全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
产 32羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
张晓梅 1 　诸葛斌 2 　许正宏 1 　窦文芳 1 　黄瑞 2 　许赣荣 2
(1 江南大学医药学院制药工程研究室 ,无锡 214122; 2 江南大学生物工程学院 ,无锡 214122)
　　摘 　要 : 　将连接编码甘油脱水酶的基因重组质粒 pEtac2dhaB和连接编码乙醛脱氢酶编码基因 a ldh的重组质粒 pUCtac
共转化大肠杆菌 ,得到产 32羟基丙酸重组大肠杆菌 JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB) ,并对影响该重组菌发酵的营养因子进行
研究。试验结果表明 :该重组菌转化甘油合成 32羟基丙酸的适宜培养基组成为甘油 40 g/L、酵母膏 6 g/L、维生素 B12 0. 02 g/L
以及 KH2 PO4 7. 5 g/L; 32羟基丙酸产量和转化率分别达到 4. 92 g/L和 12. 3 %。
关键词 : 　32羟基丙酸 　重组大肠杆菌 　甘油 　营养因子
Construction of Novel Recombinant Escherich ia coli Capable of
Producing 32hydroxypropion ic Acid and Its Conversion of Glycerol
Zhang Xiaomei1 　Zhuge B in2 　Xu Zhenghong1 　Dou W enfang1 　Huang Rui2 　Xu Ganrong2
(1 Laboratory of Pharm aceutical Engineering, School of M edicine and Pharm aceutics, J iangnan
University, W uxi 214122; 2 School of B iotechnology, J iangnan University, W uxi 214122)
　　Abs trac t: 　The exp ression vector pUCtac harboring a ldh gene and the exp ression vector pEtac harboring dhaB gene were trans2
formed into E. coli JM109 to construct recombinant Escherichia coli JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB ). Some nutrient ingredient af2
fecting fermentation results of this recombinant strain were also studied. The results demonstrated that the op tim ized medium comp rised
( g/L) glycerol 40, yeast extract 6. 0, KH2 PO4 7. 5 and vitam in B12 0. 02. The 32 hydroxyp rop ionic acid concentration, yield on glyc2
erol could reach 4. 92 g/L and 12. 3 % , respectively.
Key wo rds: 　32hydroxyp rop ionic acid (32HP) 　Recombinant Escherich ia coli　Glycerol　Nutrient ingredient　
收稿日期 : 2009203211
基金项目 :教育部博士点新教师基金 (20070295011)
作者简介 :张晓梅 (19692) ,女 ,研究方向 :微生物制药 ; E2mail: hanqiaowu@ sina. com
通讯作者 :许赣荣 ,硕导 ,教授 , Tel: 0510285864597, E2mail: grxu@ sytu. edu. cn　　32羟基丙酸 ( 32hydroxyp rop ionic acid,简称 32HP)是一种重要的有机合成中间体 ,脱水生成丙烯酸 ,氧化生成丙二酸 ,还可以形成多种酯类聚合物 [ 1 ]。目前市场上销售的 32羟基丙酸均采用化学合成法生产 ,但化学合成法具有设备投资大、技术难度高、需要重金属催化剂、污染环境等缺点 ,并且利用不可再生的石化资源为原料 ,随着石油资源的短缺 ,造成依赖于石油资源的各种化学品价格居高不下 ,也限制了 32羟基丙酸聚合物的发展 [ 2 ]。而微生物转化法以其利用可再生资源、清洁生产、对环境友好、有利于可持续发展等优点逐渐成为国内外研究的热点。