全 文 ：　 核 农 学 报　2010, 24 (1) : 0020～0024
Journal of N uclear Agricultura l Sciences
文章编号 : 100028551 (2010) 0120020205
用 AFLP技术分离辣椒 m tDNA中与
雄性不育相关的基因片段
吴智明 1, 2 　胡开林 2 　陈晓莹 2 　乔爱民 1
(11仲恺农业工程学院农业与园林学院 ,广东 广州　510225; 2华南农业大学园艺学院 ,广东 广州　510642)
摘 　要 :采用 AFLP技术对辣椒胞质雄性不育系‘北 A’、相应保持系‘北 B’及其杂种 F1 的 m tDNA进行
了比较分析 ,获得了 9条差异谱带 ,对全部差异谱带进行了克隆测序和同源性比对分析。结果表明 ,部
分序列同烟草 NADH脱氢酶亚基 1和核糖体蛋白 L2基因、矮牵牛线粒体嵌合基因 nad4L 2orf25等核苷
酸序列存在 90%以上的相似性。推断这些差异片段可能与辣椒细胞质雄性不育相关。
关键词 :辣椒 ;细胞质雄性不育 ;线粒体 DNA; AFLP
ISOLAT IO N O F m tD NA FRAGM ENTS ASSOC IATED TO
CM S IN HO T PEPPER BY AFLP TECHN IQUE
WU Zhi2m ing1, 2 　HU Kai2lin2 　Chen Xiao2ying2 　Q IAO A i2m in1
(11 College of Agriculture and Landscape A rchitecture, Zhongkai U niversity of Agricultura l and Engineering, Guangzhou, Guangdong　510225;
21 College of Horticulture, South China Agricu ltural U niversity, Guangzhou, Guangdong　510642)
Abstract:M itochondrial DNA (m tDNA ) from pepper CMS line‘North A’, maintainer line‘North B’and their hybrid
F1 were analyzed and compared by AFLP technique. 9 specific fragments were obtained, and were cloned and
sequenced. BLAST analysis in GenBank revealed that partial sequences shared above 90% identity with NADH
dehydrogenase subunit 1, ribosomal p rotein L2 of N icotiana tabacum , nad4L 2orf25 intergenic sequence of Petun ia ×
hybrida m itochondrial DNA at nucleotide level. It was speculated that the specific fragments m ight be related to CMS in
pepper.
Key words: pepper (Capsicum annuum L. ) ; cytop lasm ic male sterility; m tDNA; AFLP
收稿日期 : 2009206203　接受日期 : 2009207230
基金项目 :国家自然科学基金﹙ 30370978﹚
作者简介 :吴智明 (19812) ,男 ,湖南长沙人 ,博士 ,讲师 ,研究方向为蔬菜生物技术与遗传育种。E2mail: zhim ing_wu521@hotmail. com
通讯作者 :胡开林 (19632) ,男 ,广西桂林人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事辣椒和苦瓜遗传育种与分子生物学研究。Tel: 020285280228; E2mail:
hukailin@ scau. edu. cn
　　植物细胞质雄性不育 ( cytop lasm ic male sterility,
CMS)是植物不能产生有功能花粉的一种母系遗传现
象 ,在植物界中普遍存在。将 CMS系与具有正常可育
花粉的父本系或携带细胞核纯合恢复基因的恢复系杂
交 ,生产 F1 杂交种 ,是迄今为止植物利用杂种优势的
一种最理想形式。辣椒是一种以收获果实为目的的世
界性重要蔬菜 ,杂种优势明显 ,利用其 CMS系生产 F1
