全 文 ：上海免疫学杂志19 8 6年第 6卷第 4期 一 1 3 2
短寿命与刀豆素 A诱导的两种抑制性
细胞功能的比较研究 `
上海市静安区中心医院临床免疫研究室
吕 屏 唐 生杰 姚 光弼
内容提要 本文报告二种抑制性细胞功能的比较研究 。 20例正常人外周血单个核细 胞 C o n人
诱导的抑制率为 3 8 .75 士 1 3 .9 6多 , 10 例正常短寿命抑制细胞的抑制率为 6 8 . 3 士 9 . 4男 。 同步 比较
C o n A 诱导和短寿命抑制性细胞功能 , 二者较为接近 。
抑制性 T 细胞 ( T 。 )在免疫调节中所起的
作用已受到广泛的重视 。 在一些 自身免疫和
免疫缺陷性疾病中 , 存在 T 。 功能的失常 , 临
床上测定 T s 功能 , 以了解 T 。 在疾病的 发
生和发展过程中的变化 , 为有效的免疫治疗
提供科学的依据 。 刀豆素 A (O on A )体外诱
导抑制性细胞是 目前较常用 的方法之一 , 此
法操作较复杂 , 变异因素也多 ,需严格控制实
验条件 。 另一种方法为短寿命 T s 功能测定 ,
此法操作简便 , 容易掌握和推广 。 本文报告
对这二种方法的比较研究 , 并探讨影响测定
结果 的有关因素 。
实 验 方 法
一 、 C o n A 诱导抑制细胞功能洲定 :
(一 ) 诱导相培养 : 按 队ou 法略 加 改
变川 。 肝素外周抗凝血 , 应用淋巴细胞分离
液 (上海试剂二厂 ) 分离单个核细胞 , 洗涤
后用培养液 ( R p M I 1 6 4 0 N i咖 1 S e i了a k a C o
毛记 加 10 % A B 混合血 清 , 3终谷氨 酞胺 ,
1 0 Ou /m l 青霉素和 10 n g / m l 链霉素 ) 调至
细胞浓度 2 x 1 0 . 个 /m l 。 取数个试管 , 加入
上述细胞并同时加入不同浓度的 C o n A (氏g-
m a 0 L td )
, 对照组不加 C o n A , 3 7 o C , 5拓
CO
, 培养 48 小时 。 取出细胞经丝裂霉 素处
理 ( 2 5卜g /m l , 3 7 0 0 , 3 0 分钟 ) , 甲基甘露糖昔
洗涤 , 用培养液调至细胞浓度 1 x 1 0’ 个 / m l ,
为诱导细胞 。
(二 ) 效应相培养 : 同样方法分离的单个
核细胞调至 l x 10 . 个 /班 l 细胞浓度 即 为效
应细胞 。 96 孔培养板 ( iL n b 1’o ) 每 孔 加入
o
.
l m l 的效应细胞和 o . l m l 的诱 导 细 胞及
o n A S峪 。 每组均作三份复管 。 对照组分别
为诱导相的对照细胞或诱导细胞与效应细胞
混合培养 , 但不加 C、 A 。 3 7 o C , 5拓 CO : 培
养 72 小时 , 终止培养前 16 小时 每 孔加入
1林iC ’ R 一T d R 。 多头细胞收集器收集细胞于
玻璃纤维滤纸条上 , 继用 刀射线液闪仪测定
叩m 值 ,取三管均数 。
(三 ) 抑制率计算 : 本文采用二种公式计
算抑制率 。
1
.
S h o u 法 (公式 D :
抑制率
f
_ 。 mP「(霏 十磊 + onC 人 )一 (霏 * 躲)jI
’
{
` 一丽魂瓢盔不司雁瓢霜〕J
减 1阅男
简化公 产三、压一口二口C一又、le卜.1ó (公式 11 ) :
抑制率 = 1 - cmP (霏 十躲 十 onC ` )1
`
, 。 _ _
一~宕二片下井 r 一气二尸 二亡一一了 I 入 上吸入 J ) 乡。 ~ 一 了灯照 双迎 户 。 . ^ 、 .尸” ’ 又细胞 , 细胞 一 “ ” “ “ 月二 、 短寿命 T “ 功能测定 : 按 r e i沙 er y
法 闺 分 离 单 个核 细胞 , 加 培养 液调 至
0
.
