全 文 ：19 98
,
7 ( 3 ) 福建分析测试 8 8 5
凤凰木种子毒蛋白的高效液相色谱研究
吴红京 王文忠 唐根源
(中国科学院福建物质结构研究所 , 福州 3 5 0 0 0 2 )
摘 要 本文介绍用 H P G F c 对凤凰木种子中提取的三种毒蛋白分别进行色谱分析 。 并对分离
的蛋白峰进行紫外光谱扫描来确认蛋白的纯度 。 根据标准分子量曲线 , 分别得到它们的分子量并
与 SDS 一 P A G F 所得分子量进行比较 , 用柱后衍生法测定了三个蛋白各自的氨基酸组成 。
关键词 凝胶过滤色谱 , 光电二极管阵列检测器 、 蛋白 、 凤凰木种子
1 前 言
凤凰木 ( D el on ix : ge ia ) 属豆科类 , 是一种生长在热带和亚热带地区的一种中型树木 。 4
一 5 月份开红色的花 , 10 月结果 , 初春果实成熟后 , 就得到灰色的长型结荚种子 。 花和种子
都有毒 , 有人证明小孩吃了它的种子 , 会引起腹部疼痛 , 以及消化系统的腹泻和头疼 。 用水
提取树皮或茎的汁液在猴子和猫的身上显示呕吐性和中枢神经系统压抑效应 〔` 一 之〕。 因此 , 我们
对植物毒蛋 白做了一些研究工作之后〔卜 `〕 , 又选择了凤凰木种子为研究对象 , 并从中分离出三
种毒蛋白组分 R l 、 R Z、 R 3 。
2 实验部分
2门 种子的预处理
用砂布将坚硬的种子擦净 , 去掉种子外面的壳 , 然后将种子浸泡在水中一昼夜 , 使之膨
胀 , 剥去种子的皮 , 去皮的种子干燥后 , 于 4 C 贮存 , 备用 。
2
、
2 毒蛋白粗提液的制备
将 50 克去皮的种子经粉碎机碾磨成粉后 , 浸泡在 5 0 m I J 20 m m ol / L 含有 9% N a CI 的磷
酸盐缓冲液中 (P B s p H 7 , 2 ) , 匀浆 , 静止过夜 , 装入布袋 , 用挤压的方法压出水溶液 。 粗提
液用蒸馏水透析 3 x hs , 离心得上清液 , 用 90 %硫酸钱饱和 , 平衡 1 h2 , 沉淀的蛋白在高速离
心 机上 以 1 2 , o o o rP m 速度重新离心 l o m in 后 , 用少量水溶解蛋 白并透析 , 一些不溶物 以
40
,
0 0 0 rP m 速度离心除去 。 (整个过程均在 4 C进行 )
2
.
3 毒蛋白粗提液的分离和纯度鉴定
D E A E
一
S e p h a d e x A
一
2 5 柱 ( 2 . 6又 3 o e m ) 用 l o m m o l / L T r i s /H C I缓冲液 ( p H 7 . 2 ) 平衡后 ,
将粗提液上柱 , 用 3 0 0m L l o m m o l / L T r i S / H C I 缓冲液对 3 0 0m L 内含 0 . s m m o l /L N a C I 的
1 0m m ol L/ rT i
s / H cl 缓冲液 ( p H 7 . 2) 进行等梯度洗脱 , 收集洗脱液 , 收集的洗脱液经多次重
复洗脱收集后 , 上 D E A E 一 5 2 柱 ( 1 . 6只 2 5e m ) , 在 入一 2 8 o n m 处 , 用 l o m m o l / L T r i s /H C I 缓
冲液对内含 0 . 24 m m ol / L N a CI 的 T ir s /H CI 缓冲液等梯度洗脱出三个峰 ( 图 1 ) 。 分别多次收
集三个峰 , 浓缩 , 充分透析至完全去盐后 , 进行冷冻 , 在 F L E X 一 R Y 真空冷冻干燥仪上得到三
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个蛋白的冻干粉 。凤凰木种子中的三个蛋白在
s D S
一
P A G E 电泳带和 IE F 聚焦电泳带上均表
明是纯的 。 用高效凝胶过滤色谱法 (H P G F C )
分别分析得三个单一纯峰 , 我们用光电二极管
阵列检测器对图 2 中提纯后的三个峰的特定
时间分别进行紫外光谱扫描 , 并画出光谱图
(图 3 ) , 三个蛋 白的光谱图在 入= 2 8 0n m 处有
最强吸收 , 在 入二 2 6 0n m 处有弱吸收 , 显示出
明显的蛋白特征光谱 。
A 2 8 0
2
.
