全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(5)：359—365
Journal ofTropical and SubtropicalBotany
甘薯 NBS类抗病基因类似物的分离与序列分析
陈观水 ， 周以飞b， 林 生b， 潘大仁a
(福建农林大学，a．生命科学学院；b．作物科学学院，福州 350002)
摘要：利用 已克隆植物抗病基因 NBS(Nucleotide binding site)序列中的保守模体(motif)“P-loop”和“GLPL”合成简
并引物，以甘薯(&omo~a batatas)栽培品种青农 2号基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，通过 T／A克隆、测序和序列分
析，共得到 l5条具有连续 ORF的抗病基 类似物(Resistance gene analogues，RGAs)序列，它们之间核苷酸序列间的相
似性系数在 41．2％一99-4％之间，而相应推测的氨基酸序列问的相似性系数在 20．6％一l00％之间，同时对分离的RGAs
的核苷酸和氨基酸序列进行系统 发育树分析，表明 甘薯 RGAs可分为 TIR fDrosophila Tol Or human inter1eukin
receptor—like)和 nonTIR两类。对 甘薯 RGAs和 5个 已克隆植物 NBS的氨基酸序列进行结构分析表明，它们包括
“P—loop”、“Kinase一2”、“Kinase一3a”、“GLPL”4个抗病基因所共有的保守模体 。这些表明甘薯与其它物种的 NBS
类 RGAs可能具有同样的起源和进化机制。
关键词：甘薯；NBS；抗病基因类似物；基凶分离；序列分析
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1005—3395(2006)05—0359—07
Isolation and Sequence Analysis of NBS-type Resistance
Gene Analogues in Sweet Potato(Ipomoea batatas(L．)Lam．)
CHEN Guan—shu i ， ZHOU Y i—fe i ， L I N Sheng ， PAN Da—rena
( Agriculture and Forestry University；a．Colege of￡ Science；b．Colege of Crop Science，Fuzhou 350002．China)
Abstract：Degenerate primers based on conserved motif(P—loop and GLPL)of the nucleotide binding site(NBS)
region from the cloned plant disease resistance genes were used to isolate resistance gene analogues(RGAs)from
genomic DNA of the sweet potato( omoea batatas(L．)Lam．)cultivar Qingnong No．2．The desired bands
(-500 bp)were purifed flom the gel，and then cloned by T／A cloning．After sequencing and analyzing by
alignment，1 5 RGAs with uninterrupted open reading flames(ORFs)were obtained．Sequence identity among the
1 5 RGA nucleotide sequences ranged flom 4 1．2％ to 99．4％ ． while the 1 5 RGAs deduced amino acid sequences
showed identity ranged from 20．6％ to 1 00％． The phylogenetic analyses for RGA nucleotide sequences and the
deduced amino acids showed that RGAs from sweet potato were divided into two groups，TIR(Drosophila Toll or
human interleukin receptor-like)type and nonTIR type．The analysis of RGAs amino acid sequence structures
suggested that they contained the domains such as P—loop，Kinase一2，Kinase一3a，and GLPL
． These results showed
that NBS type RGAs isolated flom sweet potato might have the same origin and mechanism of evolution as that in
other plants．
