全 文 ：第 １３卷第 ３期
２０１５年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０３􀆰 ００９
收稿日期：２０１４－０４－０１
基金项目：江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１１１５４）
作者简介：田　 超（１９８６—），男，河北保定人，硕士研究生，研究方向：生物化工；丁重阳（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｙｄｉｎｇ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
猴头菌发酵液中抑制非酶糖基化
反应物质的分离及分析
田　 超１，２，陶冠军３，丁重阳１，２，顾正华２，张　 梁２，石贵阳２
（１􀆰 江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
２􀆰 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，江苏 无锡 ２１４１２２；
３􀆰 江南大学 食品科学与技术国家重点实验室，江苏 无锡 ２１４１２２）
摘　 要：以体外非酶糖基化反应抑制率为考察指标，对猴头菌发酵液中抑制非酶糖基化反应的高活性物质进行分
离并纯化，通过发酵液浓缩、二步醇沉、提取物冷冻干燥、Ｃ１８层析柱等步骤进行分离，获得 １种对非酶糖基化反应
具有良好抑制作用的物质组分 ＨＥ３５，经液相色谱 质谱（ＬＣ ＭＳ）分析后发现，ＨＥ３５ 的相对分子质量为 ２９４，２
ｍｇ ／ ｍＬ的 ＨＥ３５对体外非酶糖基化抑制率达到 ９２􀆰 １７％，半抑制质量浓度 ＩＣ５０为 ０􀆰 ６５ ｍｇ ／ ｍＬ。 初步分析猴头菌发酵
液中可能存在一种以上的活性物质，对体外非酶糖基化反应具有抑制作用。
关键词：猴头菌；非酶糖基化；液态发酵；抑制率
中图分类号：ＴＳ２０１􀆰 ２　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０３－００４７－０８
Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ ｎｏｎ⁃ｅｎｚｙｍａｔｉｃ
ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ
ＴＩＡＮ Ｃｈａｏ１，２，ＴＡＯ Ｇｕａｎｊｕｎ３，ＤＩＮＧ Ｚｈｏｎｇｙａｎｇ１，２，ＧＵ Ｚｈｅｎｇｈｕａ２，ＺＨＡＮＧ Ｌｉａｎｇ２，ＳＨＩ Ｇｕｉｙａｎｇ２
（１􀆰 Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，
Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ； ２􀆰 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ；
３􀆰 Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｎｏｎ⁃ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ （ＮＥＧ） ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅｒｉｃｉｕｍ
ｅｒｉｎａｃｅｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｒａｔｅ ａｇａｉｎｓｔ ＮＥＧ ｒｅａｃｔｉｏｎ􀆰 Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｗｏ⁃ｓｔｅｐ ｅｔｈａｎｏｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｅｘｔｒａｃｔｓ ａｎｄ Ｃ１８ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ＨＥ３５ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ􀆰 Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｂｙ
ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ⁃ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ （ ＬＣ⁃ＭＳ ）， ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓ ｗａｓ ２９４􀆰 Ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ＨＥ３５ ａｔ ２ ｍｇ ／ ｍＬ ａｇａｉｎｓｔ ＮＥＧ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ９２􀆰 １７％ ａｎｄ ｉｔｓ ＩＣ５０ ｗａｓ
０􀆰 ６５ ｍｇ ／ ｍＬ􀆰 Ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ Ｈ􀆰 ｅｒｉｎａｃｅｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｒｏｔｈ
ｐｏｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＮＥＧ ｒｅａｃｔｉｏｎ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ； ｎｏｎ⁃ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ； ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
　 　 持续高血糖会引起机体多种蛋白质发生非酶 糖基化（ＮＥＧ）反应，所谓非酶糖基化，是指蛋白
质、氨基酸等游离的氨基端与还原糖上的羰基通
过一系列复杂的非酶促反应最终生成不可逆的糖
基化终末产物（ＡＧＥｓ）的过程。 持续高血糖引发
的糖尿病常伴有白内障［１］ 、糖尿病肾病［２］和动脉
粥样硬化［３］等慢性并发症，这些并发症的发病因
素较多，其中蛋白质非酶糖基化是主要因素之
一［４］ ，也是组织器官老化的重要原因［５］ 。 寻找能
够抑制 ＮＥＧ反应的抑制剂是防治糖尿病及其并发
症的方向之一，同时可以为开发治疗糖尿病药物
提供先导化合物。
食药用真菌在自然界中来源丰富、分布广泛，
含有多种对人体有益的天然产物，对多种疾病具
有良好的防治和治疗效果，如灵芝中的三萜类物
质灵芝酸，具有明显的抗肿瘤作用［６］ ，灵芝多糖具
有调节免疫、抗氧化损伤等功效［７］ ，金耳菌丝体多
糖和冬虫夏草多糖均有降血糖作用［８－９］ 。 黄达明
等［１０］研究了猴头菌转化银杏叶粗提物（ＥＧＢ），发
酵液中非多糖提取物对非酶糖基化具有明显的抑
制作用，但并未明确其物质的相对分子质量和具
体化学结构。 大型真菌中，担子菌的许多品种具
有降血糖作用［１１］ ，猴头菌（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）就是
其中代表之一，它含有丰富的生物活性物质，具有
促进血液循环、降低血胆固醇、提高机体免疫力等
多种功效［１２－１４］ 。 目前，ＮＥＧ 反应的抑制剂主要为
合成类药物，其毒副作用较大，且价格昂贵，对其
使用有严格限制。 猴头菌作为一种食药两用的真
菌，与合成类药物相比，不但具有良好的疾病治疗
效果，也是一种可以日常食用的佳肴美食。 目前，
对于分离和分析猴头菌中具有抑制 ＮＥＧ功能的物
质，并利用猴头菌液态发酵生产具有抑制 ＮＥＧ 反
应的活性物质鲜有报道。
笔者以抑制体外蛋白质 ＮＥＧ 反应为主要检测
指标，对猴头菌发酵液进行初步分离和纯化，成功
得到一种具有抑制 ＮＥＧ反应的活性物质，并对活性
物质进行分析以鉴定此活性物质，为其进一步应用
提供数据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种与材料
猴头菌（Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ）保藏于江南大学粮
食发酵工艺与技术国家工程实验室。
