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ；Ｔｈｅ　ｍＲＮＡ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂａｘ　ｗｅｒｅ　ａｓｓｅｓｓｅｄ　ｂｙ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ
ＰＣＲ．Ｃ５７ＢＬ／６ｍｉｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ　ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｒｉｇｈｔ　ｌｉｍｂ　ｏｆ　１×１０６　Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌｓ　ｐｅｒ　ｍｉｃｅ．Ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎ－
ｔｅｄ，ｔｈｅ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｅｄ　ｉｎｔｏ　２ｇｒｏｕｐｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ＬＤＥ　ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ　ＬＤＥ　ｇｒｏｕｐ　ｗｅｒｅ　ｇｉｖｅｎ　ＬＤＥ　ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｉｎｊｅｃ－
ｔｉｏｎ．Ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｏｆ　ｍｉｃｅ　ｗｅｒｅ　ｋｉｌｅｄ　ａｆｔｅｒ　７ｄａｙｓ，ｔｈｅｎ，ｔｕｍｏｒ　ｗｅｒｅ　ｔａｋｅｎ　ｏｆｆ，ｔｈｅｙ　ｗｅｒｅ　ｗｅｉｇｈｅｄ　ｆｉｒｓｔｌｙ　ｆｏｒ　ｍｅｓｕｒｅ－
ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ，ａｐｏｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ，ａｎｄ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｗｉｔｈ　ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；Ｂｃｌ－２ａｎｄ　Ｂａｘ　ｍＲＮＡ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ　Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ＰＣＲ；Ｓｏｍｅ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ａｂｏｕｔ　ｌｉｐｉｄ　ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ＳＯＤ，ＧＳＨ－Ｐｘ　ａｎｄ　ＣＡＴ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ．ＲＥＳＵＬＴＳ：Ｉｎ
ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｅｘｐｅｒｅｍｅｎｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＬＤＥ　ｃｏｕｌｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｂｌｏｃｋ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｔ　Ｇ０／Ｇ１
ｐｈａｓｅ；Ｒｅａｌｔｉｍｅ　ｐｃｒ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　Ｂａｘ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｗａｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ａｎｄ　Ｂｃｌ－２ｒｅｄｕｃｅｄ；Ｃｏｍｅｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌ
ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ　ｓｈｏｗｓ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＣＡＴ，ＳＯＤ，ＧＳＨ－Ｐｘ　ｖａｌｕｅ．Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＬＤＥ　ｃｏｕｌｄ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｄｕｃｅ　ａｐ－
ｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｔ　Ｇ０／Ｇ１ｐｈａｓｅ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮＳ：Ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　Ｃａｓｐａｓｅ－９ｅｘｐｒｅｓ－
ｓｉｏｎ　ｌｅｖｅｌ　ｍａｙ　ｐｌａｙ　ａｎ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌ　ａｐｏｔｏｓｉｓ．ＬＤＥ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｌｅｗｉｓ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ　ｅｎ－
ｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ．
［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］　Ｌａｎｇ－ｄｕ　ｅｘｔｒａｃｔ；Ｂｃｌ－２；Ｂａｘ；ａｐｏｐｔｏｓｉｓ；ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ；ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｔｒｅａｔｉｎｇ
Ｃｈｉｎ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｐｒｅｖ　Ｔｒｅａｔ，２０１２，１９（１８）：１３７２－１３７６
【中图分类号】　Ｒ７３４．２　　　【文献标识码】　Ａ　　　【文章编号】　１６７３－５２６９（２０１２）１８－１３７２－０５
【基金项目】　全军科技攻关项目（０６Ｇ０３４）
【第一作者简介】　杨柯，女，内蒙古通辽人，硕士，主要从事肿
瘤的中西医结合治疗研究工作。
Ｔｅｌ：８６－５３５－２９３３５１８　Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｎｇｋｅ０９２３０９２３＠１２６．ｃｏｍ
【通讯作者简介】　王义善，男，山东烟台人，主任医师，教授，博
士生导师，主要从事肿瘤的中西医结合治疗研究工作。
Ｔｅｌ：８６－５３５－２９３３５５９　Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｙｓ＠１０７ｚｌｚｘ．ｃｏｍ
　　狼毒大戟（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ　Ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎａ　Ｓｔｅｕｄ）为大戟
科植物狼毒大戟和月腺大戟的根，始载于《神农本草
经》，具有散结、逐水、止痛、杀虫的功效。长期的临床
研究发现，狼毒具有光谱抗肿瘤的作用，狼毒大戟提取
液对体外多种肿瘤的增殖具有较强抑制作用［１－３］。目
前关于狼毒在肺癌抗肿瘤分子机制方面研究鲜见。本
实验旨在探讨狼毒大戟提取液优化治疗Ｌｅｗｉｓ肺癌的
作用机制，以期为指导临床治疗非小细胞肺癌（ｎｏｎ－
ｓｍａｌ　ｃｅｌ　ｌｕｎｇ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＮＳＣＬＣ）提供科学依据。
