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山桃稠李果实花色苷对HepG2细胞抗氧化系统的影响



全 文 :66
山桃稠李果实花色苷
对 HepG2 细胞抗氧化系统的影响
刘 荣,辛 越,何 娇
( 东北林业大学林学院,食品科学,黑龙江哈尔滨 150040)
摘 要:目的:研究山桃稠李果实花色苷对人肝癌细胞( HepG2) 抗氧化系统的影响。方法:质量浓度 0.1~1.2mg /mL的
花色苷作用于 HepG2 细胞,MTT法检测 HepG2 细胞生长抑制率;检测各组细胞内抗氧化酶活性和谷胱甘肽、丙二醛的
含量变化;采用 DCFH-DA探针检测细胞内活性氧( ROS) 含量的变化。结果: 随着花色苷质量浓度的增加,HepG2 细
胞的抗氧化酶( T-SOD、GSH-PX) 活性显著降低;谷胱甘肽( GSH) 含量下降,丙二醛( MDA) 及活性氧的含量上升。结
论:山桃稠李果实花色苷能够明显的降低 HepG2 细胞的抗氧化能力。
关键词:山桃稠李,花色苷,抗氧化,MDA,ROS
Effect of anthocyanins extracted from Prunus maackii
on the antioxidant function of HepG2 cells
LIU Rong,XIN Yue,HE Jiao
( Department of Food Science,College of Forest,Northeast Forest University,Harbin 150040,China)
Abstract: Objective: To study the anthocyanins extracted from Prunus maackii on the antioxidant function of HepG2
cells.Methods: The anthocyanins of different mass concentration extracted from Prunus maackii effect on HepG2
cells,the inhibition rate of anthocyanins on the proliferation of cell was tested by the method of MTT.The activity of
antioxidant enzymes and the content of Glutathione and MDA were tested.The content of ROS by DCFH-DA probe
was tested. Results: As the mass concentration of anthocyanins increased,the activity of antioxidant enzymes
decreased obviously,the content of glutathione decreased and the content of MDA and reactive oxygen species
increased.Conclusion: the anthocyanins extracted from Prunus maackii could significantly impair the antioxidant
ability of HepG2 cells.
Key words: Prunus maackii; anthocyanins; antioxidant; MDA; ROS
中图分类号:TS255.1 文献标识码:A 文 章 编 号:1002-0306(2013)15-0066-04
收稿日期:2013-01-08
作者简介:刘荣( 1972- ) ,女,博士,副研究员,研究方向: 食品营养学
与功能性食品。
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金资助( DL12CA11) 。
山桃稠李(Prunus maackii)又名斑叶稠李,为蔷
薇科稠李属的植物,树干红褐色至亮黄色,叶卵形、
椭圆形、稀有矩圆状倒卵形,叶缘具不规则带腺锐锯
齿,背面沿中脉被短柔毛,被紫褐色腺体。花期 5~6
月,花白色,有清香,总状花序,基部无叶。果实近球
形,果成熟期 7~8月,直径 5~7mm,呈亮黑色。山桃稠
李在我国的西北、华北、东北分布广泛,耐寒性极强,又
因树形以及花絮美观,使其成为了我国北方良好的园
林绿化树种[1]。而山桃稠李的果实富含花色苷,除可
作为色素外[2],本实验室通过研究得其还具有抗氧化、
抗疲劳[3-4]等生理活性。近些年来,花色苷的抗氧化和