0
一占一 ~ 一一一一 - ~占扁二二二二 ~` ` ` 舀` - J O
2 5 0
.
0 5 0 0 0 7 5 0
.
0 10 0 0 0
洗脱体积 ` 二 L )
圈飞
分离柱 :
洗脱液 ;
凤皿木种子毒蛋白粗提液在阳离子
女换柱上的分离
D E A E
一
5 2 ( 1
.
6 火 2 5 em ) ;
缓冲液 (见正文 ) 检测波长 : 280 n m
吸光度 A
` 一一一-一 . ~归涪一一一一一 J一~ , . ~0 10 2 0 m ` r
图 2 凤皿木种子蛋白分别在商效蛋白柱上的分离
色谱柱 : P r o t e in 一 P a k 6 o + P r o t e in 一 aP k 1 25 ( 7 . s e m x
3 c0 rn
,
1 0拌m ) ; 洗脱液 : 0 . Zm m o l / L 磷酸缓冲液 ,
p H 6
.
5 ; 流速 : 0 . s m L / m in ; 检测波长 : 2 8 o n m 。
峰 : a ) : R l ; b ) : R Z ; c ) : R 3 。
2 8 0 36 0
波长 ` n m )
圈 3 圈 2 中峰的光谱田
图中光谱线编号与图 2 中峰编号相同
2
.
4 凤凰木种子毒蛋白分子 , 测定
在对三个蛋 白进行色谱分析的同时 ,绘制
四种标准蛋白 : 牛蛋白 (6 7 , 。0 D ) 、 卵蛋白
( 4 3
,
o o o D )
、 天花粉蛋白 ( 2 7 , o o o D ) 、 溶菌霉
( 14
,
0 o D ) 的标准曲线。 根据三个蛋白的相对
迁移时间 , 从标准曲线上得到三个蛋白 R l 、
R Z
、
R 3 的分子量与从 S D S 一 P A G F 得到的分
子量基本吻合 (表 1 ) 。
衰 1 蛋白分子 l
H P G F C 28
,
8 6 0 26
,
1 0 0 23
.
50 0
SD S
一
P A E A 2 8
,
7 0 0 2 5
,
7 0 0 2 2
,
9 8 0
从表 1 中可见三个蛋白的分子量十分靠近 , 从等电点测试中得知三个蛋白的等电点均在
5
.
2 附近 , 它们之间的差异在 0 . 0 5P H 单位之内 , 因此要区分开是有点困难的 。 这与它们在离
子交换柱上的行为基本一致 。
1 9 9 8
,
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2
.
5 氨基酸组成测定
蛋白经酸水解后 , 用 L C 一 4 A 高效液相色谱仪 , 邻苯二甲醛柱后衍生萤光法测定三个蛋白
的氨基酸组成 (表 2 ) 。 从表 2 中看出它们的组成惊人的相似 , 表明它们可能是同系物并紧靠
在一起 。 表 2 中氨基酸组成只是一部分 , 因蛋白经酸水解后 , 色氨酸被破坏不能测定 , 另外
在酸解过程中 , 谷氨酞胺 ( lG n) 和天门冬酞胺 ( A s n) 分别转化成谷氨酸 (lG u) 和天门冬氨
酸 ( A s p ) 进行合并计算 , 结果以重量百分数转换成克分子比表示 。 R l 、 R Z 、 R 3 的分子量与
H P G F c 测定基本一致 , 根据氨基酸组成 , 可以预测这些蛋白的第二结构 。
3 讨 论
3
.