·２７３１· 杨柯，等　狼毒大戟提取液治疗Ｌｅｗｉｓ肺癌机制的探讨
DOI:10.16073/j.cnki.cjcpt.2012.18.005
１　材料与方法
１．１　实验动物与细胞株
６～８周龄 Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠，雄性，体质量１９～
２２ｇ，购自北京大学。实验动物饲养于ＩＶＣ系统。鼠
源性Ｌｅｗｉｓ肺癌细胞株购自中科院，常规体外培养用
于体外实验，取对数生长期细胞皮下接种于Ｃ５７ＢＬ／
６Ｊ小鼠，用于体内实验。
１．２　主要试剂与仪器
ＤＭＥＭ 培养基、胎牛血清和胰酶消化液均购自
Ｈｙｃｌｏｎｅ公司；Ａｎｎｘｉｎ－ⅤＦＩＴＣ／ＰＩ双染试剂盒、细胞
周期检测试剂盒和抗氧化能力检测试剂盒均购自
Ｇｉｂｃｏ公司；ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ试剂盒购自Ｔａｋａｒａ公司。流式
细胞仪：ＢＤ 公司；ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ－ＰＣＲ：Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ３０００；
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＫ３酶标仪：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ公司；ＩＭ－
ＡＧＥ－ＰＲＯＰＬＵＳ图像分析系统：北京市六一仪器厂。
１．３　狼毒大戟提取液的研制
选用狼毒大戟为制剂原料，将狼毒粉碎后与８８％
乙醇按１∶１０混合，５０℃，不断搅拌，浸泡２ｈ，冷沉淀
后用滤纸过滤，滤过液回收乙醇至１／１０后，用中空纤
维超滤装置超滤，超滤液再次回收乙醇。由于脂溶性
成分有一定的毒性，水溶性成分毒性较小，本研究用高
浓度乙醇除去挥发油（脂溶性部分），再经过较长时间
的水沉，以完全去除水不溶性成分保留水溶性成分，降
低毒性。制成２ｇ（相当中药）／ｍＬ制剂，经过相关药
理学与毒理学试验，确定质量标准，取得济南军区制剂
准许（济联制字２０００ＢＭ０８０４６）。经过分析得知，狼毒
大戟提取液制剂所含化学成分有岩大戟内酯（ｊｏｌｋｉｎｏ－
ｌｉｄｅ）Ａ、Ｂ，黄酮类，狼毒大戟甲、乙素（ｆｉｓｃｈｅｒｉａｎａ　Ａ，
Ｂ），大戟醇（ｅｕｐｈｏｌ）、皂苷、强心苷、甾醇、酚类及鞣
质等。
１．４　造膜
１．４．１　细胞培养　小鼠Ｌｅｗｉｓ细胞用含１０％胎牛血
清的ＤＭＥＭ培养液于３７℃、５％ ＣＯ２ 恒温培养箱中
培养。细胞铺满培养皿时胰酶消化传代。
１．４．２　体外实验　收集对数生长期细胞并计算，接种
到６孔板中使每孔中细胞数为５×１０４ 个。待细胞贴
壁后随机分组并进行药物干预，使狼毒的终浓度分别
为０、０．０５、０．２、０．４、０．８和１．２ｍｇ／ｍＬ，每组设３个
复孔，继续常规培养２４ｈ收集细胞进行体外实验。
１．４．３　体内实验　取对数生长期细胞接种于小鼠右
侧腋下，６只／组，５×１０６ 个／只，待瘤体平均大小生长
至１ｃｍ×１ｃｍ×１ｃｍ时随机分组，狼毒大戟提取液组
给予腹腔注射狼毒大戟提取液（１２．５ｍｇ／ｋｇ）、空白组
腹腔注射等量生理盐水，１次／ｄ，连续治疗７次后，各
组小鼠眼眶采血并处死小鼠，取出瘤体，称取质量并记
录结果，进行实验时制成单细胞悬液。
１．５　Ａｎｎｅｘｉｎ－ⅤＦＩＴＣ／ＰＩ双染法检测细胞凋亡
离心收集各组细胞，２　０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，离心
半径１３．５ｃｍ，弃培养基。用冷ＰＢＳ洗涤细胞２次，每
次２　０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，离心半径１３．５ｃｍ。用
４００μＬ　１×Ａｎｎｅｘｉｎ－Ⅴ结合液悬浮细胞，浓度大约为
１×１０６　ｃｅｌｓ／ｍＬ。在细胞悬浮液中加入５μＬ　Ａｎｎｅｘ－
ｉｎ－ⅤＦＩＴＣ染色液，后于２～８ ℃避光条件下孵育
１５ｍｉｎ。加入１０μＬ　ＰＩ染色液后轻轻混匀于２～８℃
避光条件下孵育５ｍｉｎ，流式细胞仪检测细胞凋亡。
