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Curcin Content of Jatropha curcas Seeds and Its Correlationship with Seed Traits in Dry-hot Valley of Jinsha River

金沙江干热河谷地区麻疯树单粒种子核糖体失活蛋白含量及其与种子性状的相关性



全 文 :收稿日期: 2011–12–06    接受日期: 2012–04–05
基金项目: 国家自然科学基金项目(31070301)资助
作者简介: 谢瑜,硕士研究生,主要从事植物分子生物学下游技术研究与应用。E-mail: xeeyoo2000@yahoo.com.cn
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: xuying@scu.edu.cn
热带亚热带植物学报 2012, 20(5): 425~431
Journal of Tropical and Subtropical Botany
麻 疯 树(Jatropha curcas L.)为 大 戟 科(Euphor-
biaceae)麻疯树属多年生半肉质小乔木或大灌木[1],
主要分布在热带和亚热带地区。麻疯树种子含油
量高,品质好,因此其具有作为能源植物的开发价
值[2–3]。此外,麻疯树全株还含有多种活性成分,有
着重要的农药和医药价值[4–5]。
金沙江干热河谷地区麻疯树单粒种子核糖体失活
蛋白含量及其与种子性状的相关性
谢瑜, 蔡峰, 邵子静, 吉柔风, 赵欣平, 徐莺*, 陈放
( 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部国家重点实验室,成都 610064)
摘要: 对金沙江干热河谷地区麻疯树(Jatropha curcas L.)种子中具有抗肿瘤活性的核糖体失活蛋白 curcin 含量及其生物学性
状进行研究。结果表明,用酶联免疫吸附法测定麻疯树单颗种子的 curcin 含量为 0.275~3.183 mg g-1,平均(1.369±0.055) mg g-1。
Pearson 相关性分析表明:单粒麻疯树种子的 curcin 含量与种子其他性状的相关性均未达显著水平,但与种子质量、种仁质量及
含油量存在一定程度的负相关,而与出仁率和可溶性蛋白含量存在一定的正相关,且与可溶性蛋白含量的正相关系数(0.190)
和与含油率的负相关系数(–0.177)较高。这表明可在金沙江干热河谷地区开展高 curcin 含量麻疯树种质资源收集和选育工作,
以及培育高含油量、高 curcin 含量的双高品种,以提高麻疯树生物燃油产业的综合效益。
关键词: 麻疯树; 核糖体失活蛋白; Curcin; 生物学性状; 金沙江干热河谷
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2012.05.001
Curcin Content of Jatropha curcas Seeds and Its Correlationship with
Seed Traits in Dry-hot Valley of Jinsha River
XIE Yu, CAI Feng, SHAO Zi-jing, JI Rou-feng, ZHAO Xin-ping, XU Ying*, CHEN Fang
(Key Laboratory of Bio-resources and Eco-environment, Ministry of Education, College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)
Abstract: Curcin content and some seed traits of Jatropha curcas seed collected from Dry-hot Valley of Jinsha
River were determined. The results showed that curcin content by Enzyme-linked immunosorbent assay ranged
from 0.275 to 3.183 mg g-1 with average of (1.369±0.055) mg g-1. Pearson correlation analysis indicated that curcin
content had no significant correlations with some seed traits, such as seed weight, kernel weight, oil content, seed-
kernel rate and soluble protein content. There were a certain negative correlation between curcin content and seed
weight, kernel weight and oil content, on the contrary, curcin content had a certain positive correlation with seed-
kernel rate and soluble protein content. It suggested that germplasm collection and breeding with high curcin
content of Jatropha curcas could perform in Dry-hot valley of Jinsha River, and breed new variety with high
oil and curcin contents of Jatropha curcas, so as to improve comprehensive efficiency of Jatropha curcas bio-
fuel industry.