杂交种时 ,需与相应的恢复系进行杂交。多年来 ,国内
外学者为揭示辣椒 CMS及其育性恢复的分子机理 ,开
展了辣椒雄性不育基因的分子标记 [ 1, 2 ]、恢复基因的
分子标记与基因定位 [ 3～7 ]、不育基因的克隆 [ 8, 9 ]等一
系列有益的探索。
目前 为 止 , 大 多 数 研 究 认 为 , 线 粒 体 DNA
(m itochondrial DNA, m tDNA )是植物 CMS因子的载
体 , CMS与 m tDNA 重排产生不规范的开放阅读框
(open reading frame, ORF)相关 [ 10 ]。运用分子标记技
术比较不育与正常胞质 m tDNA ,克隆不育系特异的扩
增片段 ,是分离克隆 CMS相关基因的一种常用手
02
　1期 用 AFLP技术分离辣椒 m tDNA中与雄性不育相关的基因片段
段 [ 11, 12 ]。本研究以辣椒 CMS系、保持系及其杂种 F1
为材料 ,采用 AFLP技术对三者的 m tDNA进行了多态
性分析 ,并对有关的差异片段进行了克隆、同源性比对
及序列分析。
1　材料与方法
111　植物材料与主要试剂
供试材料为遗传稳定的 100%不育的辣椒细胞质
雄性不育系‘北 A’(A)及其相应保持系‘北 B’(B )和
杂种 F1 ( F1 ) ,由华南农业大学园艺学院蔬菜学系提
供。种子经浸种、催芽后播种于沙床 ,在人工气候箱中
26℃暗培养 15 d,所得黄化苗用于 m tDNA的提取。
限制性内切酶 Taq I 与 Ase I为 New England
B iolabs(NEB )公司产品 ; rTaq DNA Polymerase, dNTPs,
DL2000 Marker, pMD192T vector等分别购自上海申能
博彩、上海生工和宝生物工程 (大连 )有限公司 ; SDS,
蛋白酶 K, Tris饱和酚 ,亲和硅烷 ,剥离硅烷 ,尿素 ,丙
烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺为北京鼎国公司产品 ;琼脂
糖凝胶回收试剂盒与质粒小量提取试剂盒购自北京天
根 ( Tiagen)公司 ;氯仿、异戊醇、95%乙醇、无水乙醇等
常规试剂均为国产分析纯。
112　方法
11211　m tDNA的提取与纯化 　取 20 g黄化苗 ,采用
改良的蔗糖衬垫法 [ 13 ]分离纯化辣椒 m tDNA。通过琼
脂糖凝胶电泳检测 m tDNA的完整性 ,以λDNA为参照
估算 m tDNA的浓度。将 m tDNA溶液浓度定量到 100
ng/μl保存备用。
11212　AFLP分析 　AFLP分析用接头和引物为 :
Taq I 接 头 : 5′2GACGATGAGTCCTGAC23′, 5′2
CGGTCACGGACTCAT23′;
A se I 接 头 : 5′2CTCGTAGACTGCGTACC23′, 5′2
TAGGTACGCAGTC23′;
预扩引物 : 5′2GACGATGAGTCCTGACCGA23′, 5′2
CTCGTAGACTGCGTACCTAAT23′;
选 择 性 扩 增 引 物 : T42T11 分 别 为 5′2
GATGAGTCCTGACCGAMN23′, A42A11 分 别 为 5′2
GACTGCGTACCTAATMN23′,其中 M分别为 G/A, N分
别为 G/A /T/C;以上接头和引物由北京奥科生物技术
服务有限公司合成。
AFLP分析参考 Bachem等 [ 14 ]的方法 ,略作改动。
m tDNA用量为 300ng,酶切操作如下 :在 m tDNA溶液
中依次加入 10 ×NBE Buffer 210μl, 100 ×BSA 012μl,
Taq I(20U /μl) 015μl, ddH2 O补足 20μl, 65℃保温酶切
3h;然后在上述酶切体系中直接加入 10 ×NBE Buffer
210μl, ddH2O 715μl, A se I ( 10 U /μl) 015μl,稍混匀 ,
37℃再保温酶切 3h。取 8μl酶切产物电泳检测是否
酶切完全。在完全酶切的产物中依次加入 : Taq I
(50μmol/ l)接头 1μl, A se I(5μmol/ l)接头 1μl, 10 ×T4
DNA L igase Buffer 3μl, 50% PEG4000 2μl, T4 DNA
L igase (5 U /μl) 1μl, ddH2O补足 30μl, 22℃下保温 5h,
65℃加热 10m in终止反应。连接产物稀释 10倍作为
预扩增的模板 ,预扩增体系总体积 25μl,其中包括 :模
板 DNA 5μl, 10 ×PCR Buffer 215μl,MgCl2 (25mmol/L)