１．６　细胞周期检测
离心收集各组细胞，冷ＰＢＳ洗细胞２次，后加入
预冷７０％乙醇并均匀震荡，制备成单细胞悬液，４℃固
定过夜，冷ＰＢＳ洗涤细胞２次。０．４ｍＬ　ＰＢＳ重悬细
胞，后加入 ＲＮＡ 酶至终浓度５０μｇ／ｍＬ，３７℃孵育
３０ｍｉｎ，加入ｌＰＩ染液至终浓度６５μｇ／ｍＬ，４℃避光条
件下孵育３０ｍｉｎ。流式细胞仪检测细胞周期相分布。
１．７　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ和Ｂａｘ　ｍＲ－
ＮＡ的表达
收集各实验组细胞，ＲＮＡｉｓｏ　Ｐｌｕｓ提取总 ＲＮＡ，
核酸分析仪检测ＲＮＡ纯度，Ａ２６０／Ａ２８０在１．８～２．２，证
明ＲＮＡ纯度好。取１μｇ反转录成ｃＤＮＡ。引物由大
连宝生物工程公司合成。Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ上游引物序列
为 ＧＡＴＴＧＴＧＧＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＴＴＣ，下游引物序
列为 ＡＣＴＣＡＴＴＣＡＡＣＣＡＧＡＣＡＴＧＣＡＣ。ＢａｘｍＲ－
ＮＡ上游引物序列为ＧＡＧＡＣＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴ－
ＴＧ，下游引物序列为 ＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＡ－
ＣＡＴ。选取ＳＹＢＲ○ＲＰｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（２×）１０．０μＬ、
ＰＣＲ　Ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ）０．４μＬ（终浓度
０．２μｍｏｌ／Ｌ）、ＰＣＲ　ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ（１０ μｍｏｌ／Ｌ）
０．４μＬ（终浓度０．２μｍｏｌ／Ｌ）、ＤＮＡ模板２．０μＬ和
ｄＨ２Ｏ　７．２μＬ配制反应体系。Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ反应程
序：１）预变性９５℃３０ｓ；２）ＰＣＲ反应９５℃５ｓ，６０℃
２０ｓ，４０个循环；３）溶解曲线分析。
１．８　抗氧化能力检测
分别取阴性对照组、狼毒组的血清，用比色法测定
ＳＯＤ、ＧＳＨ－ＰＸ和ＣＡＴ活力值。
１．９　统计学方法
采用ＳＰＳＳ　１０．０进行方差分析，数据用ｘ－±ｓ表
示。检验水准α＝０．０５。
２　结果
２．１　体外实验
２．１．１　Ａｎｎｅｘｉｎ－ⅤＦＩＴＣ／ＰＩ双染检测结果　阴性对
照组及０．０５、０．２、０．４、０．８和１．２ｍｇ／ｍＬ组凋亡率分
别为（５．８８±０．９６４）％、（８．３０±０．２０）％、（１３．９５±
０．２５）％、（２５．４６±０．３３）％、（３２．３４±０．８６）％ 和
（４３．８８±０．２３）％。与阴性对照组相比，差异有统计学
·３７３１·中华肿瘤防治杂志２０１２年９月第１９卷第１８期　　ＣＨＩＮ　Ｊ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＲＥＶ　ＴＲＥＡＴ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１２，Ｖｏｌ．１９　Ｎｏ．１８
意义，Ｆ＝３　１８８．３２０，Ｐ＝０．００；各实验组之间相比，差
异有统计学意义，Ｐ＝０．００（图１）。实验结果表明，狼
毒大戟提取液能够明显促进Ｌｅｗｉｓ细胞的凋亡，且随
着狼毒浓度的升高，凋亡率逐渐增加。
２．１．２　细胞周期检测结果　对照组Ｇ０／Ｇ１ 峰前无亚
二倍体峰出现，各实验组Ｇ０／Ｇ１ 峰前可见亚二倍体峰
出现，即凋亡峰，且凋亡率随着浓度的升高而逐渐增
加，阴性对照组及０．０５、０．２、０．４、０．８、１．２ｍｇ／ｍＬ组
Ｇ１／Ｇ０ 期细胞比率分别为（４７．１０±２．８８）％、（５３．６３±
０．９４）％、（５５．４４±０．７６）％、（６０．１８±１．００）％、
（６４．１３±０．７７）％和（６５．６４±０．４４）％。各实验组与对