乙二醛、牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、氨基胍（ＡＧ）、叠
氮化钠，国药集团化学试剂有限公司；甲醇为色谱
纯，其余所用试剂均为国产分析纯。
１􀆰 ２　 培养基
斜面培养基（ ｇ ／ Ｌ）：马铃薯 ２００，葡萄糖 ２０，琼
脂条 ２０～２２。
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，玉米粉 ２０，麸皮
１５，ＫＨ２ＰＯ４ ２，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １，酵母膏 ３，ＶＢ１ ０􀆰 ０１５。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２０，玉米粉 １５，麸皮
１５，ＫＨ２ＰＯ４ ２，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ １。
１􀆰 ３　 仪器与设备
ＨＩＴＡＣＨＩ ６５０ ６０ 型荧光分光光度计，日本
Ｈｉｔａｃｈｉ 公司；台式高速离心机，Ｓｉｇｍａ 公司；Ｗａｔｅｒｓ ６００
型高效液相色谱仪、液相色谱串联四级杆飞行时间质
谱仪、Ｍａｓｓｌｙｎｘ４􀆰 １ 工作站，Ｗａｔｅｒｓ 公司；ＡＫＴＡ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ
系统，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司。
１􀆰 ４　 方法
１􀆰 ４􀆰 １　 体外非酶糖基化反应抑制率的测定
ＮＥＧ反应抑制率的测定方法参照文献［１５］的
方法并稍加修改。 体外 ＮＥＧ 反应体系反应液包含
１２ ｍｇ ／ ｍＬ乙二醛、 １０ ｍｇ ／ ｍＬ 牛血清白蛋白和 ２
ｍｇ ／ ｍＬ叠氮化钠的 ｐＨ 为 ７􀆰 ４ 的磷酸缓冲液。 取 １
ｍＬ样品液与上述 １ ｍＬ 反应体系液混合，以蒸馏水
为空白样品，混匀后 ３７ ℃避光反应 １５ ｄ，反应结束
后加蒸馏水定容至 １０ ｍＬ，测定荧光强度。 在激发
波长 ３７０ ｎｍ、狭长 ５ ｎｍ、发射波长 ４４０ ｎｍ、狭长 ６
ｎｍ条件下利用荧光光度计测定荧光强度，重复 ３
次，取平均值，计算体外 ＮＥＧ反应的抑制率，计算见
式（１）。
Ｉ ＝ ａ
－ ｂ
ａ
× １００％ （１）
式中：Ｉ为抑制率；ａ 为空白样品荧光强度；ｂ 为待测
样品荧光强度。
利用方差分析检验样品差异显著性，抑制率均
以平均数（Ｍｅａｎ）±标准差（ＳＤ）表示。
１􀆰 ４􀆰 ２　 活性物质的粗提取
发酵得到的猴头菌发酵液经冷冻离心机 ８ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ去菌体取上清，采用 ３０％（体积分
数，下同）乙醇和 ７０％乙醇二步醇沉，分离得到 ２ 个
沉淀组分 ＨＥ１和 ＨＥ２，上清液经旋转蒸发仪除去乙
醇，上清液浓缩后和乙酸乙酯 １ ∶ １（体积比）混合进
行萃取，得到有机相 ＨＥ３ 和水相 ＨＥ４，两相组分分
别经旋转蒸发仪除去含有的乙酸乙酯和残留的乙
醇。 将得到的 ４个组分冷冻干燥后用超纯水配制成
一定浓度的溶液，取少量测定体外 ＮＥＧ 反应抑制
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
率，剩余样品 ４ ℃保存备用。
１􀆰 ４􀆰 ３　 Ｃ１８自制低压层析柱分离及 Ｃ１８ 制备柱纯
化活性物质
采用自制低压层析柱（１０ ｍｍ×５０ ｃｍ，上海锦华
层析设备厂制造）进行分离，Ｃ１８ 填料，甲醇水梯度
洗脱，流速为体积流量 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，双紫外检测，按
峰收集洗脱液。 将洗脱液浓缩冻干，配制成质量浓
度分别为 ０􀆰 ５、１和 ２ ｍｇ ／ ｍＬ溶液，测定体外 ＮＥＧ反
应抑制率。
将 Ｃ１８自制低压层析柱分离得到的高抑制率
活性组分通入制备柱 （ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ
Ｃｏｌｕｍｎ，Ｗａｔｅｒｓ公司）进行纯化，流动相为水（Ａ）和
甲醇（Ｂ），采用梯度洗脱：０～１０ ｍｉｎ，Ｂ液 ５％～７０％；