210μl, dNTPs (215mmol/L ) 215μl,预扩引物各 110μl,
rTaq DNA Polymerase ( 5 U /μl) 012μl, ddH2 O 1018μl。
预扩增程序 : 94℃ 5m in; 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃
1m in, 25个循环 ; 72℃ 7m in。预扩产物稀释 20倍作为
选择性扩增的模板 ,选择性扩增体系与预扩增体系相
同 ,扩增程序为 : 94℃ 5m in; 94℃ 30 s, 65℃～56℃ 30
s, 72℃ 1m in, 12 个循环 (每循环退火温度降低
017℃) ; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s , 72℃ 1m in, 24 个循环 ;
最后 72℃ 7m in。选择性扩增产物在 6%变性聚丙烯
酰胺凝胶上电泳 ,电泳采用 B io2Rad公司 POW ER PAC
3000 垂直电泳仪 , 70W 恒定功率 45℃恒温电泳
90m in。银染显色。
11213　差异片段的回收、克隆与序列分析 　用手术刀
将特异片段从玻璃板上剥离 ,放入 015m l离心管中 ,加
入 50μl ddH2 O 4℃浸泡过夜 , 沸水浴 15m in, 室温
12000 r/m in离心 10m in,取上清液 5μl作为二次 PCR
的模板 ,采用相应的选择性扩增引物组合扩增。扩增
程序和体系同预扩增。PCR产物经 210%的琼脂糖凝
胶电泳分离 ,用离心柱式琼脂糖凝胶回收试剂盒回收
纯化后直接连接到 pMD219T载体上 ,转化后经蓝白斑
筛选 ,挑取白色克隆提取质粒 ,酶切检测确定为阳性克
隆后送上海英骏生物技术公司测序。序列查询与同源
性比对使用美国国家生物技术信息中心 (NCB I)数据
库在线 BLAST网络服务工具进行 ,网址为 http: / /
www1ncbi1nlm1nih1gov/blast/B last1cgi。
2　结果与分析
211　m tDNA的提取、双酶切与预扩增
采用改良的蔗糖衬垫法提取了辣椒不同材料的
m tDNA ,并通过琼脂糖凝胶电泳检测了 m tDNA 的质
量。电泳结果 (图 12A)表明 ,所提取的 m tDNA完整性
较好 ,基本没有降解 ;来自不育系、保持系和杂种 F1 的
m tDNA的浓度稍有差异 ,但都能满足后续试验要求。
12
核　农　学　报 24卷
利用 Taq I和 A se I双酶切 m tDNA后电泳结果 (图
12B )表明 ,酶切产物成均匀的弥散带分布 ,分子量多
集中于 011～210kb之间 ,说明 m tDNA酶切比较彻底。
预扩增产物电泳检测也呈现为一片连续的弥散条带 ,
多分布于 011～110kb之间 (图 12C) ,且浓度较高 ,说
明接头的连接效率较高。将预扩增产物稀释 10倍后
作为选择性扩增的模板。
图 1　辣椒 m tDNA (A)、酶切 (B)与预扩增 (C)电泳结果
Fig. 1　Agarose gel electrophoresis of m tDNA (A) ,
m tDNA digestet by enzymes (B) and the
p re2amp lification p roducts (C) of pepper
M为 DL2000 marker; A图 1、2、3泳道表示 λDNA,上样量分别为
50、100和 150ng, 4、5、6泳道分别表示 A、B和 F1 的 m tDNA; B图为
m tDNA经 Taq I和 Ase I双酶切 , 123泳道分别表示 A、B和 F1 ; C图
123泳道分别表示 A、B和 F1 m tDNA预扩增结果。
M: DL2000 Marker. A: lane 123 indicatedλDNA, 50ng, 100ng and
150ng, respectively; lane 426 indicated m tDNA of A, B and F1 1 B:
m tDNA digestet by Taq I and A se I, lane 123 indicated A, B and F1 ,
respectively1C: the p re2amp lification p roducts of A, B and F1 ,
respectively1
212　AFLP分析
选用 8个 Taq I引物与 8个 A se I引物组成的 64
对选择性扩增引物组合对辣椒胞质雄性不育系‘北
A’、相应保持系‘北 B’及其杂种 F1三者 m tDNA进行
AFLP分析。结果表明 ,所有引物组合都能扩增出稳
定、清晰的条带。每对引物能扩增出 40条左右的清晰