但至今为止尚未发现一种自然菌株能将葡萄糖或甘油直接转化为 32羟基丙酸 [ 3 ] ,利用自然筛 选的微生物还无法直接进行发酵法生产 32羟基丙酸 ,因此 ,采用基因工程技术构建高产菌株被认为是今后的研究方向。国内至今尚无文献报道利用基因工程菌发酵生产 32羟基丙酸。将先期构建的重组质粒 pUCtac2aldh[ 4 ]和 pEtac2dhaB[ 5 ]共转化大肠杆菌 E. coli JM109,得到可以利用甘油产 32羟基丙酸的重组菌 E. coli JM109 (pUCtac2al2dh, pEtac2dhaB) ,并考察了甘油浓度、酵母膏、维生素B12等因素对重组菌发酵产 32羟基丙酸的影响。1　材料与方法111　菌株和质粒大肠杆菌 ( Escherich ia coli ) JM109,由本实验室保藏 ,质粒载体 pUCtac2aldh, pEtac2dhaB 由先期构
2009年第 8期 张晓梅等 :产 32羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
建和保藏 [ 5 ]。重组大肠杆菌 JM109 ( pUCtac2aldh,
pEtac2dhaB)为本研究构建。
112　工具酶和试剂
限制性内切酶 X ba I、Pst I,碱性磷酸酶 C IAP购
自 TaKaRa公司 ; T4 DNA连接酶及 Taq DNA聚合酶
购自上海华美生物工程公司 ; Gel Extraction M ini
Kit、PCR Purification M ini Kit购自上海华舜生物工
程有限公司。丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、广范围蛋
白质分子量标准为 Promega公司产品。
113　SDS2PAGE
采用 5%浓缩胶及 12%分离胶的不连续垂直平
板电泳 ,考马斯亮蓝 R2250 染色 [ 6 ]。以大肠杆菌
JM109作对照。
114　培养基和培养条件
LB培养基 ( g /L) :蛋白胨 10,酵母膏 5,氯化钠
10,固体培养基含 20 g/L的琼脂 ,固体和液体培养
基在需要时加入卡那霉素或者氨苄青霉素至浓度
50 mg/m l。
种子培养基 :采用 LB培养基。
发酵培养基 ( g /L ) :甘油 50,酵母膏 5, KH2 PO4
7. 5, (NH4 ) 2 SO4 2. 0, MgSO4 ·7H2 O 0. 2, FeSO4 ·
7H2O 0. 005, CaCl2 0. 1,维生素 B12 0. 015, 2 mol/L
KOH调 pH值 7. 0。
发酵 :从新鲜的 LB培养基斜面上挑取一环菌
株接入 50 m l摇瓶 (装液量为 10 m l)中 ,于旋转式摇
床中 30℃、140 r/m in培养 16 h得到种子液。按 5%
接种量接入 500 m l摇瓶 (装液量 50 m l)中 ,在 140
r/m in旋转式摇床中 ,培养至 OD600为 0. 7,再加入 1
mmol/L IPTG诱导过夜 ,同时以未加入 IPTG诱导的
发酵液为对照。
115　重组菌 E. coli JM109 ( pEtac2aldh, pUCtac2al2
dh)质粒稳定性分析
单细胞生物的细胞呈几何级数 2n增长 ,当 n =
20时 , 220 = 1. 05 ×106 ,将稳定期的菌液稀释 10 - 6 ,
再将其培养到稳定期 ,即可认为细胞已连续传代 20
次。具体方法如下 :从新鲜转化平板上挑取单菌落。
接种至 2 m l不含抗生素的 LB中 , 30℃培养 24 h,即
得 20代的菌液 ,以此类推 ,直至连续传代至 100代。
其中每隔 20代统计 1次质粒丢失情况 ,将上述菌液
涂布于不含抗生素的 LB板上 ,从中挑选 100个单
菌落分别点在添加和不添加抗生素的平板上 ,通过
计数即可测得该代数的质粒稳定性。
116　测定方法
32HP含量的检测 :采用高效液相色谱法 ,色谱
柱 D iamonsal C18 (5μm, 250 mm ×4. 6 mm ) ;流动相
∶甲醇 ∶水 = 5∶95,加入 H3 PO4 至 0. 05% ;紫外检
测器。
甘油含量的检测 :采用高效液相色谱法 ,色谱
柱 : ZORBAX NH2 ( 5μm, 250 mm ×4. 6 mm ) ;流动
相 ∶乙腈和水 = 70 ∶30;流速为 1 m l/m in;示差检
测器。
生物量的测定 :取适量发酵液用无菌生理盐水稀
释至一定浓度后 ,于 600 nm测定吸光度 (OD值 )。
2　结果与讨论
211　重组质粒稳定性分析
用双抗平板 (含卡那青霉素 50μg/m l和氨苄青
霉素 100 μg/m l)筛选得到重组大肠杆菌 E. coli
JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB ) ,重组大肠杆菌 E.