5 x 10
. 个 / m l 细胞浓度 , 设立 24 小时 组
和 O小时组 , 二组除加 Con A 的时 间不 同
中国科学院科学基金资助课题
·
2 2 3
.
孟二一丁一一一一工 , 二一二吮
图 i 短寿布 T , 细胞培养顺序
外 , 其他培养条件均一致 (图 1 ) ,对照组不加
C o n A
。
3 7
“
C
, 5% CO
Z ,培养 9 6 小时 , 终止培
养前 16 小时 , 加 . H e T d R I林C i /孔 , 收集细
胞 , c p m 值取三管复管的均值 , 结果 以抑制
指数或抑制率表示 。
抑制指数 二
O
e P m
黔劣+ c o n A 24 小时认卜湘 翻刁
爵数+ oC n A 游笼羞 x 10 男
△。 p nr
择此浓度为效应阶段的最适 C o n A 浓度 。
(三 ) 诱导细胞的洗涤 : 诱导细胞表面易
吸附 C o n A , 如不洗涤干净 , 在效应相培养中
可影响结果 。 本实验把 经 C O n A ( 25 吧 l/ 。 l)
培养 48 小时的淋 巴细胞用三种不 同的 液 体
洗涤 ( 1 ) H a n k s 液 , ( 2 ) 5% 葡萄糖溶液 , ( 3 )
O
.
3M 甲基甘露糖普的 H a n k 。 液 。洗涤后的
细胞再加入 C o n A (对照组不加 C o n A )继续培
养 7 2 小时 , 同样方法收集细胞 , 测定 。 p m 。
结果表明 : 用 H a n ks 液或 5终葡萄糖液洗涤
的细胞 ,对照组仍有一定的增殖 c( Pm 值达四
位数 ) , 而经 甲基甘露糖普洗涤的细胞 , 对照
组基本上不增殖 c( lP n 值仅三位数 ) , 提示前
二种方法未能完全去除吸附的 C o n A , 而 甲
基甘露糖普对洗去细胞表面的 C o n A 比较有
效 , 且不影响细胞对 C o n A 的增殖反应 。
( 四 ) 丝裂霉素的处理 : 诱导细胞经丝裂
霉素处理失去了增殖能力 , 有利于反映效应
细胞的应答 。 为探讨丝裂霉素处理是否对效
应细胞有毒性作用 , 将诱导细胞分为经丝裂
霉素处理和未经丝裂霉素处理二组 , 参于相
同的效应阶段的反应 。 结果 : 经丝裂霉素处
理组的平均抑制率为 4 0 . 6 7% ; 未经丝裂 霉
素处理组的平均抑制率 为 38 . 3 % , 二组抑
制率基本一致 , 表示细胞经丝裂霉素处理不
影响实验结果 。
( 五 ) 不同有丝分裂原对效应相抑 制率
的影响 : 分别用 C o n A 、 P R A 、 卫W M 作为效
应相有丝分裂原 , C o n A 与 P H A 组的结果基
本相同 (表 1) , 而 C o n A 与 P W M 组的结果
不 同 (表 2 ) 。
一
.上
!
.
ll.seL
一制率抑
结 果
一 、 c o n A 诱导 T 。 的方法研究 :
(一 ) 诱导相最适 C o n A 浓度的选择 : 用
不同浓度的 C o n A ( 1 、 5 、 1 2 . 5 、 2 5 、 1 0 0林g /m l )
诱导 , 在 12 . 5 和 2 5林g /m l 浓 度 分 别 出 现
3 2
.
5 士 2 2 . 2 和 3 8 . 4 士 1 5 . 8 的 抑 制 率 , 而
5 0林g / m l 浓度诱导的抑制率最低 。 因此本文
选择 2 5卜g /m l 浓度为诱导 相 最 适 C o n A 浓
度 。
(二 ) 效应相最适浓度的选 择 ; 分 别用
6
.
2 5
、
1 2
.