Key words：Sweet potato；NBS(nucleotide binding site)；RGA (resistance gene analogues)；Gene isolation；
Sequence analysis
收稿 日期：2006—03—29 接受 日期 ：2006—06—13
基金项目：国家 自然科学基金(30370900)；福建省科技攻关计划重大项目(2003N001)资助
通讯作者 Coresponding author
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热带亚热带植物学报 第 l4卷
植物在生长过程中常会受到病原微牛物的侵
袭，为了抵御外来微生物的危害，植物在 长期的进
化过程中，形成了一系列复杂的抗病防御机制，如：
由于植物先天性结构屏障和固有的毒性化合物的
存在而表现的非寄主抗性，以及植物由于抗病萆因
(Resistance gene，R1的存在而表现出的局部或系统
抗性[1-3]。因此，克隆与分析植物抗病基广人l，对阐明植
物抗病性的分子机制及改良作物抗病性具有重要
的意义。
目前已从植物中分离到近 50个抗病基冈，通
过对其 产物分析 发现这些抗病基 冈编码 的产
物存在极其相似的结构域 ，如核苷酸结合位点
(nucleotide binding site，NBS)、富含亮氨酸重复序列
(1eucine．rich repeats，LRR)、丝氨酸 ／苏氨酸激酶
(serine．threonine kinase， STK)、亮氨酸拉链结构
(1eucine zippers，LZ)、跨膜结构域(transmembrane
domain，TM)、Tol白介素 一l 域(Tol—interleukin．1
region，TIR)等。根椐其产物中保守结构域的不同，
可将抗病基因分成 5类，其中NBS类是已分离抗
病基因中最大的一类，它们广泛存在于植物的基
组中[3．5】。 由于所有NBS类抗病基因都含有许多保
守模体 (conserved motif)，如 NBS区域 中的 “P．
1oop”、“GLPL”等，这为基于同源序列的NBS类抗
病候 选基 因 的克 隆提供 了理 论上 的可 能性 。
Kanazint6]和 Yu【7]报道用抗病基因产物的保守序列
为 引物 扩 增 R基 冈 类似 序 列 (resistance gene
analogues，RGA)后，目前己在大豆 (Glycine m似
L．)、水稻 (Oryza saliva L．)、花生 (Arachis hypogaea
L．)等近 20种植物中分离到了许多抗病基因类似
物(resistance gene analogues，RGAs)序列[6-191，并对其
起源、多样性和进化机制进行了研究。
甘薯 ( omoea batatas(L．)Lam．)是双子Ir植
物，属于旋花科 (Convolvulaceae)甘薯属，是重要
的粮食、饲料、T业原料及植物能源作物。我国是世
界上栽培而积最大的甘薯牛产国，年牛产量约 1．0×
l0s t，约 世界甘薯总产量的85．0％[20-21]。甘薯病害
对甘薯产量与品质造成很大的影响，如甘薯线虫病
和病毒病。m于甘薯足 源八倍体，基凶组庞大且
复杂，迄今对f r薯抗病荩 的分子克隆及抗病基因
进化研究还未 报道。本研究根据其它植物的抗病
基 编码产物的保 、L，序列设汁简并引物，通过 PCR
扩增从甘薯基『人l组L}1分离抗病 [大l类似物(RGAs)，
以分析甘薯 RGAs序列的多样性及进化关系，为深
入研究甘薯抗病基冈奠定 础。
1材料和方法
1．1植物材料
植物材料为抗根结线虫病的甘薯品种青农 2
号，由广东省农、l 科学院作物研究所提供。
1．2甘薯基 因组 DNA的提取及简并引物的设计
甘薯基冈组 DNA提取，根据郭金平等【21]的方
法稍作修改。简并引物根据 Grol一4，Gpa-2， —J．J等
抗病基因所编码产物的 NBS区域的保守序列设
计，引物由华大基冈一 海鼎安牛物科技有限公司
合成。引物序列见表 l。
1．3 PCR扩增及产物的克隆与测序
PCR扩增 反应 总体 积 为 20 Ll，其 中包含
l0 mmol／L Tris—HC1(pH 8．3)， 50 mmol／L KC1，
2．0 mmol／L MgCI l 00 ixmol／L dNTPs，0．3 ixmol／L
引物浓度，DNA模板 50 ng l一， 酶 1．5 u。
将样 品放入 Eppendorf DNA扩 增仪中进 行
PCR扩增。反席程序为：94℃ 5 min，1个循环；94℃
45 S，55。C 50 S，72℃ 90 S，35个循环；72。C延伸
表 1 用于扩增 的简并 引物
Table l Degenerate primers uscd in amplification
F：【l 『，nJ0l物 Forward primer：B：反『 fjl物 Reverse primer N=A／T／C／G：M：A／C：W：A／T：S=C／G：Y：C／T
K：G／T：V=A／C／G：H=A／C／T：D：～ G／T：R=A／G
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1．4序列分析
I 执f jf门坎 f r随 ：91J果；lj BLAST ff』 ，1．