１０～ ４０ ｍｉｎ，Ｂ 液 ７０％ ～ １００％；４０􀆰 １ ｍｉｎ，Ｂ 液回到
５％并维持 １０ ｍｉｎ。 流速为 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进样量 １ ｍＬ，
２５４、２９９ ｎｍ双紫外（ＵＶ）检测。 按峰收集，将各样
品浓缩冻干，４ ℃保存备用。
１􀆰 ４􀆰 ４　 活性物质对体外 ＮＥＧ反应的抑制水平
称取活性物质样品 ５０ ｍｇ，溶于 １０ ｍＬ 水中，逐
级稀释，配制成质量浓度为 ０􀆰 ２５、０􀆰 ５、１􀆰 ０、１􀆰 ５、２􀆰 ０、
２􀆰 ５、３􀆰 ０、４􀆰 ０和 ５􀆰 ０ ｍｇ ／ ｍＬ的溶液，分别测定不同浓
度下对体外 ＮＥＧ反应的抑制率，绘制抑制水平曲线，
分析活性物质对体外 ＮＥＧ反应的半抑制量 ＩＣ５０。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 猴头菌发酵液中抑制 ＮＥＧ 反应活性组分的
初步分离
　 　 为了研究猴头菌液态发酵后活性物质存在于
胞内还是分泌到发酵液中，首先对发酵上清液和菌
丝体抽提液进行抑制率的考察，结果见表 １。 由表 １
可知：猴头菌发酵上清液对体外 ＮＥＧ反应的抑制率
远远高于菌丝体抽提液，表明猴头菌液态发酵后具
有抑制 ＮＥＧ反应的活性物质被分泌到发酵液中。
将发酵得到的猴头菌发酵液经乙醇醇沉和乙
酸乙酯萃取后，分别得到 ＨＥ１、ＨＥ２、ＨＥ３ 和 ＨＥ４ 共
４个组分，测定 ４个组分不同浓度下对体外 ＮＥＧ 反
应的抑制率，结果见表 ２。 由表 ２ 可知：ＨＥ３ 具有最
高的抑制活性，而 ＨＥ１ 和 ＨＥ２ 的抑制率明显低于
发酵上清液的抑制率。 对二步醇沉淀得到的较低
ＮＥＧ反应抑制率的 ＨＥ１ 和 ＨＥ２ 进行分析后发现，
两组物质分别为杂蛋白和杂多糖。 ＨＥ４ 的抑制活
性同样明显低于发酵液，表明乙酸乙酯萃取分离起
到了较好的分离效果，将猴头菌中大部分抑制 ＮＥＧ
反应的活性物质分离到有机相中。
表 １　 猴头菌菌丝体抽提液与发酵液抑制体外
ＮＥＧ反应活性的比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＮＥＧ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ａｎｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ
ｆｒｏｍ Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ
样品 ＮＥＧ反应抑制率 ／ ％
菌丝体抽提液 ２１􀆰 ９±１􀆰 ３
发酵上清液 ７７􀆰 ２±０􀆰 ８
表 ２　 猴头菌发酵液初分离组分对 ＮＥＧ反应抑制率的比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＮＥＧ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ ｆｏｕｒ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ
初分离
组分
ＮＥＧ反应抑制率 ／ ％
０􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ １ ｍｇ ／ ｍＬ ２ ｍｇ ／ ｍＬ
ＨＥ１ １８􀆰 ２２±０􀆰 ２３ ２３􀆰 ４０±０􀆰 ７１ ２５􀆰 ２１±０􀆰 ５８
ＨＥ２ ３０􀆰 １１±０􀆰 ５２ ４８􀆰 ０７±０􀆰 ６５ ５７􀆰 ４３±２􀆰 ４４
ＨＥ３ ６１􀆰 ５８±０􀆰 ３９ ７８􀆰 ５０±０􀆰 １６ ８３􀆰 ５３±０􀆰 ２１①
ＨＥ４ ２８􀆰 ０９±０􀆰 ２２ ５１􀆰 ２３±０􀆰 ５４ ５８􀆰 ５３±０􀆰 ４２
　 注：①—与 ＨＥ１、ＨＥ２和 ＨＥ３相比达到极显著差异（ｐ＜０􀆰 ０１）。
２􀆰 ２　 利用 Ｃ１８ ＳＰＥ柱及自制 Ｃ１８低压层析柱分离
活性物质
　 　 由于体外 ＮＥＧ反应需要在 ３７ ℃孵育箱中避光
反应 １５ ｄ，致使抑制率的测定需在 １５ ｄ 后进行，周
期相对较长，因此在对 ＨＥ３进一步分离前需要建立
一种较为方便的快速检测方法。 通过初步的高压
液相二极管阵列分析发现，Ｃ１８ ＳＰＥ 小柱预分离得