照组相比，差异有统计学意义，Ｐ＜０．０５（图２）。细胞
阻滞发生在Ｇ１／Ｇ０ 期。
·４７３１· 杨柯，等　狼毒大戟提取液治疗Ｌｅｗｉｓ肺癌机制的探讨
２．１．３　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ检测结果　不同浓度狼毒大戟
提取液作用 Ｌｅｗｉｓ细胞２４ｈ后阴性对照组及０．０５、
０．２、０．４、０．８和１．２ｍｇ／ｍＬ组Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ相对表
达量分别为１．０３±０．０９、０．５８±０．０３、０．４６±０．０４、
０．３７±０．０３、０．３６±０．０３和０．３２±０．０３，各实验组与
对照组相比，差异有统计学意义，Ｐ＜０．０５。Ｂｃｌ－２
ｍＲＮＡ变达逐渐降低，且随着浓度的升高而逐渐降
低。不同浓度狼毒大戟提取液作用Ｌｅｗｉｓ细胞２４ｈ
后，阴性对照组及０．０５、０．２、０．４、０．８和１．２ｍｇ／ｍＬ
组 Ｂａｘ　ｍＲＮＡ 相对表达量分别为 １．００±０．２３、
１．３２±０．１９、２．２４±０．１１、３．８５±０．４０、３．９０±０．２８和
５．０２±０．５３。各实验组与对照组相比，差异均有统计
学意义，Ｐ＜０．０５。Ｂａｘ　ｍＲＮＡ变达随着浓度的升高
而升高。
２．２　体内实验
２．２．１　狼毒治疗后小鼠移植瘤大小的变化　实验结
束后，颈椎脱臼法处死小鼠，完整剖取肿瘤，称取瘤质
量。阴性对照组和狼毒组平均瘤质量分别为（３．３１１±
０．１８４）和（２．２０９±０．６０９）ｇ，平均抑瘤率为３３．３８％，
提示Ｌｅｗｉｓ移植瘤的生长受到明显抑制。
２．２．２　狼毒大戟对移植瘤小鼠Ｌｅｗｉｓ细胞凋亡的影
响　对照组与狼毒大戟提取液组细胞凋亡率分别为
２．８２％和１７．８２％，狼毒大戟提取液组细胞凋亡率明
显提高（图３）。
Ａ：阴性对照组；Ｂ：狼毒大戟提取液组
图３　Ｌｅｗｉｓ小鼠移植瘤细胞凋亡率的变化
２．２．３　狼毒大戟对移植瘤小鼠Ｌｅｗｉｓ细胞周期的影
响　阴性对照组、狼毒大戟提取液组Ｇ０／Ｇ１ 期细胞比
率分别为５４．４３％和６０．４４％，Ｓ期细胞比率分别为
３３．５３％和２９．５１％且狼毒组凋亡峰明显增大（图４）。
Ａ：阴性对照组；Ｂ：狼毒大戟提取液组
图４　Ｌｅｗｉｓ小鼠移植瘤细胞周期的影响
２．２．４　狼毒大戟对移植瘤小鼠Ｂｃｌ－２ｍＲＮＡ和Ｂａｘ
ｍＲＮＡ的影响　阴性对照组与狼毒大戟提取液组
Ｂａｘ　ｍＲＮＡ和Ｂａｘ　ｍＲＮＡ相对表达量分别为１．０７±
０．０８７和１．８４±０．０９，Ｆ＝１１０．０８５，Ｐ＝０；Ｂｃｌ－２ｍＲ－
ＮＡ相对表达量分别为１．０５±．０５６和０．７４±０．１４７，
差异有统计学意义，Ｆ＝１１．２１５，Ｐ＝０．０２９。
２．２．５　狼毒大戟对Ｌｅｗｉｓ小鼠抗氧化能力的影响　
阴性对照组与狼毒大戟提取液组ＳＯＤ活力值分别为
１１０±１１ 和 ２１８±１１，差 异 有 统 计 学 意 义，Ｆ＝
２９５．７８６，Ｐ＝０；ＧＳＨ－Ｐｘ活力值为１４７±７和２００±
１０，差异有统计学意义，Ｆ＝１１１．４９８，Ｐ＝０；ＣＡＴ活力
值分别为１３３±１３和２３１±１０，差异有统计学意义，
Ｆ＝２０２．０４７，Ｐ＝０。
３　讨论
ＮＳＣＬＣ是最常见的恶性肿瘤之一，其中在欧美国
家非小细胞肺癌占肺癌发病率的７０％～８０％，在我国
则高达８０％～９０％，并且呈明显上升的趋势［４］。放化
疗是ＮＳＣＬＣ的有效治疗手段，但其毒副作用不容忽
视，往往伴随着患者免疫功能低下从而加快肿瘤转移，
使病情难以控制。随着中国传统医学与现代医学的发
展，中西医结合治疗肿瘤已经逐渐被人接受并广泛应
·５７３１·中华肿瘤防治杂志２０１２年９月第１９卷第１８期　　ＣＨＩＮ　Ｊ　ＣＡＮＣＥＲ　ＰＲＥＶ　ＴＲＥＡＴ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　２０１２，Ｖｏｌ．１９　Ｎｏ．１８
用于临床，医学界也提出了以补充替代医疗目的的治
疗研究［５］。
狼毒大戟为大戟科植物狼毒大戟的根，具有散结、
逐水、止痛、杀虫的疗效。研究发现，０．０５ｍｇ／ｍＬ浓
度的狼毒就能够通过上调Ｂａｘ，及抑制Ｂｃｌ－２而明显促
进黑色素Ｂ１６小鼠移植瘤的增殖与凋亡且随着浓度
的增大作用增强，并且能够提高小鼠ＩＬ－２的表达［６］。