coli JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB)在添加氨苄青
霉素 ,不添加卡那霉素 ,无卡那霉素选择压力的条件
下 ,以及添加卡那霉素 ,不添加氨苄青霉素 ,无氨苄
青霉素选择压力的条件下 ,连续转种 5次 ,统计重组
大肠杆菌 E. coli JM109 ( pUCtac2aldh, pEtac2dhaB )
的菌落数。结果表明 ,传 100代后重组大肠杆菌 E.
coli JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB )的质粒保持率
分别为 85%和 80%。
表 1　重组菌 E. coli JM 109 ( pUC tac2a ldh, pEtac2dhaB)
连续转种后在不同平板上的菌落数
传代次数 pEtac2dhaB
Kan ( + ) Amp ( - ) ( % )
pUCtac2aldh
Amp ( + ) Kan ( - ) ( % )
20 99 98
40 98 92
60 92 88
80 88 85
100 85 80
212　重组菌全细胞蛋白 SDS2PAGE电泳分析
挑取 3个重组子大肠杆菌 E. coli JM109 (pEtac2
dhaB ) , E. coli JM109 ( pUCtac2aldh ) , E. coli JM109
(pUCtac2aldh, pEtac2dhaB )分别接种于含有卡那霉
素 50μg/m l或者氨苄青霉素 100μg/m l的 LB培养
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
基中 , 37℃培养至对数后期。1 mmol/L IPTG诱导
培养 5 h,离心收集菌体 ,超声波破壁。加入 1倍的
SDS2PAGE电泳加样缓冲液中悬浮 , 100℃水浴 5
m in,进样量为 10μl,重组菌 E. coli JM109 ( pEtac2
dhaB ) , E. coli JM109 ( pUCtac2aldh ) , E. coli JM109
(pUCtac2aldh, pEtac2dhaB )全细胞蛋白 SDS2PAGE
电泳分析如图 1所示。从图 1可以看出 ,在 ,其中
61、21和 16 kD处出现蛋白质特征带正好对应甘油
脱水酶 DHAB 3个亚基分子量的位置 [ 7 ] ,说明已经
存在表达产物。另外在 54、49和 12 kD处出现蛋白
质特征带正好与乙醛脱氢酶酶 ALDH蛋白大小相
符 [ 8 ] ,说明表达产物中已经存在乙醛脱氢酶酶
蛋白。
M. 蛋白质分子量标准 ; 1. E. coli JM109 ( pUCtac2aldh ) ; 2. E. coli
JM109 (pEtac2dhaB) ; 3. E. coli JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB) ; 4. 未
转入载体的 E. coli JM109
图 1　重组菌表达产物的 SD S2PAGE电泳分析
213　重组菌的生长曲线
分别接种单菌落重组菌 E. coli JM109 (pUCtac2
aldh, pEtac2dhaB)于 100 m l LB培养基 (含卡那霉素
50μg/m l和含氨苄青霉素 100μg/m l) , 37℃, 120 r/
m in培养 36 h,每隔 2 h取一次样 ,重组菌的生长曲
线如图 2。
根据重组菌的生长曲线的结果 ,确定将重组菌
E. coli JM109 (pUCtac2aldh, pEtac2dhaB )的种子培养
液接入发酵培养基的接种时间确定为 16 h。
图 2　重组菌 E. co li JM 109( pUC tac2
a ldh, pEtac2dhaB)生长曲线
214　重组菌发酵试验
21411　初始甘油浓度对重组菌发酵的影响 　为了
考察本研究所构建的重组菌对发酵甘油产 32HP的
能力 ,对该重组菌在不同初始甘油浓度 20、30、40、
50、60、70、80 g /L (其中酵母膏 6 g /L、KH2 PO4 7. 5
g/L、VB12 0. 015 g/L )的发酵培养基中 37℃, 140 r/
m in,发酵 48 h,结果如图 3所示。
图 3　甘油浓度对重组菌发酵产 32HP的影响