到的 ５０％甲醇洗脱液的 ＨＰＬＣ图谱中有 ４个比较明
显的色谱峰，对各保留时间的色谱峰进行全波长扫
描，显示在 ２５０ ｎｍ和 ３００ ｎｍ 左右均有明显的特征
吸收带（图 １、图 ２）。 因此，进一步的分离过程中采
用双紫外（ＵＶ）检测器，检测波长定为 ２５４ ｎｍ 和
２９９ ｎｍ，以此方法达到快速检测的目的。
参照 Ｃ１８ ＳＰＥ小柱的预分离条件，用 Ｃ１８ 自制
低压层析柱（１０ ｍｍ×５０ ｃｍ）进行分离，双紫外检测，
分离图谱见图 ３。 自动部分收集仪按峰收集洗脱
液，２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％和 １００％甲醇洗
脱得到 ７ 组不同的分离组分，分别命名为 ＨＥ３２、
ＨＥ３３、ＨＥ３４、ＨＥ３５、ＨＥ３６、ＨＥ３７ 和 ＨＥ３１，将各组分
浓缩、冷冻干燥后测定 ＮＥＧ 反应的抑制率，测定结
果见表 ３。
９４　 第 ３期 田　 超等：猴头菌发酵液中抑制非酶糖基化反应物质的分离及分析
图 １　 ５０％甲醇洗脱样品 ＨＰＬＣ图谱（总离子强度）
Ｆｉｇ􀆰 １　 ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ５０％ ｍｅｔｈａｎｏｌ
ｅｌｕｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅ （Ｔｏｔａｌ ｉｏｎｓ）
图 ２　 图 １中各峰保留时间全波长扫描
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｓｃａｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｆｒｏｍ ２００ ｔｏ ６００ ｎｍ ｏｆ ＨＥ３
ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｉｎ Ｆｉｇ． １
图 ３　 ＨＥ３ Ｃ１８层析柱分离图谱
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃ１８ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｆｏｒ ＨＥ３ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ
表 ３　 猴头菌发酵液中 ＨＥ３各分离组分对
ＮＥＧ反应抑制率的比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ＮＥＧ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ
ｏｆ ｓｅｖｅｎ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ ｉｎ ＨＥ３
初分离
组分
ＮＥＧ反应抑制率 ／ ％
０􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ １ ｍｇ ／ ｍＬ ２ ｍｇ ／ ｍＬ
ＨＥ３１ １５􀆰 ７０±０􀆰 ８７ ２３􀆰 ８５±０􀆰 ３４ ３０􀆰 ４７±２􀆰 ４７
ＨＥ３２ ３９􀆰 ７６±０􀆰 ３１ ４６􀆰 ５９±０􀆰 ７４ ５３􀆰 ７１±１􀆰 ２７
ＨＥ３３ ３９􀆰 ７７±０􀆰 ５３ ５０􀆰 ００±０􀆰 ６８ ６６􀆰 ５７±０􀆰 ９３
ＨＥ３４ １５􀆰 ２６±０􀆰 ３１ １８􀆰 ５８±０􀆰 ４５ ２０􀆰 ９４±１􀆰 ５７
ＨＥ３５ ４４􀆰 ５２±０􀆰 ２４ ７２􀆰 ７８±０􀆰 ５７ ９２􀆰 ３３±０􀆰 ８４②
ＨＥ３６ ４１􀆰 ６２±０􀆰 ７３ ５２􀆰 ６７±０􀆰 ３８ ６２􀆰 ６２±０􀆰 ６５
ＨＥ３７ １０􀆰 ３１±０􀆰 ６６ １４􀆰 ７０±０􀆰 ５０ １５􀆰 ９２±２􀆰 ２６
　 注：②—与其他组分相比达到极显著差异（ｐ＜０􀆰 ０１）。
由表 ３ 可知：ＨＥ３ 通过 Ｃ１８ 层析柱分离得到的
７组组分中，５０％甲醇洗脱样品 ＨＥ３５ 的体外 ＮＥＧ
反应抑制率最高，在 ２ ｍｇ ／ ｍＬ 浓度下抑制率达到
９２􀆰 ３３％，远高于其他组分的抑制率，说明猴头菌发
酵液中 ＨＥ３５ 是其发挥抑制作用的主要活性成分。
同时 ＨＥ３３和 ＨＥ３６ 也有较好的抑制效果，表明猴