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6．0 找 ORF¨删l千f戊氟 睃J≯列． fI J Clustal
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列．鳅1 川Mcga 3 l构址系统技舟丰叫川 {J Bootstrap
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-W(U739l6)、GroI-4(AY1 q6l 5_】、Gp．J-2(AFl95939)
2 嗣1分忻
2．1甘薯 RGAs的分离与鉴定
刊 {；Lil l L lIq馘 J^嚏 守 。 构域 『戍向
I lj ’l1．I材 P(R士埔- k
Fig I Elcctraphor~logmm 【fP(R ampli ication uf
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和 F6．Bl =Ir埔 l¨{ 黎约 500 bp f q餐惟 ( l·，
351． E引物卦【台术扩增⋯f 何茶佑 州 坪f 物
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DQ341406．DQ341407．DQ377949一DO377957． j 5
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(ORF)，_】l含 引物改汁的 个 1 } 针匈域．_lIj
汝仃敏 仃fu』lJ蝴谈化J L(Splicing site)．
2．2甘薯 RGAs的分析
将从 管·l z舒窿获得的 l 5个 RGAs il：J枚 ＼：舵
『 州ll】ClustalW l 8干¨ Mega 3 I进仃J 刮多样
分 从所均建的N_J树( 2)iI i-J以行⋯，这此
RGAs J 列i叮，’为阿上类，第 1类小成n l戍 皱 ．
f』I 3个 RGAs l RGA2、RGA3、RGA5一RGAl I．
第 1炎仪仃 2个RGAs序列(RGA】、RGA4) ．J c
屦暧的分析 比 l核}j 艘 分析 放 l 5 1、
RGAs fl0梭 f"陵 刈问的十¨ 似 彖敏 。^4I 2 一
99 4％之间． 矧心排测的 艘宁州Il¨ 1 Ⅲ
系数 20 6％一100q4之川c表!l，
2．3甘薯 RGAs的比较分析
将 JI挎n I5祭RGA旧氯}．￡峨宁L；IJ。 I 一 _
1：9"}／ggJ NBS 域j=!f{ J 系统艇 ¨，忻
兜陋的抗痫 也 l铃格 【5 r；](I]IHI⋯j¨ ⋯，f
L)的 Gr．1—4、 Ⅲ．2 Ji ， ．61i(，1¨ Jf f
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} 抗病 ，而j￡它1．￡Iq J禹 ‘T[R—NBS奄执 r 】E
从系统发阿忖 J¨‘以厅⋯，分 19 1 5蓊RGAsI
别‘{f．RGAl、RGA4属 J nonTIR，NBS炎『，0 d J。
I^l_fil1 宋 I 3条RGAs序列屈 r FIR NBS炎址
( 3) 薯 ] 硪j-I¨ I!i物．水驯究 』“ rIf
I}1．【物 ⋯-l JllJ仃 TIR—NBS ll1onTIR—NBS ÷．L
l jI￡ fl：lfi Jl’々。 I I竹1 投 ．
f,IJ⋯ Clustal W1．H刊 Il。 1 5餐 R(iAs一
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362 热带亚热带植物学报 第 14卷
斜对角右 E方为甘薯 RGAs问核苷酸序列n_iJ的相似性系数，斜对角71 下方为氨基酸序列问相似性系数。The similaritypercentage among
,mcleotide sequences and amino acid sequences are given above and below the diagonal，respectively．
枞 ’}I I英
J
r————————————畸
啦。l
图2 用邻接法得出的甘薯 RGAs的核苷酸序列的系统发育树
Fig．2 Phylogenetic tree for nucleotide sequences isolated from sweet potato by nei bor-joining method
基酸序列 以及 Grol一4、Gp0—2、Mi— ．J、Ⅳ、 基 因的
NBS区域进行 多序列对 比分析 。结果表 明：这些
RGAs序列具有 NBS类抗病基因的4个保守模体：
“P-loop”、“Kinase一2”、“Kinase一3a” 和 “GLPL”。
并且TIR—NBS类抗病基 中的 Kinase一2的共有序
列可总结为(V／L／I)(L／I／V)(L／I／V)V(L／I／V)DD(V／I)X，
最后一个氨基酸为任意氨基酸，通常为色氨酸(D)，
而在 nonTIR—NBS中 Kinase一2的共有序列可总结
为(Y／V)(L／V)(L／I／V)V(L／V)DD(I／V)W，最后一个氨
基酸为人冬氨酸(w)(图 4)，这与 Meyers等的研究