1 用 H PG F C 分析 , 采用面积归一法分别
测定三个蛋白的纯度为 : R l : 10 % 、 R Z :
97
·
5%
、
R 3
:
91 %
, 这样的纯度对大多数其他
试验是足够了 。
3
.
2 为了得到纯的蛋白 , 粗提液必须重复上
柱 , 多次洗脱收集 , 充分透析去掉杂蛋白 。
3
.
3 由于三个蛋白的分子量非常靠近 , 因此
用两根串联的蛋白柱对它们进行分析 ,可提高
分辨率 。
参 考 文 献
〔1〕 P a n t , U . C . , e t a l . H e r b a P o l . , 1 9 7 2 ; 2 8 : 1 6 0 -
1 6 1
〔2〕 G u p t a , R . K . & C h e n d r a , S , I n d ia n J . P a r rn . ,
1 9 7 1 ; 3 3 ( 4 )
,
7 4
一
7 5
〔3〕 唐根源 , 陈明晃等 . 色谱 , x 9 9 4 ; 一2 ( 4 ) , 2 4 4 -
2 4 6
〔4〕昊红京 , 郝冰等, 色谱 , 1 9 9 7 ; 1 5 ( 2 ) : 1 5 3 一 r 5 5
表 2 R l 、 R Z 、 R 3 氨基酸组成
含量 ( m o l /m o l )氨基酸—R I R Z R 3A la 1 2 . 7 3 ( 1 2 ) 1 1 . 4 0 ( 1 1 ) 3 . 9 4 ( 4 )C y s 0 0 0 ( O ) 0 · 0 0 ( O ) O · 0 0 ( O )A s x 1 8 . 0 7 ( 1 8 ) 1 5 . 4 9 ( 1 5 ) 1 6 . 3 6 ( 1 6 )G lx 3 9 . 0 0 ( 3 9 ) 2 9 . 8 5 ( 3 0 ) 2 4 . 0 7 ( 2 4 )P h e 9 . 5 0 ( 1 0 ) 1 0 . 3 5 ( 1 0 ) 9 . 4 7 ( 9 )G ly 3 8 . 4 0 ( 3 8 ) 3 4· 7 8 ( 3 5 ) 4 4· 8 0 ( 4 5 )H i s 7 . 0 5 ( 7 少 1 0 . 2 8 ( 1 0 ) 9 . 1 9 ( 9 )
I l
e 1 5
.
9 5 ( 1 6 ) 1 5
.
3 2 ( 1 5 ) 1 5
.
5 5 ( 1 6 )
L y s 8
.
5 7 ( 9 ) 1 4
·
1 2 ( 1 4 ) 1 1
·
1 2 ( 1 1 )
L u e 1 5
.
7 5 ( 1 6 ) 1 4
.
3 0 ( 1 4 ) 1 4
.
8 0 ( 1 5 )
M
e
l 4
.
8 0 ( 5 ) 3
.
2 1 ( 3 ) 3
.
6 4 ( 4 )
P r o 0
.
0 0 ( 0 ) 0
.
9 2 ( 1 ) 1 1
.
2 2 ( 1 1 )
A
r g 2 6
.
1 0 ( 2 6 ) 1 5
·
8 7 ( 1 6 ) 1 5
·
6 2 ( 1 6 )
S e r 3 6
.
2 2 ( 3 6 ) 3 2
.
2 9 ( 3 2 ) 1 0
.
9 9 ( 1 1 )
T h
r 6
.
0 5 ( 6 ) 5
.
9 3 ( 6 ) 6
.
9 5 ( 7 )
V a l 1 9
.
8 4 ( 2 0 ) 1 7
.
2 7 ( 1 7 ) 1 7
.
7 5 ( 1 8 )
T
r p N d N d N d
T y r 7
.