可读条带 ,条带分子量大多集中在 50～600bp之间。
筛选出 2种类型的差异条带 :第一种为在不育系‘北
A’与杂种 F1 中同时存在 ,但在‘北 B’中缺失的带 ,共
4条 (部分结果见图 22A ) , 分别命名为 A4T72A、
A7T1121A、A7T1122A 和 A9T112A。另外一种类型的
差异带为在保持系‘北 B’与杂种 F1 中同时存在或缺
失 ,但与不育系‘北 A’存在差异的带 ,共 12条 (部分
结果见图 2B) ,将它们分别命名为 A4T112A、A4T112B、
A6T62B、A7T72B、A8T72B、A8T82A、A8T112A、A8T112
B、A10T102A、A11T72A、A11T72B 、A11T112B。为更全
面地了解序列信息 ,对 16条差异条带全部进行了克隆
和测序。
图 2　不育系、保持系和杂种 F1 的 AFLP图谱
Fig. 2　Mapp ing of AFLP in CMS line,
maintainer line and its hybrid F1
A、B和 F1 分别表示不育系‘北 A’,保持系‘北 B’
和杂种 F1。箭头所指表示差异带。
A, B and F1 indicated CMS line‘North A’, maintainer line‘North B’
and hybrid F1 , respectively1 A rrow standed for differential band1
213　差异片段序列测定与功能预测
将 16条差异条带克隆后测序 ,发现 A4T112A 同
A8T112A、A4T112B同 A8T112B、A11T72A同 A11T112B
只有引物部分的最后一个选择性碱基存在差异 ,其他
序列完全一致 ,可以认为相同的序列 ,筛选获得的差异
带实际为 13 条。将 13 个片段的核苷酸序列在
GenBank进行 B last比对分析 ,有 9个片段能找到相似
性较高的序列 (表 1)。其中 , A4T112A与马铃薯线粒
体基因组序列存在 95%的相似性、与矮牵牛 m tDNA
中的嵌合基因 nad4L 2orf25存在 98%的相似性 ; A7T72
B与烟草线粒体中核糖体蛋白 L2存在 94%的相似
性。前人研究证实 , orf25在不育系中特异表达并编码
一个 25kD 的特异蛋白 , 与玉米 [ 15 ]、矮牵牛 [ 16 ]、高
粱 [ 17 ]、烟草 [ 18 ]等多种作物 CMS相关 ,而编码核糖体
蛋白 L2 rps l2基因 [ 16 ]是矮牵牛 CMS基因 S 2pcf的重
要组成部分 ,据此推测这 2个基因片段可能与辣椒
CMS密切相关。另外有 4 个片段 (A4T72A、A7T112
1A、A8T82A和 A10T102A)没有找到任何相似序列信
22
　1期 用 AFLP技术分离辣椒 m tDNA中与雄性不育相关的基因片段
表 1　差异条带 B last分析结果
Table 1　Results of B last of specific fragments
名称
name
长度
length
相似序列信息
information of homologous sequence
相似性
comparability
E值
E value
A4T112A3 265bp | FJ37497411 | Solanum lycopersicum m itochondrial genome sequence 95% 7e2122
|AB02671611 | Petunia x hybrida m itochondrial DNA, nad4L 2orf25 intergenic sequence 98% 1e292
A4T112B 274bp | FJ37497411 | Solanum lycopersicum m itochondrial genome sequence 98% 1e2131
|BA00004211 |N icotiana tabacum m itochondrial DNA, NADH dehydrogenase subunit 1
A6T62B 177 bp |AE00786912 | Agrobacterium tum efaciens str. C58 circular chromosome 98% 1e281
A7T72B 213 bp | FJ37497411 | Solanum lycopersicum m itochondrial genome sequence 98% 2e257
|BA00004211 | N icotiana tabacum m itochondrial DNA, comp lete genome, ribosomal p rotein L2 94% 3e250