Key words: Jatropha curcas; Ribosome-inactivating protein; Curcin; Biological characteristics; Dry-hot valley of
Jinsha River
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核 糖 体 失 活 蛋 白(Ribosome-inactivating
proteins, RIPs)是 一 类 广 泛 存 在 于 植 物 和 真 菌 中
的蛋白毒素,作用于真核细胞核糖体,抑制蛋白
质 合 成[6]。 根 据 一 级 结 构 的 不 同,RIPs 分 为 单
链(I 型)和 双 链(II 型)两 种[7]。 Ⅰ 型 RIP 分 子 量 约
26~30 kD,多数为碱性和糖蛋白[8],如天花粉蛋白
(trichosanthin)[9]、美 洲 商 陆(Phytolacca Americana)
抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein, PAP)[10] 等。
Ⅱ型 RIP 由类似于 I 型 RIP 的 A 链和具有凝集素
特性的 B 链组成,两条肽链通过二硫键连接。蓖麻
(Ricinus communis)毒蛋白(ricin)[11]和相思子(Abrus
precatorius)毒蛋白(abrin)[12]是最早发现的Ⅱ型 RIP。
研究表明许多Ⅰ型 RIP 以及Ⅱ型 RIP 的 A 链对肿
瘤细胞的杀伤作用远强于对正常细胞的杀伤作用,
与肿瘤细胞专一性单克隆抗体一起制成的免疫毒
素可以专一性的杀伤肿瘤细胞[13–14]。另外,多数植
物 RIPs 还具有抗人免疫缺陷病毒(HIV)[5]、抗寄生
虫[11]和真菌[4]的作用。
Stirpe 从麻疯树种仁中分离出毒蛋白(curcin),
且对无细胞系统的蛋白合成有强烈抑制作用[15]。
Barbieri 阐 明 curcin 属 于 Ⅰ 型 RIP[16]。 林 娟 证 明
curcin 是 一 种 RNA N- 糖 苷 酶[17],具 有 抗 肿 瘤 活
性[18]。 魏 琴 报 道 离 体 条 件 下 curcin 能 抑 制 多 种
农作物真菌菌丝生长和孢子产生[19]。刁明苏报道
curcin 的毒性远小于 ricin[20]。
目前对于包括 curcin 在内的 RIPs 的研究主要
集中于结构、活性和作用机制等领域,对于其在不
同生物个体中含量的变异性报道较少。辜小萍利
用酶联免疫法测定了麻疯树种子、脱油饼粕和脱
毒饼粕中的 curcin 含量[21],然而以单粒种子为对象
来检测不同个体中 curcin 含量差异,并分析其与其
他性状相关性的研究尚未见报道。对麻疯树种子
curcin 含量的研究,对于麻疯树高 curcin 含量的种
质资源收集以及提高麻疯树生物燃油产业的综合
效益具有重要意义。
金沙江干热河谷地区位于我国西南部,其气候
和土壤等自然条件非常适合麻疯树生长,有大量的
野生麻疯树种群分布,而且天然更新良好[22–23],具
有丰富的麻疯树遗传资源。因此,我们对该地区麻
疯树种子中的 curcin 含量以粒为单位进行调查,对
每一颗种子的基本性状及 curcin 含量进行了定量
分析,同时对单颗麻疯树种子之间的差异进行了详
细的调查和分析,探讨了 curcin 含量与种子质量、
种仁质量、出仁率、含油量及可溶性蛋白含量间的
相关性,为培育高油、高 curcin 含量的双高品种提
供科学参考。
1 材料和方法
1.1 材料、仪器和试剂
在金沙江干热河谷地区采集当年生的麻疯树
(Jatropha curcas)种子,自然晾干后贮存于干燥皿
中,室温放置 3 个月使种子含水量趋于一致。随机
挑选成熟、质地饱满、外部无病虫害、无损伤的麻疯
树种子用于实验。
96 孔酶标板(美国 Corning 公司);酶标记二抗:
山羊抗兔 IgG-HRP(北京中杉金桥公司); N,N,N′,N′-
TMB(四甲基联苯胺)显色液(美国 Amresco);NMI-
20Analyst 核磁共振分析仪(上海纽迈科技有限公
司);SpectraMax M2/M2e 型多功能酶联免疫分析
仪(美国 Molercular Devices 公司);其它试剂均为
市售分析纯。所有溶液均以 Milli-Q 超纯水(美国