抗癌活性研究日益受到人们的关注[5-7],但关于山桃稠
李果实花色苷作用于 HepG2细胞后,对细胞内抗氧化
系统的影响的报道还未见到。本文以 HepG2 细胞为
体系模型,研究不同质量浓度的山桃稠李果实花色苷
作用于 HepG2 细胞后,细胞内抗氧化酶活性,抗氧化
物、MDA以及 ROS的含量变化关系,初步探讨其抗氧
化机制,以期为研究山桃稠李果实花色苷对 HepG2 细
胞抗氧化系统的影响提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
山桃稠李 哈尔滨双环园林采摘;肝癌 HepG2
细胞 哈医大肿瘤医院馈赠;胎牛血清(使用前经
56℃水浴 30min灭活,-20℃备用) 杭州四季青产
品;改良型 RPMI 1640 培养基 赛默飞世尔生物化
学制品有限公司;双抗试剂(100U /mL 青霉素、
100μg /mL链霉素) 北京索莱宝试剂公司;胰蛋白
酶 Sigma 公司;噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜
(DMSO) Sigma 进口分装;总超氧化物歧化酶
(T-SOD)测定试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH-PX)测定试剂盒、过氧化氢酶(CAT)测定试剂
盒、谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒、微量丙二醛(MDA)
测定试剂盒、活性氧(ROS)测定试剂盒 南京建成
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.15.046
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生物工程研究所;其余所用试剂均为国产分析纯。
CO2 细胞培养箱 Thermo Forma 公司;SW-CJ-
IC型超净工作台 中国苏州;倒置显微镜 Nikon 公
司;低温冰箱 FORMA 公司,美国;TDL-40B-W 离
心机 上海安亭科学仪器厂;DF-110 型电子分析天
平 中国轻工业机械总公司;DK-S12 电热恒温水浴
锅 上海森信实验仪器有限公司;酶标仪 Biocell
公司,美国;TU-1810 紫外可见分光光度计 北京普
析通用仪器有限责任公司;650 -60 荧光分光光度
计 HITACHI公司,日本。
1.2 实验方法
1.2.1 花色苷的制备 山桃稠李果实榨汁,按照料
液比 1∶4(W∶V)与 pH2 的酸化乙醇混合,提取 2 次,
每次提取 12h,合并 2 次的提取液旋转蒸发后,经
X-5大孔树脂上柱纯化,减压浓缩,真空冷冻干燥得
到山桃稠李果实花色苷粉末,-20℃保存。实验时将
花色苷用 PBS缓冲液稀释到一定浓度,0.22μm 滤膜
过膜备用[8]。
1.2.2 细胞的复苏与培养 从液氮中取出冻存的
HepG2细胞迅速放入 37℃水浴 1min,并不断摇动使其
解冻。1000r /min离心 5min,吸弃上清液,加入细胞培
养液(改良型 RPMI 1640培养基中加入 100U/mL青霉
素,100μg /mL链霉素以及 10%的灭活胎牛血清)。
并将细胞置于 37℃,5% CO2 培养箱中培养,HepG2
细胞在细胞培养瓶贴壁生长,每 3~4d 传代一次,待
实验时取对数生长期的细胞进行实验。
1.2.3 MTT法检测 HepG2 细胞生长抑制率 参照文
献[9],取对数生长期的 HepG2 细胞,经胰酶消化后,
调整细胞密度为 1 × 105 /mL,接种于 96 孔培养板,每
孔 100μL,将未经处理的细胞作为对照组,质量浓度
为 0.1~1.2mg /mL的花色苷的细胞作为处理组,只加花
色苷和培养液而不含细胞的为空白组。其中处理组、
对照组及空白组每个浓度各设3个复孔。培养24、48、
72h后,每孔加入 10μL MTT,继续培养 4h,弃上清液,
每孔加入 150μL DMSO,利用酶标仪在490nm测 A值,
并计算细胞的生长抑制率。公式如下:
细胞生长抑制率(%)=[1-(处理组 A值-空白
组 A值)/(对照组 A值-空白组 A值) ]× 100
1.2.4 细胞内 T-SOD、GSH-PX、CAT 活性检测 参
照文献[10]的作法并有所改进,取对数生长期的细
胞 105 /mL 均匀铺于 24 孔板,待细胞贴壁生长后更
换培养液,实验组加入质量浓度为 0.1~1.2mg /mL的山
桃稠李果实花色苷的培养液,对照组加入正常的细胞
培养液。在 37℃,5% CO2 培养箱中继续培养 48h 后,