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第 5期 陈规水等：甘薯 NBS类抗病基因类似物的分离与序列分析 363
1ms}安
，卜⋯
3 }f薯RGAs的氨荩酸序列 已兜降抗病基 的NBS 域的N-J系统发育树
Fig．3 Neighbor-joining tree based on alignment ofamino acid sequences in swcet potato RGAs and NBS region of isolated disease resistance genes
树枝上的数7为 Bootstrap值 (1 000次 复)。The numbers on the branches represent bootstrap values(for 1 000 replications)．
n
n。 R
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Kinase3a GLPL
4 汁薯RGAs氰 酸序列 5个 矢I抗病犟 NBS 域的多最序列比对
Fig．4 Multiple amino acid sequence alignment in sweet potato RGAs with the NBS region of
five known plant disease resistance genes constructed with Clustal W 1 8
最 F乃‘的横线农示该 I《为两类RGAs j i】的 ．)：结构域。Themutual domains arc denoted by underlincs
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364 热带亚热带植物学报 第 14卷
结果一致i2]。
3讨论
3．1甘薯 RGAs的分离与鉴定
利用根据己克隆的植物抗病基因 NBS区保守
结构域设计的简并引物组合 F3．B2和 F6．Bl，成功
地从甘薯中分离到 RGAs。对 15条 RGAs的结构分
析表明，这些 RGA序列中含 NBS类抗病基冈的保
守结构域，如 P．1oop、Kinase．2、GLPL等，并且这螳
序列具有连续的可阅读框(ORF)。因此，这 RGA
序列中的一部分可能是功能性的抗病基因的部分
序列。
获得的其它 5条序列中，有的与ABC转运器
和反转录转座『大J予订 一定的相似性，这说明NBS
序列与信号转导【大】子 一定的进化关系，l 时也说
明，转座 可能在抗病摹因进化过程中起了一定的
作用。
模式植物全基【大J的测序结果表明，NBS类的植
物抗病 『天I在植物基因组中广泛存在。存拟南芥
(Arabidopsis thaliana)基冈组 中，l％的基因为 NBS
类抗病基因，而在水稻基 组中具有 660个 NBS
类的抗病基因 。通过相关抗病基因序列的简并引
物的设计与PCR扩增，能够有效地研究各种植物的
RGAs。我们的研究结果表明，在甘薯耩因组中同样
含有大量的NBS类的序列，由于甘薯是同源六倍
体，基 组庞大且重复序列多，有关甘薯分子生物
学方面的研究进展缓慢。因此充分利用生物信息学
的相关技术研究乃至克隆甘薯抗病基因不失为 一
条捷径。
3．2甘薯 RGAs的多样性及进化关 系分析
目前已从近 20种植物中分离了NBS类的植
物抗病基因和 RGAs。本研究首次对甘薯中NBS类
RGAs的多样性及复杂度进行研究。分离的 l5个具
有连续 ORF的 RGAs可分为两个亚类：TIR．NBS
和 nonTIR．NBS。序列之间的相似程度在 41-2％一
99．4％之间，RGA2与 RGA5之间具有最高的相似
性 f99．4％)，RGA1与 RGA9之 间相 似 性 最 低
f41．2％1(表 2)，因此 RGA2与 RGA5可能是同来
自同一基因的不同拷贝，而 RGA1与 RGA9则可能
代表趋异起源(divergent origins)。研究表明，在植物
基因组中的RGA序列的多样性可能是由于不等交
换造成的，但造成 RGA序列的多样性和复杂度的
遗传机理直接证据还待进一步研究。
遗传学与基冈组学的研究为NBS类抗病基因
的进化及变异产生机理提供了新的见解。目前，关
j 植物抗病 因进化的遗传机制丰要有两个：逐步
进化趋异 (slowing evolving divergence)假说和快速
进 化过程 (rapidly evolving process)，本研 究结果 为
这两个遗传机制提供了一些佐证【l2】。通过对 l 5条序
列的比村分析表明： 保 )：结构之问存在许多点突
变，小片段的捅入或缺失事件，它们足甘薯 RGAs趋
异的源 泉，这与在咖 啡 (Coyf~a arabica)和花生
(A rachis h)pogaea L．)中的研究结果相似 ”。这表
明， 薯中，NBS类抗病 的进化是逐步进化
趋异，而不是快速进化过 ，这与前人火f抗病基
l大】进化的研究结果相符[2,24】。
木研究 首次对甘薯中RGAs进行分离研究，并
对甘薯巾NBS类抗病基l 的多样性和进化关系进
行了初步的探讨，还有许多工作还仃待_) 进一步研
究，比如所分离到的RGAs与甘薯中抗病基因的关
系及 甘薯其它类别 RGAs的分离和进化机制，甘薯
抗病基因的兜隆等等。
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