5
、
2 5
、
5 0“ g /m l C o l l A 刺激健 康人
淋巴细胞 , 其增殖效应随着 C o n 入 浓度的增
加而递增 , 到 25 “ g /m l 浓度时达最高值 , 选
表 1 不同有丝分裂原对效应相抑制率的影响
例 C o n A 诱导细胞 + 效应细胞 + 有针分率 属 ( 、 · p m 土 S D )
(C
, n A (印留孔 ) P W M ( 5卜g 孔 )
对 照 组 实 验 组 抑制率 对 照 组 实 验 组 扣制牟
1 12 9 16 士 7 7 3 8 7 7 6 士 2 7 4 28 落 1 ] 774 士 4 2 6 2 7石7 0土 17 0 3 3 6形
2 8 6 7 7 士 92 3 4 4 2 9 士 1 2 3 1 6 3露 2 6 1田 士 4 98 4 1 2 1 1 6 士 75 0 6 2拐
8 1 2 8 9 8 土 2 17 7 7 6 2 士 2() 3 9 4 1形 28 28 3 士 3 0加 12 0 14 工 3 10 1 4 9落
一
2 3 3
.
表 2 不同有丝分裂原对效应相抑制率的影响
例 C O。人 诱导细胞 +效应细胞 +有丝分裂原 ( ep m士 SD )
C on 人 ( 印 g /孔 )P W M( 10林 g厂孔 )
对 照 组 实 验 组 抑制率 对 照 组 实 验 组 抑制率
10 1 1 9 72 士 0 1 146 7 5 7 36 土 1 12 5 3 1男 如2 2 7士 38 14 如2 8 2 士2 68 7一 0 . 7男
2 6 8 72 0 士 11 16 5 5 1 7 1士68 2 2 1 9男 1 97 1 9土 2 9 7 12 92 4 5士 0 12 2 一 知 男
36 2 7士 4 18 94 775 7土 7 72 2 5男 即8 28 士 44 4 26 9 70 士 10 1一 4 9写
4 1 1(X )6 士 10 18 4 8 92 士 1 1( 3)邱男 6 1 3田 士 16 12 18 3舱 士 6 1 9 7 18 男
6 2 1 10 9土2 1 9 1 16 5 70 士 1 96 32 8 终 6( ) 9 5土68 1 1 124 9土 0 14 8 一 84 络
6 2 32 1 1士 2以6 1 72 2 1生 3 5 7 724 男 7水阳 士 6 7 9 1 504 士4 32 一 10 . 3男
(六 )二种抑制率计算公式 比 较 : 公 式 0 . 2 5、 0 . 5、 i、 2 . 5、 5、 12 . 5、 2 5、 50雌 / ml 等不
1与公式 I不同之处是省略了 对 照 组 的本 同浓度测定短寿命T , 的活性 , 以 0 . 25 一 1鳍 /
底 (效应相不加 C O n A ) 。 用二种公式计算 20 m l 浓度范围内抑制作用最明显 。 本 实验选
例标本的抑制率 , 公式 I 组的平均抑制率为 择 _江协g /m ] 为测定正常人短寿命 T 。 的 最适
36
.
65 土 2
.
72 拓 (M 土 S )D ,公式 1 组的平均 浓度 ,检测 10 例健康正常人 , 其平均抑制率
抑制率为 35 土 2 . 41 那 ( M 士 SD ) 。 二组均 数 为 68 . 3 士 9 . 4那 ( M 土 S D ) , 平均抑 制指数
经 t 检验 , P 值> 0 . 05 , 二种公式计算同一 3 . 4 9 土 1 . 4( M 土 S D o)
标本 的结果差异均在 O~ 5拓范围之内 , 提示 (二 ) 不同有丝分裂原对短寿命 T S的影
二种公式计算的结果无显著差异 。 因此建议 响 : C o n A 、 P H A 、 PW M 都能作为测定短寿
用公式 且 代替公式 I , 实验所需细胞数可减 命 T 。 的刺激原 , 用这三种有丝分裂原同 时
少一半 。 测定三份标本 ,所得结果如下 : C o n A 组平均
(七 ) 正常人 C o n A 诱导 T s 的抑制 率 : _ 抑制率为 78 . n 多 , P H A 组平均抑 制 率为
用 25 协g /m l C匀n A 作为诱导相和效应相的最 5 7 . 0 7终 , P WM 组平均抑制率为 57 . 9% 。
适浓度 , 检测 20 例健康正常人 , 平均抑制率 (三 ) 短寿命 T s 与 C o n A 诱导 T 。 的结
为 38 . 75 士 13 . 96 % (M 士 S D ) 。 果比较 : 用二种检测 T , 功能的方法 , 同时测
二 、 短寿命 T 。 的方法研究 : 定 4 例健康正常人的抑制细胞活性结果用仰
(一 ) 、 最适 Con A 浓度的选择 : 分 别 用 制率加以比较 ,发现二者数据较为接近 (表 3 o)
表 3 短寿命 T “ 与 Co n A 诱导 T s 的结果比较
例 短 寿 命 T s oC n A 诱 导 T s
对 照 组 实 验 组 抑制指数 抑制率 对 照 组 实 验 组 抑制率
1 64 6 4 士 9 9 7 1 0 9 5 8 士 12 6 1
.