2 5 ( 7 ) 8
·
6 7 ( 9 ) 1 4
,
8 0 ( 1 5 )
总 量
分子量 (M W )
N d
: 未检出
2 6 5 2 3 8 2 1 5
2 8
,
8 1 3 2 5
,
8 0 0 2 4
,
0 9 0
8 8 8 福建分析测试 研究报告 1 9 9 8 , 7 ( 3 )
A S t u d y o n t h e P r o t e i n s f r o m S e e d s o f
D e lo n i x r e g i a b y H P L C
W
u H o n g j i n g
,
W
a n g W
e n z h o n g a n d T a n g G e n y u a n
(F u j i a n In s t i t u t e o f R e s e a r e h o n t h e s t r u e t u r e
t h e e h i n e s e A e a d e m y o f S e i e n e e
s 、
F u z h o u
o f M a t t e r
3 50 0 0 2 )
A b s t r ac t F r o m t h e s e e d s o f D e l o n i x r e g i a
,
t h r e e n o v e l t o x i e p r o t e i n s e o n s t i t u e n t s n a m e d
R l
,
R Z
, a n d R 3 h a v e b e e n i s o l a t e d a n d p u r if i e d b y e x t r a e t i o n w i t h 2 0m m o l / L p h o s p h a t e
s a l i n e ( 0
.
9% N a C I ) b u f f e r ( P B S ) a t PH 7
.
2
, a n d D E A E
一
5 2 e e l l u lo s e e o l u m n ( 1
.
6 火 2 5e m )
e h r o m a t o g r a p h y e l u t e d w it h a g r a d i e n t e o s is t i n g o f s a l t
一
f r e e 1 0 m m o l / L T r is / H C I b u f f e r
,
p H 7
.
2 v
.
5
.
0
.
2 4m o l / L N
a e l T r i s / H C I b u f f e r
.
T h r e e p r o t e i n s w e r e f u r t h e r s e p a r a t e d o n p r o
-
t e i n 一 a k 6 o + p r o t e i n 一 p a k 1 2 5 [ 7 . sm m ( I D ) x 3 o e m , 1 0“ m 〕 e o l u m n s . T h e m o b i l e p h a s e w a s
0
.
Zm o l / L p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6
.
5 )
.
T h e f lo w r a t e w a s k e p t e o n s t a n t a t 0
.
sm l /m i n b y
Y S B
一 Zt p y e h i g h p r e s s p u m p
.
T h e e f f l u e n t w a s m o n i t o r e d a t a w a v e l e n g t h o f 2 8 On m o n p h o t o
-
d i d e a r r a y m o n it o r
.
T h e s e t h r e e p r o t e i n s a r e p r o v e d t o b e h o m o g e n e o u s b y SD S
一
P A G E
,
I E F
a n d H P G F C e x P e r im e n t s
.
T h e m o l e e u l a r w e i g h t s o f t h e t h r e e p r o t e i n s a r e e s t im a t e d t o b e
2 8
,
7 0 0 D
,
2 5
,
7O OD a n d 2 2
,
9 8 0D b y S D S
一
P A G E a n d 2 8
,
8 60 D
,
2 6
,
l o 0 D
,
2 3
,
S OOD b y H P G F C
a n a l y s e s r e s p e e t i v e l y
.
T h e i s o e le e t ie p o i n t s o f R l
,
R Z
,
R 3 a r e a r o u n d 5
.
2
.
T h e d i f f e r e n e e b e
-
r w e e n t h e i r i s o e l e e t r ie p o i n t s a r e w l t h i n 0
.
0 5 p H u n l t a n d s o m e h o w d i f f i e u l t t o d is t i n g u i s h
.
T h i s 15 i n a g r e e m e n t w i t h t h e i r e h r o m a t o g r a p h i e b e h a v io r s o n i o n
一 e x e h a n g e e o l u m n
.
T h e
a m i n o a e i d e o m p o s i t i o n s o f t h e t h r e e p r o t e i n s w e r e d e t e r m i n e d w i t h O P A P o s t e o l u m n d e r i v a
-
t i z a t i o n f l u o r e s e e n e e d e t e e t i o n
,
K e y w o r d g e l f i l t r a t io n e h r o nt a t r a p h y
,
p h o t o d i o d e a r r a y m o n i t o r
,
p r o t e i n
, s e e d s o f D e lo n i x
r e g l a