从图 3可以看出 ,当甘油浓度超过 70 g/L时 ,
甘油的利用率明显下降。而当甘油浓度在 40 g/L
时 , 32HP的产量最高可以达到 3. 37 g/L ,甘油转化
率为 8. 4%。
21412　维生素 B12浓度对重组菌发酵的影响 　从甘
油到 32HP的生物合成途径中 , DHAB需要 VB12作
为辅酶才能催化甘油至 32HPA的反应 ,而且在催化
601
2009年第 8期 张晓梅等 :产 32羟基丙酸重组菌的构建及其转化甘油的研究
甘油的同时 , DHAB会出现甘油导致的自杀性失活
现象。这主要是由于底物甘油导致辅酶 B12的 C2Co
键发生不可逆断裂 ,形成 5′2脱氧腺苷和烷基钴氨素
类似物 (即被修饰的辅酶 ) ,而烷基钴氨素与 DHAB
紧密结合 ,致使 DHAB失活 [ 9 ]。Toraya等 [ 10 ]研究表
明 ,如果将与之结合的被修饰的辅酶 B12或 VB12与
自由态辅酶 B12进行交换 ,可以恢复 DHAB 的催化
活性。维持发酵培养基中足够高的 VB12浓度 ,对于
激活 DHAB活性和防止因甘油导致的自杀性失活 ,
从而保证较高水平 32HP的产量是必需的 ,在保持
发酵培养基中初始甘油浓度为 40 g/L 时 ,考察了
VB12的浓度对发酵的影响。结果如图 4,从图 4可
以看出 ,当 VB12的浓度大于 0. 02 g/L时 ,培养条件
为 37℃, 140 r/m in培养 48 h,发酵液中 32HP产量
维持在 3. 8 g/L ,甘油转化率为 9. 5%。
图 4　VB12浓度对重组菌发酵产 32HP的影响
21413　磷酸二氢钾浓度对重组菌发酵的影响 　在
保持初始甘油和 VB12的浓度分别为 40 g/L、0. 02 g/
L,培养条件为 37℃, 140 r/m in培养 48 h,考察了
KH2 PO4 浓度对产 32HP重组菌发酵结果的影响 (图
5)。由图 5可知 ,当 KH2 PO4 浓度为 7. 5 g/L时 , 32
HP产量可达 4. 72 g/L ,甘油转化率为 11. 8%。当
KH2 PO4 浓度逐渐增大时 , 32HP的量开始下降 ,根据
试验测得发酵液 OD600可以看出菌体量逐渐增大
(数据未列出 ) ,分析原因是由于过高的 KH2 PO4 浓
度 ,促进菌体生长和副产物形成 ,从而导致 32HP的
产量迅速下降。
图 5　KH2PO 4浓度对重组菌发酵产 32HP的影响
21414　酵母膏浓度对重组菌发酵的影响 　本研究
在保持发酵培养基中初始甘油浓度为 40 g/L , VB12
的浓度为 0. 02 g/L, KH2 PO4 浓度为 7. 5 g/L时培养
条件为 37℃, 140 r/m in培养 48 h,考察了酵母膏浓
度对重组菌发酵产 32HP结果的影响。由图 6可看
出 ,当酵母膏浓度为 6 g/L时 , 32HP的产量达到 4.
92 g/L ,甘油转化率为 12. 3%。但是随着酵母膏浓
度的增大 , 32HP的产量逐渐下降 ,分析原因可能是
由于酵母膏浓度增大导致菌体生长和其他代谢产物
的形成。因此 ,合适的酵母膏浓度对于维持重组菌
32HP的较高产量水平也是至关重要的。
图 6　酵母膏浓度对重组菌发酵产 32HP的影响
3　结论
甘油经甘油脱水酶 DHAB和乙醛脱氢酶 ALDH
催化生成 32HP,自然界现有的微生物体内没有这条
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
代谢途径 ,可通过这两个酶构建以甘油为底物的 32
HP基因工程菌微生物体内合成途经 ,合成途径的
惟一中间产物为 32羟基丙醛 ,其浓度过高将抑制菌
体的生长和甘油的代谢 [ 11 ] ,这可能是不能实现高产
的主要限制因素之一。另外当 E. coli JM109中同时
引入表达载体 pUCtac和 pEtac时 ,质粒保持率分别
为 85%和 80% ,相比大肠杆菌 E. coli JM109中只引
入 pUCtac或者 pEtac稳定性有所降低。构建的重
组菌 E. coli JM109 ( pEtac2dhaB , pUCtac2aldh)产 32
HP4. 92 g/L ,甘油转化率为 12. 3%。
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