8 4 6写 2 7 3 C6 士 42 2 3 1疥6 2 士 5 2 2 8 58 男
2 妞 6 3 士 1苟 4 1 624 1 士 2 6 2 3 3 . 3 7 0万 3 0 9 75 士 3 1 9 3 1 76 68 土 9 1 5 4 7万
3 4 1 4 5 士 3 7 5 13 394 士 1 8 2 0
,
3
.
7 几万 2 32 6 9 士 4 2 2 6 1 3 8 9 6 士肠 0 4 4 7万
4 7 17 7 士 1 1 9 8 1 4 3 9 6 士 7阅 . 2 . 6 6 3万 以3 9工士 2 14 5 1 4 1 3 7 士 1 4 3 6 46 万
讨 论
正常机体的免疫调节包括 T s 、 T 。 、 B 细
胞和巨噬细胞等之间的相互作 用 。 近年 来 ,
T 。 的失调与自身免疫和免疫缺陷性疾病 睑
关系 已受到普遍重视 , 临床上检 测 T s 功能
具有相当重要的意义 。 T 。 的检测包 括数 量
与功能二个方面 。 应用 T 细胞单 克隆抗 体
一
2 34
-
( O KT
、
L e u系统 ), 可以根据 T 细胞亚群表
面标志的不同测定 T s/ T c 和 T H / T : 的 数 量
和比值川 。 测定 T 。 功能的方法 有 C o n A 诱
导法 、 短寿命 T , 、 自发性 T s 和前列腺素依
赖性 T s 等。 目前采用 Oon A 诱导法的报道
较为多见 。 将 T 细胞与 0 0 n A 预先共温 , 再
与新鲜的自体或异体淋巴细胞反应 , 就能明
显地抑制后加入细胞对有丝分裂原的增殖反
应 。 0 0 n A 诱导细胞对棍合淋巴细胞培养 , B
细胞分泌免疫球蛋白均有抑制作用 .c1 。 本实
验室也证实了 C o n A 诱导细胞对自身 、 异体
细胞增殖反应的抑制作用 。 20 例健康正常人
的 T s 平均 抑制 率 为 38 . 7 5 土 1 3 . 9 6终 , 与
S五。 u 等报告的平均抑制率 38 . 38 士 9 . 3 %基
本相同〔且“ 。 Oo n A 诱导法操作步骤较复杂 , 影
响结果的变异因素也很多 , 只有在实验过程
中严格控制实验条件才能使 结果稳 定 、 可
靠闺 。 文献报告 C七n A 诱导抑制细胞的有效
浓度 自 1~ 1 0 吧 / m l 不等 , 本实验室用 jS -g
nz a 的产品在低浓度时 ( < 5昭 /m l) 仅有部
份标本诱导出抑制细胞的活性 , 而较高浓度
的 C o n A ( > 50 协g / m l) , 常使细胞存活率低于
80 终 。 25 协g /m l 浓度时结果比较稳定 , 重复
率高 , 细胞存活率达 95 拓以上 。
短寿命 T s 是指在无有丝分裂原存在 的
情况下 ,淋巴细胞体外堵养 24 小时 , T s 失去
活性或趋 向死亡 , 此时加入 C o n A 刺激其他
亚群的淋 巴细胞 , 出现增殖反应的增强 :.[ 。 反
之 , 培养初期加入 C o n A , 不仅保持而且激活
了 T : 的活性 ,使淋巴细胞增殖反应减弱 。 短
寿命 T s 的测定应选用亚适刺激量 的 Con A
浓度 , 抑制活性较明显 。 短寿命 T s 的活 性
大多数文献都用抑制指数表示 , 本文为了便
于与 co n A 诱导 T s 相 比较 , 同时计数了短
寿命 T s 的抑制指数和抑制率 。
据文献报告 , 被 C o n A 激活的 T 细胞亚
群至少有四种功能 : 细胞毒性 、 对有丝分裂原
的增殖反应 、 抑制性细胞的前身以及对辅助
性 T 细胞的诱导作用 〔. “ 。 尽管目前仍有许多