弃培养液,PBS 清洗两遍,胰酶消化,1000r /min 离心
5min后收集细胞,细胞裂解液裂解细胞,离心后得细
胞上清液,取适量进行蛋白质含量测定。按试剂盒
说明进行操作,检测 T-SOD、GSH-Px、CAT的活性。
1.2.5 细胞内 GSH、MDA 含量测定 按上述方法处
理细胞,并按说明书依次测定 GSH、MDA含量。
1.2.6 细胞内 ROS 含量测定 2-7二氯荧光乙酰
乙酸盐(2 - 7 - Dichlorodihydrofluorescein diacetate,
DCFH-DA)是一种自身不发荧光的化合物,可以作
为荧光探针自由地透过细胞膜的脂质双分子层进入
细胞,并在细胞内酯酶的作用下,DCFH-DA 中的两
个酯键断裂,产生一种具有相对极性、细胞不穿透性
的不发荧光的产物蓄积于细胞内,随之被氢过氧化
物或过氧亚硝酸盐氧化产生高度荧光产物
dichlorofluorescein(DCF)。样品的氧化还原状态可以
通过检测样品中 DCF被激发于 485nm发射于 530nm
处的荧光的强样度来检测[11]。
参照文献[12]方法并有所改进,对数生长期的
细胞 106 /mL 均匀铺于 24 孔板,待细胞贴壁生长后
更换培养液,实验组加入质量浓度为 0.2~0.8mg /mL、
的山桃稠李果实花色苷的培养液,对照组加入正常
的细胞培养液。在 37℃,5% CO2 培养箱中继续培养
12、24、48h后,弃培养液,PBS 清洗两遍,用无血清的
培养液悬浮细胞加入终浓度为 10μmol /L 的
DADCFH-DA。37℃,5% CO2 培养箱继续避光孵育
细胞 30min后弃去含 DCFH培养液,PBS 洗涤细胞 2
次,收集细胞。荧光分光光度计激发波长为 485nm,
发射波长为 530nm,测定待测样品的荧光强度。
1.3 统计学处理
所有数据以平均值 ± 标准差表示,采用 SPSS
13.0 统计软件处理实验数据,One-Way ANOVA进行
处理和显著性分析检验,在 p > 0.05 水平上差异不显
著;在 p < 0.05 水平上差异显著;在 p < 0.01 水平上差
异极显著。
2 结果与分析
2.1 山桃稠李果实花色苷对 HepG2 细胞增殖抑制
结果
山桃稠李果实花色苷分别作用 HepG2 细胞后,
结果如表 1 所示。随着花色苷浓度的升高以及作用
时间的延长,对 HepG2 细胞增殖的抑制作用都逐渐
增强,并呈浓度依赖与时间依赖。与对照组(未经处
理的细胞)相比差异性显著(p < 0.05) ,并且在同一
时间点各浓度之间,同一浓度各时间点之间,山桃稠
李果实花色苷对 HepG2 细胞的抑制率均有显著差异
(p < 0.05)。当质量浓度为 1.2mg /mL 山桃稠李果实
花色苷处理 HepG2细胞 24、48、72h 后,抑制率分别为
45.77% ±3.68%、58.23% ±2.21%、61.19% ±4.65%。
表 1 MTT法检测山桃稠李果实花色苷
对 HepG2 细胞抑制率
Table 1 Inhibition of the anthocyanin extracted from
Prunus maackii on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT
质量浓度
(mg /mL)
抑制率(%)
24h 48h 72h
0 0 0 0
0.1 6.67 ± 2.35* 10.41 ± 1.55* 14.22 ± 2.19*
0.2 14.22 ± 1.18* 21.68 ± 1.49* 26.79 ± 2.76*
0.4 24.56 ± 2.63* 39.54 ± 2.74* 39.81 ± 3.38*
0.8 30.79 ± 2.38* 47.77 ± 3.61* 54.11 ± 3.47*
1.2 45.77 ± 3.68* 58.23 ± 2.21* 61.19 ± 4.65*
注:0mg /mL为对照组,0.1~1.2mg /mL 为处理组,“* ”表示与
对照相比,有显著性差异(p < 0.05)。
68
2.2 山桃稠李果实花色苷对 HepG2 细胞内抗氧化
酶活性的影响
由表 2 可知,质量浓度 0~1.2mg /mL的山桃稠李
花色苷作用 HepG2 细胞 48h 后,抗氧化酶 T- SOD、
GSH-PX 的活性与对照组相比随质量浓度的增大而
降低。0.1mg /mL的低浓度花色苷作对 HepG2 细胞内
上述两种酶的活性虽较对照组有降低,但差异不显著
(p > 0.05)。在质量浓度为 0.2mg /mL 时,GSH-PX 的
活性与对照组相比差异显著(p < 0.05) ,T-SOD 的活
性较对照组差异性极显著(p < 0.01)。而当质量浓度