头菌发酵液中可能存在多种物质，对 ＮＥＧ反应具有
抑制作用。
将乙酸乙酯分离萃取得到的 ＨＥ３ 组分经 Ｃ１８
ＳＰＥ小柱（１０ ｇ，６０ ｍＬ）预分离，利用甲醇 水梯度洗
脱，收集各个梯度的洗脱液，对比后发现 ５０％甲醇
洗脱样品对 ＮＥＧ 反应的抑制作用最为明显，表明
Ｃ１８柱可以将猴头菌发酵液中的活性物质进行有效
的分离。
２􀆰 ３　 ＨＥ３５制备液相纯化及 ＬＣ ＭＳ分析
在确定猴头菌发酵液中主要抑制成分后，为进
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
一步提高主要活性物质 ＨＥ３５ 的纯度以进行结构方
面的分析，需要对 ＨＥ３５ 进行高效液相制备，制备图
谱见图 ４。 由图 ４可知：在紫外检测波长 ２５４ ｎｍ 下
无明显突出的单一洗脱峰，而检测波长 ３００ ｎｍ下有
２个单一峰，保留时间分别为 ６􀆰 ５７９ 和 １４􀆰 ２３８ ｍｉｎ，
通过单独收集 ２个单一洗脱峰，其他洗脱液合并收
集，测定体外 ＮＥＧ 反应抑制率发现，仅有保留时间
１４􀆰 ２３８ ｍｉｎ 收集的样品在 ２ ｍｇ ／ ｍＬ 质量浓度下抑
制率达到 ９２􀆰 １７％，与制备前 ＨＥ３５ 的抑制率最为
接近。
ＨＥ３５通过液相的纯化后，将保留时间 １４􀆰 ２３８
ｍｉｎ洗脱峰冻干样品进行 ＬＣ ＭＳ 检测，结果见图
５。 由图 ５（ａ）可知，ＨＥ３５的液相色谱图为近似单一
对称峰，表明 ＨＥ３５ 分离纯化后基本达到色谱纯。
对 ＨＥ３５进行质谱（图 ５（ｂ））分析，发现其相对分子
质量为 ２９４、５８８和 ８８２，为其二聚体和三聚体。
图 ４　 ＨＥ３５的 ＨＰＬＣ图谱
Ｆｉｇ􀆰 ４　 ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＨＥ３５
图 ５　 ＨＥ３５的 ＨＰＬＣ图谱和保留时间 ９􀆰 ３７５ ｍｉｎ样品的质谱
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ＨＰＬＣ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ ＨＥ３５ ａｎｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒａ ａｔ ９􀆰 ３７５ ｍｉｎ
２􀆰 ４　 ＨＥ３５的分子式分析
ＨＥ３５物质呈黄色油状，在波长 ３００ ｎｍ 和 ２５４
ｎｍ下均具有较强的吸收峰，说明 ＨＥ３５ 的结构中含
有苯环，据文献［１６］，此紫外吸收波长为共轭双键
特性，且含有 ３个或 ３个以上共轭双键，属芳香族化
合物。 苯环上存在取代基时，在紫外区的 １ 条吸收
带会向长波移动且吸收强度增大，也验证了 ＨＥ３５
为芳香族化合物，根据紫外吸收和高效液相分析初
步推断 ＨＥ３５可能为黄酮类物质。 然而紫外扫描只
能反映分子中特定基团及附近的结构特征，无法反
映整个分子的特性，在没有标准品对照情况下，
ＨＰＬＣ分析也不能确定 ＨＥ３５的整个分子情况，因此
需要进一步利用质谱与核磁进行检测，检测结果见
图 ６和图 ７。
由图 ６ 可知 ＨＥ３５ 质谱碎片规律。 图 ６（ ａ）中
ＥＳＩ＋：ｍ ／ ｚ＝ ２２７［Ｍ＋Ｈ］ ＋结果表明主要有 ｍ ／ ｚ ＝ ２２６
和 ６８ 这 ２ 个碎片脱落，碎片 ２２６ 为 １ 分子 ＨＥ３５
脱掉 １ 分子异戊二烯（Ｃ５Ｈ８）产生的，因此，结合正
离子质谱图分析，可判断 ＨＥ３５ 分子中除了含有苯
环外，还含有 １ 个异戊二烯基团；图 ６ （ ｂ） ＥＳＩ＋：
ｍ ／ ｚ＝ １７１［Ｍ＋Ｈ］ ＋结果说明主要有 ｍ ／ ｚ ＝ １７０ 和
１２４ 这 ２ 个碎片脱落，可能是 ＨＥ３５ 的母核结构发
生断裂产生的 ２ 个片段；图 ６（ｃ）中 ＥＳＩ＋：ｍ ／ ｚ＝ ２７７
［Ｍ＋Ｈ］ ＋结果表明主要有 ｍ ／ ｚ ＝ ２７６ 和 １８ 这 ２ 个
碎片脱落，碎片 ２７６ 为 ＨＥ３５ 脱掉 １ 分子 Ｈ２Ｏ产生
的，可判断 ＨＥ３５ 分子含有基团—ＯＨ；图 ６（ ｄ）中
１５　 第 ３期 田　 超等：猴头菌发酵液中抑制非酶糖基化反应物质的分离及分析
ＥＳＩ＋：ｍ ／ ｚ＝ １１９［Ｍ＋Ｈ］ ＋，说明主要有 ｍ ／ ｚ ＝ １７６ 和