报道对 oC n A 诱导的 T , 活性持肯 定态度 ,
但已有人否认 Oo n A 诱导 T 。 的存 在闺 。 还
有人认为 Cb n A 诱导出现的抑制现象可能与
T 细胞表面 I L : 受体的表达增强有关 , 从而
使 I L : 消耗 , 导致 T 细胞增殖受抑制 。 有关
这方面的间题还有待于进一步探讨 。 正常人
检侧 T s 活性的结果表明 , C 。。 A 诱导法和短
寿命法测定结果的总趋势基本相似 , 但短寿
命 T 。 的测定并不对 伪 n A 所特异 , 其他 有
丝分裂原 ( P H A , P W M )也能得到 C o n A 相
同的结果 , 这一点与 Oo n A 诱导的 T s 又 有
所不同 。 因此目前还很难说 C o n A 诱导 T s
与短寿命 T , 是否属于同一种 T 细胞或者是
不同的细胞亚群 。 但在目前国内实验室条件
下 , 这二种方法可以作为临床上研究免疫调
节失常的检测指标之一 。 短寿命 T s 的方法
简便易行 ,更适合临床上的推广应用。
( 198 6年 1 0 月 2 1 日收稿 , 1佣石年 2 2 月 1 6 日修回 )
参 考 文 献
[ 1 ] S h
o u L e t a l : J E x P M e d
,
1 43
: 1 1 0
,
1脚6
[ 2 ] T h
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,
7 4: 11 3
,
1佣8
[ 3 〕 R . i n h e r : E L e t a l : J I m m u n o l , 12 : 1 3 3 6 , 1盯9
[ 4 ] D w y
e r J M
e t a l : C ]i n E x P I m m u n o ]
,
38
: 4的 ,
1盯9
[ 石〕 F e ig h e巧 C e t a l : C l i n E x p I nr m u n o l , 32 : 45 9
1 9 78
[ 6 〕 )I w y e r J M e t a ] : C lj n E 盆 P I m m u 刀 0 1 , 46 : 2即 ,
1 98 1
〔 7 ] L o u l s 人 e t a l : J Im m 一了刀。 ] , 1岛: 2 6 7 , 1自欣 )
( 1 98 石年 10 月 2 1 日收稿 , 198 6年 1 月 1 1 日修回 )
一
3 25
-
A C O M PA RA I TS E V TU DY O FS HO R TI L VE DA N DC O NA
I N DC UI B LESU P P REO S S RC E L L FU NC TI O NA S SA Y
Lu P祖g (吕 屏 )e ta l .
C ;感、 介a 乙 Z饥 , “ 肋 10刃凡 s o a护。 h巩感` , 战 a 。妒 a 感J 感。 g 滋 0 。耐: a 乙D落s`犷玄e t H o抄落`。 乙
T址 5 r e OP rt P r e , e n铂 t h e r e o u伽 o f th e me t h de s , i n f l u e i鳍 f a e ot r s a n d o tP i m a l e o dn i-
t i o助 o f 曲 o r t l i 7 e d 叭d C o n ean a l i n A ( C仙 A ) i n d u e ib l e s u P r e s so r e e l l fu n e it o n 删肠 y
.