在 0.4mg /mL以上时,随浓度上升,T-SOD、GSH-PX
的活性与对照组相比均下降,且差异极显著
(p < 0.01)。由表 2 显示,当山桃稠李花色苷的质量浓
度在 0.4mg /mL以上时,CAT 的活性高于对照组,且
CAT的活性随山桃稠李花色苷质量浓度的增大而略
有增强,但 CAT的活性随质量浓度的增加其增强幅
度并不大,处理组与对照组相比差异均不显著
(p > 0.05)。结果表明,不同质量浓度(0~1.2mg /mL)
的花色苷作用于 HepG2 细胞 48h 后,T - SOD、
GSH-PX的活性与对照组相比随质量浓度的增大而
降低,CAT的活性随质量浓度的增大而略有增强。
表 2 山桃稠李花色苷
对 HepG2 细胞内抗氧化酶活性的影响
Table 2 Effect of anthocyanins extracted from Prunus maackii
on the activity of antioxidant enzymes in the HepG2 cells
质量浓度
(mg /mL)
T-SOD
(U/mL)
GSH-Px
(U/mL)
CAT
(U/mL)
0 83.19 ± 7.06 98.04 ± 4.21 2.56 ± 0.35
0.1 71.87 ± 3.99 90.57 ± 2.83 2.16 ± 0.11
0.2 60.09 ± 5.02** 81.83 ± 5.51* 2.32 ± 0.24
0.4 49.19 ± 4.82** 70.25 ± 7.42** 2.58 ± 0.32
0.8 34.36 ± 3.89** 59.31 ± 5.17** 2.65 ± 0.21
1.2 27.11 ± 2.91** 49.82 ± 3.79** 3.02 ± 0.18
注:0mg /mL为对照组,0.1~1.2mg /mL 为处理组,处理组与对
照组比较,* p < 0.05 差异显著,** p < 0.01 差异极显著,表
3 同。
2.3 山桃稠李果实花色苷对 HepG2 细胞内 GSH、
MDA含量的影响
由表 3 可知,随山桃稠李花色苷质量浓度的增
大 GSH的含量与对照组相比逐渐减少,且呈一定的
效应关系,质量浓度为 0.1mg /mL 山桃稠李花色苷与
对照组相比差异显著(p < 0.05) ,而当质量浓度大于
0.2mg /mL时,HepG2 细胞内 GSH的含量与对照组相
比差异极显著(p < 0.01)。而 HepG2 细胞内 MDA 的
含量却随花色苷质量浓度的增大而逐渐增大,当质
量浓度小于 0.2mg /mL时,处理组与对照组的差异并
不显著(p > 0.05) ,当质量浓度大于 0.2mg /mL 时,处
理组与对照组的差异极显著(p < 0.01)。结果表明,
不同质量浓度(0 ~ 1.2mg /mL)的花色苷作用于
HepG2 细胞 48h 后,GSH 的含量与对照组相比随质
量浓度的增大而呈现降低趋势,而 MDA 的含量却随
花色苷质量浓度的增大而逐渐增大。
表 3 山桃稠李花色苷
对 HepG2 细胞内 GSH、MDA含量的影响
Table 3 Effect of anthocyanins extracted from Prunus maackii
on the content of GSH and MDA in the HepG2 cells
质量浓度
(mg /mL)
GSH
(nmol /mL)
MDA
(nmol /mL)
0 34.29 ± 2.17 4.03 ± 0.36
0.1 29.76 ± 2.98* 4.12 ± 0.26
0.2 24.92 ± 1.30** 4.84 ± 0.40
0.4 21.13 ± 2.80** 5.76 ± 0.66**
0.8 16.42 ± 2.54** 7.05 ± 0.64**
1.2 12.72 ± 1.47** 8.54 ± 0.79**
2.4 山桃稠李果实花色苷对 HepG2 细胞内 ROS
含量的影响
如表 4 显示,ROS 产生量与山桃稠李花色苷浓
度呈依赖性关系。山桃稠李花色苷处理 HepG2 细胞
12h时,随着质量浓度的增加 ROS 的产生量也逐渐
升高,质量浓度为 0.2mg /mL山桃稠李花色苷与对照
组相比差异显著(p < 0.05) ,而当质量浓度大于
0.4mg /mL时,HepG2 细胞内 ROS 的含量与对照组相
比差异极显著(p < 0.01)。在 24h 时,所有处理组
ROS的生成量显著高于对照组(p < 0.01) ,且随质量
浓度的增大而增加。当山桃稠李花色苷处理 HepG2
细胞时间达到 48h 时,各处理组与此时的对照组相
比差异依然极显著(p < 0.01) ,检测结果显示终浓度