１１８ 这 ２ 个碎片脱落。
由图 ７可知：化学位移为 １０ ～ １１ 的峰为醛基上
的质子，而化学位移为 ６～７ 的峰可能为酚羟基上的
质子，化学位移为 ４～５的峰为异戊二烯基团双键上
的质子。
图 ６　 ＨＥ３５碎片不同保留时间质谱（ＥＳＩ＋）
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｔｈｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｏｆ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
图 ７　 ＨＥ３５ 的１Ｈ核磁图谱
Ｆｉｇ􀆰 ７　 １Ｈ ＮＭＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＨＥ３５
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
　 　 通过以上分析可知：ＨＥ３５ 分子中可能含有 ２
个苯环、１ 个—ＯＨ 基团、１ 个异戊二烯基团和 １ 个
醛基，２个苯环以黄酮类物质母核结构 Ｃ６—Ｃ３—Ｃ６
形式存在，—ＯＨ 可能位于苯环上，属于酚羟基，异
戊二烯基团可能位于其中 １ 个苯环的某一碳位上，
且连接方式为 Ｃ 􀪅Ｃ断开，取代苯环上的 １个 Ｈ，而
醛基可能位于母核结构 Ｃ６—Ｃ３—Ｃ６中的 Ｃ３上，且
醛基中的 Ｃ原子可能为 Ｃ３中 １个 Ｃ，因为根据相对
分子质量 ２９４计算，已经不能再容纳更多的 Ｃ原子，
综上推断 ＨＥ３５ 的分子式为Ｃ２０Ｈ２２Ｏ２。 确切的化学
结构式有待于进一步的研究。
２􀆰 ５　 ＨＥ３５体外 ＮＥＧ反应抑制水平分析
氨基胍（ＡＧ）是目前公认的最有临床应用前景
的抑制 ＮＥＧ 反应的药物，在欧洲一些国家已进入
Ш期临床试验［１７］，为更好地研究 ＨＥ３５ 对非酶糖基
化反应的抑制效果，选用 ＡＧ作为阳性对照药物，结
果见图 ８。
图 ８　 ＨＥ３５体外非酶糖基化反应的抑制水平
Ｆｉｇ􀆰 ８　 Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＨＥ３５ ｏｎ
ＮＥＧ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
由图 ８可知：在 ０ ～ ２ ｍｇ ／ ｍＬ 时，随着 ＨＥ３５ 浓
度的提高，对 ＮＥＧ反应的抑制率不断提高，ＨＥ３５的
抑制活性与其质量浓度呈现明显的正相关性，线性
趋势线公式为 ｙ ＝ ７６􀆰 ４ｘ，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９８０ ８，半抑制质量
浓度 （ ＩＣ５０ ）为 ０􀆰 ６５ ｍｇ ／ ｍＬ。 当质量浓度超过 ２
ｍｇ ／ ｍＬ时，ＨＥ３５对 ＮＥＧ反应的抑制率趋于稳定，保
持在 ９０％以上。 与 ＡＧ 相比，在低质量浓度（≤１􀆰 ５
ｍｇ ／ ｍＬ）范围内，ＨＥ３５ 抑制效果略低于 ＡＧ，超过一
定质量浓度（≥１􀆰 ５ ｍｇ ／ ｍＬ）后，ＨＥ３５的抑制效果优
于 ＡＧ，并维持在较高水平，从一定程度上也验证了
合成类药物的治疗特点是时间短、作用迅速，活性
物质平稳温和。 然而，ＡＧ 的毒副作用限制了 ＨＥ３５
在降血糖方面的应用，ＨＥ３５ 能否成为一种有效抑
制 ＮＥＧ反应的替代新药或先导化合物，并进一步在
治疗糖尿病方面发挥更大的价值还需要做更多的
研究。
３　 结论
采用液态发酵方法，以抑制 ＮＥＧ反应为检测指
标，利用多种分析方法对具有抑制 ＮＥＧ反应活性的
物质进行分离纯化和分析，结果发现，１ 种相对分子
质量为 ２９４ 的小分子物质 ＨＥ３５ 对 ＮＥＧ 反应具有
良好的抑制作用，分析可能为黄酮类物质，初步推
断分子式为 Ｃ２０Ｈ２２Ｏ２，２ ｍｇ ／ ｍＬ 质量浓度下抑制率
可达 ９２􀆰 １７％，半抑制质量浓度 （ ＩＣ５０ ） 为 ０􀆰 ６５
ｍｇ ／ ｍＬ。 其抑制机制和具体结构正在进一步研
究中。
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（责任编辑　 荀志金）
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