Millipore A10 型纯水仪)配制。
1.2 种仁curcin含量的测定
参照辜小苹等的间接 ELISA 法[22]并进行了优
化。curcin 标准品来源于麻疯树种仁,经过蛋白层
析 系 统(AKTA purifier 10 UPC,GE Healthcare)纯
化,纯度 >95%。采用 BCA 蛋白分析试剂盒(Thermo
公司)测定 curcin 标准品浓度(具体步骤参照试剂
盒说明书)。用此标准品免疫新西兰大白兔制备
curcin 多克隆抗体,经过 Hitrap rProtein A FF (GE
Healthcare)亲和层析纯化,抗体效价达到 25 万。
1.3 种子质量、种仁质量以及出仁率
用精度为 0.001 g 的电子天平测定麻疯树单粒
种子及剥壳后种仁质量,重复测量 3 次,取平均值。
种子出仁率为单粒种仁质量与种子质量之比的百
分数。
1.4 含油量
麻疯树种子含油量的测定依据雷蕾[24]的方法。
采用 NMI-20Analyst 核磁共振仪测定,射频单元为
NM-2010,软件包括 NMI20 和 WinNMR 两个部分。
仪器的参数选择:室温 22℃,检测腔温度为 36℃,
样品管直径为 1.3 cm,高度为 20 cm,脉冲序列为
硬脉冲回波,采样点数为 1024,带宽为 100.00 kHz,
第5期 427
RG1(增益细调)为 50,RG2(增益粗调)为 5,TR(重
复时间)为 800 ms,回波时间为 7000 μs,扫描次数
NS=16。以麻疯籽热轧成品油为标准样品定标,制
作标准曲线。将各粒种子质量输入程序中,经核磁
扫描后,根据射频信号和标准曲线自动得到各粒种
子的含油量。
1.5 种仁中可溶性蛋白含量
采用改良 Lowry 法蛋白分析试剂盒(Thermo 公
司)测定蛋白质浓度,具体步骤参照试剂盒说明书。
1.6 数据分析
采用 SPSS17.0 软件进行数据统计分析。根据
组距确定的方法[25],对各测试性状值进行分组,统
计各性状的频率分布,并对各性状间进行 Pearson
相关性分析。
2 结果和分析
2.1 麻疯树种仁的curcin含量
采用酶联免疫法测定的单颗麻疯树种仁的
curcin 含量的统计值见表 1。种仁的 curcin 含量变
幅为 0.275~3.183 mg g-1,均值为(1.369±0.055) mg g-1,
变异系数高达 39.01%。考虑到麻疯树种仁在研磨
过程中会发生材料损失,故将 curcin 含量换算为与
可溶性蛋白的比浓度以减少误差。curcin 比浓度为
12.105~185.194 μg mg-1,均值为(61.54±3.23) μg mg-1,
变异系数为 51.46%,变异程度较前者更大。这两
个值的偏度系数均为正值,说明与标准正态分布
相比,其峰偏向较小数值方向,即大部分样品的测
试值低于平均值,此外 curcin 含量的峰度系数仅为
0.832,表明其分布曲线较平坦,而 curcin 比浓度峰
度系数≈ 3,其分布曲线较陡峭,接近尖峰分布。
表 1 麻疯树种仁中的 curcin 含量
Table 1 Curcin content in Jatropha curcas kernels
含量 Content (mg g-1) 比浓度 Specific concentration (μg mg-1)
均值 Mean 1.369±0.055 61.542±3.232
众数 Mode 1.327 45.325
中位数 Median 1.294 55.887
变幅 Min.~Max. 0.275~3.183 12.105~185.194
极差 Range 2.908 173.089
方差 Variance 0.285 1002.778
标准差 Standard deviation 0.534 31.667
变异系数 Coefficient of variation (%) 39.01 51.46
偏度系数 Skewness 0.566 1.392
峰度系数 Kurtosis 0.832 2.959
标准曲线的方程为 y=0.0059x–0.0415,相关系数 R2=0.9985。
The regression equation of standard curve was y =0.0059x–0.0415, liner correlation R2=0.9985.