细胞凋亡是机体维持稳定的重要保护机制之一，
当细胞凋亡机能降低时，肿瘤发生率就会增加［７－８］。本
次体内外实验结果表明，狼毒大戟可以明显促进Ｌｅｗ－
ｉｓ细胞凋亡，并且具有细胞周期阻滞作用，将细胞阻滞
在Ｇ０／Ｇ１ 期，阻滞细胞进入Ｓ期及Ｇ２／Ｍ 期，进而抑
制肿瘤细胞ＤＮＡ的合成，抑制细胞增殖。
增殖失控时肿瘤细胞的一个显著特点，正常细胞
的增殖和凋亡同时存在并受到严格控制。与正常细胞
相比，肿瘤细胞丧失了增殖与凋亡平衡的调控以及对
周围环境凋亡信号的敏感性，其中一个突出表现就是
Ｂｃｌ－２家族成员在肿瘤中的表达出现异常，即抑凋亡蛋
白上调和促凋亡蛋白Ｂａｘ下调或失活［９－１２］。本实验表
明，狼毒大戟可以明显下调Ｂｃｌ－２的表达水平并上调
Ｂａｘ的表达水平，充分说明了狼毒大戟的促凋亡作用。
研究发现，包括肿瘤在内的许多疾病与氧自由基
有着密切关系［１３］。正常情况下机体体内存在清除自
由基、抑制自由基反应的抗氧化体系，能够清除过多的
自由基，这些体系包括ＳＯＤ、ＣＡＴ、ＧＳＨ－Ｐｘ等。如果
这一体系遭到破坏，则过多的自由基直接作用于机体
免疫系统［１４］，致机体损伤，导致各种癌症发生或加重
肿瘤的发展［１４－１５］。本实验表明，狼毒大戟提取液可以
明显提高Ｌｅｗｉｓ小鼠ＳＯＤ、ＣＡＴ和ＧＳＨ－Ｐｘ值，显示
了狼毒较好的提高机体抗氧化能力的作用。
因此，推测狼毒可以通过多种途径在诱导细胞凋
亡的同时提高机体抗氧化能力，是一种很有前景的抗
癌药物，值得进一步研究。
【参考文献】
［１］　王义善，姜鹏，马建军，等．中药合剂灌注ＲＦ透热联合ＳＦＲ治疗
肿瘤的临床研究［Ｊ］．世界肿瘤杂志，２００５，４（４）：３９．
［２］　王义善，郑秋生，贾喜风，等．狼毒抑制降低癌细胞恶性表型小鼠
体内转移及彗星电泳实验研究［Ｊ］．中医杂志，２００６，４７（２）：１４８－
１４９．
［３］　王义善，郑秋生，姜鹏，等．狼毒水提液抗肿瘤的实验研究［Ｊ］．中
华医学进展杂志，２００６，４（６）：１．
［４］　熊勇，周同冲，刘源，等．多西他赛联合顺铂同步放化疗治疗局部
晚期非小细胞肺癌的疗效分析［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１０，
１７（９）：６９９－７０２．
［５］　Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ　Ａ，Ｎａｒｅｎｄｅｒ　Ｔ，Ｋｕｍａｒ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ａｌｉｕｍｓａｔｉｖｕｍ
ｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓ：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｆｒｅｅ　ｒａｄｉｃａｌ　ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ　ｎｅｕｔｒｏ－
ｐｈｉｌｓ［Ｊ］．Ｃｅｌ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（Ｎｏｉｓｙｌｅｇｒａｎｄ），２００７，５３（５）：６３－６７．
［６］　Ｗａｎｇ　Ｌ，Ｄｕａｎ　Ｈ，Ｗａｎｇ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｌａｎｇ－ｄｕ
ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｓ　ａｎｄ
ｉｔｓ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，
６２（４）：３５７－３６６．
［７］　廖子君，宋永春，陈晓泉．大黄素对人肺腺癌 Ａ－５４９细胞增殖周
期影响的实验研究［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２００７，１４（５）：３４２－
３４４．
［８］　林蕾，刘素荣，叶孟，等．家族性圆柱瘤过表达对槲寄生凝集素诱
导ＨＣＴ１１６细胞凋亡的影响［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１０，１７