M叨 y f朗 ot sr 扭 a y 血 f l u ecn o ht e r e su l七 o f C on A i n d u o ib l e s u PP r e朋or e e l l f u n e iot n d et -e
r面 n at i o n , in e ldu in g ht e o扒恤 a l d o s e o f 面 ot g e n , t h e 时i m u l a it 卫9 c e l l s w as ih n g w it h “ -
m e t h y l m an
o
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e 叨 d t r e iat n g w iht 创ot m严讥 , e协 . uB t t h is 绷 a y s y咖 m 拍 r e l时 i v e l y
tS ab l
e
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r印 r od u e i b l e u dn e r o tP im a l e o n d it i o n . T五e s加 rt l v e d 犯 Pp r~
r e e l l aet i
v 此y
朋s a y i , r a比 er , i m lP e a n d e朋 y ot h幼 d l e . T h e 犯 p P r e阳 iv e P e r e e n t ag e o f C o n A i n dcu ib l e
s u p P r e知 r e e l l 运 2 0 on r m a l h e a随 e o n t r o l。 治 3 8 . 7 5 土 1 3 . 9 6拓 , a dn t玩 s u p p r韶。 i v e 那-cr
e n t吧 e an d 皿P r e阳 i n d e x o f s h o rt ]i v ed 犯 P r e朋 o r e e l l i n 1 0 e o nt r o l s a r e 6 8 . 3 土 9 . 4拓
a n d 3
.
4 8 士 1 . 4 r e s P e c t i v e l y .
. 之 5花曰 . `宽 . 翻侣二 , ` 二; . ` 节硬巧曰三石之 与曰右 2 吕韶巴 , 巴 里成巴月品注与官 5 曰 肠王已5 花理三 三三毛三5曰 里获曰生斌己与曰 与口 5己 旦「己 , 币翻 当r 巴三苏艺巴三茹己三萄己 5它 5布己三右三 三抓已 5砚三犷巴巧已
世界卫生组织第 7 届执行委员会关于 I^ D S 规划的决议
世界卫生组织第 7 届执行委员会关于 虹D S 规划 ,于 19 86 年 1 月 17 日在日内瓦作出如下决议 ,敦促各
会员国 :
(1 ) 保持警惕并制定必要的策略以预防和控制 且 D ;S
(2 ) 与 WH O 及其他会员国完全开放地共享信息 , 包括有关 A工D S 的发病、 L A V / H T L V 一工1 的血清学
流行情况 、 实验室方法 、临床经验以及预防和控制 L A V / H r L从 11 的感染 ;
(3) 吁请世界卫生组织对 A I D S 的预防和控制及其它 L A V /H T L V 一 n l 感染 ,给予必要支持。
执委决议中还请求世界卫生组织采取以下行动 :
( 1) 在世界卫生组织 IA DS 规划中进一步开展活动 : -
(a ) 关于 L A v /H T L V 一 I n 的流行病学 、 实验室和临床方面 , 以及预防和控制活动等的情报交换 ,应给
予保证 ;
( b) 准备和分发指导原则 、 手册及教育方面的资料 ;
( e) 评价现有 L A V厂H T L V 一 I n 抗体检测的商品试剂盒 , 发展简单价廉并适合现场应用的试验技术 , 建
立 WH O 参考品 ;
d( ) 与会员国合作 , 发展抑制 L A V /H T L不 11 感染的国家规划 ;
(e) 通知会员国供应安全的血浓和血液制品 ;
( f ) 促进研谬乙工作 , 发展治疗制剂和疫苗 、 猴逆转录病毒 , 以及 L A V /H T L V一 n l 感染的流行病学和有
关表现方面的工作 ;
( g ) 对已经证实在人体早期试验中治疗 A I D S 及 /或 乃J刀G 并发症有效的抗病毒剂及其它药物 , 组织
协作临床试验 ;
(2 )从预算外来源寻求额外经费 ,用以支持国家或集体的规划 , 包括监视和流行病学 、 实验室服务、 临床
研究以及预防和控制。
〔W k ly E p ide m 凡。 , 6 1 (5 ) : 35 , 198 6〕 向建之译
( 1朗 6年 8月 2 5 日收摘 )