0.2、0.4、0.8mg /mL 的山桃稠李花色苷作用 48h 后
ROS的荧光强度分别为对照组的 1.95、2.61、3.48 倍。
并且在处理组最高浓度为 0.8mg /mL 的山桃稠李花
色苷作用 12、24、48h 时,测得的 ROS 荧光强度分别
为 33.43 ± 2.65、52.83 ± 5.49、69.09 ± 2.69。结果表
明,HepG2 细胞内 ROS 含量随着时间的延长以及山
桃稠李花色苷浓度的增大而升高。
表 4 山桃稠李花色苷对 HepG2 细胞内 ROS含量的影响
Table 4 Effect of anthocyanins extracted from
Prunus maackii on the content of ROS in the HepG2 cells
质量浓度
(mg /mL)
时间(h)
12 24 48
0 13.90 ± 1.26 15.89 ± 1.38 19.84 ± 1.84
0.2 20.68 ± 1.43* 31.51 ± 1.18** 38.76 ± 3.11**
0.4 26.56 ± 2.28** 40.12 ± 3.53** 51.28 ± 4.38**
0.8 33.43 ± 3.15** 52.83 ± 5.49** 69.09 ± 2.69**
注:0 mg /mL为对照组,0.2~0.8mg /mL 为处理组,在花色苷作
用 HepG2 细胞相同时间下,处理组与对照组比较,* p < 0.05
差异显著,** p < 0.01 差异极显著。ROS产生量用荧光强度
表示。
3 结论
3.1 山桃稠李果实花色苷破坏 HepG2 细胞的抗氧
化系统
GSH是体内主要的巯基是体内主要的非蛋白巯
基化合物[13]。本研究发现,随着山桃稠李果实花色
苷质量浓度的增加,细胞内 GSH含量逐渐降低,且大
69
于 0.2mg /mL时差异显著(p < 0.05) ,其原因可能是
由于 ROS 的产生使酶迅速失活以及 GSH 的耗竭引
起 ROS的增加,从而导致细胞损伤。
SOD、GSH_PX、CAT 是生物体内具有特殊生理
活性的抗氧化酶[14]。本研究结果显示,山桃稠李果
实花色苷作用 HepG2 细胞 48h 后,抗氧化酶 SOD、
GSH-PX的活性均随着山桃稠李果实花色苷质量浓
度的增加而下降,表明 HepG2 细胞内抗氧化酶受到
了损伤,从而削弱了对 ROS的清除能力,导致细胞损
伤,甚至凋亡。而细胞内 CAT活性虽略有升高,但均
无统计学意义(p > 0.05)。其原因可能是花色苷作用
于细胞后,GSH含量的减少及 GSH-PX活性的下降,
ROS不能及时清除在体内累后,积刺激细胞代偿性
的增强了 CAT活性。
3.2 山桃稠李果实花色苷诱导 HepG2 细胞脂质过
氧化损伤
细胞内产生的 ROS攻击生物膜中的多不饱和脂
肪酸,引发脂质过氧化形成 MDA,检测 MDA 的含量
在一定程度上可反映细胞抗氧化系统的变化情
况[15]。本实验结果显示,随着山桃稠李花色苷质量
浓度的增加细胞内 MDA含量逐渐增加,且质量浓度
大于 0.2mg /mL的处理组与对照组比较,差异极显著
(p < 0.01)。表明山桃稠李花色苷使 HepG2 细胞的
脂质过氧化程度增强,而抗氧化能力下降,提示
HepG2 细胞会受到一定的损伤。
3.3 山桃稠李果实花色苷引起 HepG2 细胞内 ROS
增加
细胞内的活性氧主要有 O2 -、H2O2 等形式,肿瘤
细胞内较高水平的 ROS 可使肿瘤细胞受到 ROS 攻
击,比正常细胞更易于死亡[16-17]。本实验中山桃稠李
果实花色苷引起 HepG2 细胞内 ROS 水平随花色苷
质量浓度的增大而逐渐增加,处理组细胞内 ROS 水
平与对照组比较,均显著增加,其差异具有统计学意
义(p < 0.05)。因此推断由于 HepG2 细胞内 ROS 含
量升高,迫使细胞处于氧化应激状态内,抗氧化酶
SOD、GSH-PX活力的显著下降,GSH减少以及 MDA
生成增多,导致在抗氧化系统失调,细胞凋亡。
综上,山桃稠李果实花色苷能够干扰 HepG2 细
胞内部的抗氧化系统,破坏抗氧化系统和体内自由
基的平衡,使细胞氧化性损伤。体现在降低 HepG2
细胞内的 SOD对超氧阴离子的歧化作用和 GSH-PX
对 H2O2 的还原作用,导致自由基在体内堆积,致使
ROS含量升高。虽然 CAT 的活性略有增强,但没有
改变体内的脂质过氧化作用的增强,以致不饱和脂
肪酸水平降低以及 ROS 不断含量的升高,从而造成
生物膜结构发生一系列的损伤变化甚至细胞凋亡。
而抗氧化酶 /物与 ROS 的调解途径有待于在分子水
平继续研究。
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