（１５）：１１７２－１１７５．
［９］　Ｈｕａｎｇ　Ｙ，Ｌｉｕ　Ｑ，Ｌｉｕ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｉｇｈｌｙ－
ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　ｂｙ　ｎｏｒｃａｎｔｈａｒｉｄｉｎ　ａｎｄ　ｉｔｓ
ｍｅｃｈｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，５９（３）：２０１－２０８．
［１０］　Ｇｕｐｔａ　Ｓ，Ａｆａｑ　Ｆ，Ｍｕｋｈｔａｒ　Ｈ．Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｆａｃｔｏｒ－ｋａｐ－
ｐａ　Ｂ，Ｂａｘ　ａｎｄ　Ｂｃｌ－２ｉｎ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｅｌ　ｃｙｃｌｅ　ａｒｒｅｓｔ　ａｎｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｂｙ　ａｐｉｇｅｎｉｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｐｒｏｓｔａｔｅ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，
２００２，２１（２３）：３７２７－３７３８．
［１１］　Ｇｏｈ　ＰＰ，Ｓｚｅ　ＤＭ，Ｒｏｕｆｏｇａｌｉｓ　ＢＤ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｒｅｇｕｌａ－
ｔｏｒｓ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｔａｒｇｅｔｓ，２００７，
７（８）：７４３－７５８．
［１２］　Ｅｄｅｒ　ＪＰ，Ｖａｎｄｅ　Ｗｏｕｄｅ　ＧＦ，Ｂｏｅｒｎｅｒ　ＳＡ，ｅｔ　ａｌ．Ｎｏｖｅｌ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃ－Ｍｅｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｉｎ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ，２００９，１５（７）：２２０７－２２１４．
［１３］　Ｇｒｅｓｐｏ　Ｌ，Ｇａｒｃｉａ－Ｍｅｄｉａｖｉｌａ　ＭＶ，Ａｌｍａｒ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ
ｏｆ　ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ　ｏｎ　ｒｅａｃｔｉｖｅ　ｏｘｙｇｅｎ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｇｅｎｅｒａｔｏｎ　ａｎｄ
ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏ－
ｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　ｉｎ　Ｃｈａｎｇ　Ｌｉｖｅｒ　ｃｅｌｓ［Ｊ］．Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ　Ｔｏｘｉｃｏｌ，２００８，４６
（５）：１５５５－１５６９．
［１４］　万利．自由基的产生对运动疲劳的影响及其恢复机制［Ｊ］．河北
体育学院学报，２００４，１８（１）：２１－２２．
［１５］　Ｌｉｎ　ＪＫ，Ｔｓａｉ　ＳＨ．Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ
ｄｉｓｅａｓｅ　ｂｙ　ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ｓｃｉ　Ｃｏｕｎｃ　Ｒｅｐｕｂ　Ｃｈｉｎａ　Ｂ，
１９９９，２３（３）：９９－１０１．
收稿日期：２０１２－０６－２０　修回日期：２０１２－０８－２５
（编辑：边莉）
·６７３１· 杨柯，等　狼毒大戟提取液治疗Ｌｅｗｉｓ肺癌机制的探讨