A8T72B 259 bp |AC14929111 | Solanum dem issum chromosome 5 clone PGEC568H16 69% 2e215
A8T82A 239 bp unknown
A10T102A 165 bp unknown
A11T72A 425 bp |DQ34795811 | Solanum bulbocastanum cultivar PT29 chlorop last 93% 2e283
A11T72B 437 bp |AM08720013 | Solanum lycopersicum comp lete chlorop last genome, cultivar IPA26 92% 1e281
A4T72A 158 bp unknown
A7T1121A 186 bp unknown
A7T1122A 128 bp | CP00088011 | Salm onella enterica subsp1 arizonae serovar 90% 1e235
A9T112A 203 bp |AC23166811 | Solanum tuberosum chromosome 11 clone RH067L08 70% 0160
　　注 : 3 2A表示差异条带克隆自不育系 , 2B表示差异条带克隆自保持系。
Note: 3 2A means the differential fragments cloned from CMS line and 2B means cloned from maintainer1
息 ,推测它们可能是与辣椒 CMS相关的新的 DNA片
段。
3　讨论
m tDNA是植物 CMS相关基因的载体 [ 19 ]。不育系
线粒体基因组中某些位点经分子内或分子间重排产生
了不同于保持系 m tDNA的特异位点 ,这些位点是 CMS
产生的分子基础。而利用分子标记技术比较不育系与
保持系 m tDNA结构的差异 ,可以进一步鉴定出与 CMS
相关的线粒体基因。牟秋焕等 [ 20 ]以 V型小麦 CMS系
及相应保持系、恢复系和杂种 F1 为材料 ,用 ISSR、
SRAP、RAPD分子标记技术对它们的 m tDNA进行了比
较分析 ,找到了一些不育系特有或缺失的片段。舒友
菊等 [ 21 ]以水稻 K型雄性不育的不育系、保持系以及杂
种 F1 为研究对象 ,利用 AFLP分子标记技术从上述材
料的 m tDNA中找到了不育系与 F1 所共有的一个 442
bp的特异片段 ,同源性比对结果表明该序列与水稻两
种未知功能蛋白的表达相关。通过对与 CMS相关的
线粒体基因结构的深入研究发现 ,这些基因都有一段
嵌合的 orf序列 ,并且嵌合基因通常与一至多个线粒体
基因共同转录 ,影响线粒体功能的正常发挥。玉米不
育系 m tDNA 中的 T2urf13 基因 [ 19 ]、矮牵牛不育系
m tDNA的 pcf基因 [ 16 ]就是典型的例子。本试验采用
AFLP技术对辣椒 CMS系及其相应保持系 m tDNA的
差异进行了比较分析 ,共找到 13条不育系或保持系特
有的差异条带 ,部分条带与马铃薯、矮牵牛、番茄中线
粒体基因存在较高的相似性。特别是片段 A4T112A,
经过同源性比对分析发现 ,其与矮牵牛 m tDNA中的嵌
合基因 nad4L 2orf25存在 98%的相似性 ;而多项研究已
经证实 , orf25与玉米 [ 15 ]、矮牵牛 [ 16 ]、高粱 [ 17 ]、烟草 [ 18 ]
等多种作物 CMS相关。据此我们推测它和辣椒 CMS
或许存在一定的联系。
从遗传学上分析 , CMS系与相应保持系的胞质来
源不同 ,所以用 AFLP等分子标记技术很容易找出两
者 m tDNA之间的差异 ,但要在众多的差异带中鉴别真
正与 CMS相关的差异片段又有一定的困难。然而 ,
CMS系与其杂种 F1 的胞质来源相同 , m tDNA结构在
理论上应该是相同的 ,其雄性不育性的恢复是核恢复
基因对不育基因进行调控作用的结果。比较杂种 F1
和其母本不育系 m tDNA的差异就反映了恢复基因引
入前后不育系 m tDNA结构的变化 ,这种变化极可能与
CMS有关。因此 ,本试验在选材中引入了杂种 F1 ,用
相同的选择性扩增引物同时对 CMS系、保持系与杂种
F1 三者的 m tDNA进行扩增 ,分析其多态性 ,希望能够
证实不育系在引入恢复基因后 m tDNA的结构发生了
变化。结果找到了 9个在 CMS系和杂种 F1 m tDNA之
间表现差异的片段。这 9个片段是否与辣椒 CMS相
关 ,还有待进一步深入研究。
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