2.2 麻疯树种子的其他性状
麻 疯 树 种 子 的 其 他 性 状 特 性 见 表 2。5 项
性 状 中,出 仁 率 为 51.17%~73.76%,变 异 系 数 为
6.03%,变异程度最低;可溶性蛋白含量为 7.38~
74.63 mg g-1,变异系数为 36.67%,其变异程度最高,
然而可溶性蛋白的变异程度仍然低于 curcin 含量
及 curcin 比浓度(表 1)。可溶性蛋白偏度为正值,
说明与标准正态分布相比,其峰偏向较小数值方
向,而其它 4 项性状的偏度系数均为负值,说明与
标准正态分布相比,其分布峰偏向较大数值方向。
5 项性状中种子质量、种仁质量和出仁率的峰度系
数 <3,其分布曲线较平坦,而含油量的峰度系数
>3,其分布曲线较陡峭,可溶性蛋白的峰度系数高
达 9.482,其分布曲线最为陡峭,呈尖峰分布。
2.3 curcin含量与其它性状的频率分布
将各测试性状值分别分为 10 组,统计各性状
的频率分布(表 3)。结果表明,种子的 curcin 含量
主 要 集 中 在 第 3~5 组,分 布 于 0.87~1.77 mg g-1,
占样本容量的 68.75%。可溶性蛋白则主要集中
在 第 2~4 组,其 中 83.33% 的 样 本 分 布 在 14.1~
34.5 mg g-1。可溶性蛋白和 curcin 含量偏度值分
谢瑜等:金沙江干热河谷地区麻疯树单粒种子核糖体失活蛋白含量及其与种子性状的相关性
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别为 2.003(表 2)和 0.566(表 1),均为正偏度。二者
的分布峰均偏向较小数值方向,其中可溶性蛋白含
量的分布正偏程度尤其明显。种子其余四项性状:
种子质量、种仁质量、出仁率、含油量的各变量分布
的偏度系数均为负值(表 2),说明其分布峰均偏向
较大数值方向。由表 3 可观察到,种子出仁率主要
集中在第 7~8 组,65.6% 的样本为 64.4%~69.2%,
集中趋势在 6 个性状中最为显著。含油量的集中
情况与种子出仁率相似,主要集中在第 7~9 组,
在 31.11%~38.60% 间呈集中趋势,占样本容量的
75%。出仁率和含油量的分布峰均明显偏向较大
数值方向。至于种子质量和种仁质量的分布在 6
组数据中最接近正态分布,仅稍微向较大数值方向
偏斜,其中 69.8% 的样本种子质量集中在第 5~7 组,
约为 0.647~0.782 g。72.9% 的样本种仁质量集中
在第 6~8 组,为 0.420~0.531 g。
表 2 麻疯树种子 5 个性状的统计分析
Table 2 Statistics of 5 traits of Jatropha curcas seeds
种子质量
Seed weight
(g)
种仁质量
Kernel weight
(g)
出仁率
Seed-kernel rate
(%)
含油量
Oil content
(%)
可溶性蛋白含量
Soluble protein content
(mg g-1)
均值 Mean 0.707 0.458 64.63 34.66 24.60
标准误差 Standard error 0.008 0.007 0.40 0.39 0.92
众数 Mode 0.747 0.478 57.02 39.61 21.32
中位数 Median 0.713 0.468 65.44 35.43 23.93
变幅 Min.~Max. 0.469~0.915 0.240~0.601 51.17~73.76 16.12~40.93 7.38~74.63
极差 Range 0.446 0.361 22.59 0.2481 67.24
方差 Variance 0.006 0.004 0.002 0.001 81.493
标准差 Standard deviation 0.078 0.064 0.039 0.038 9.027
变异系数 Coefficient of variation (%) 11.03 13.97 6.03 10.96 36.67
偏度系数 Skewness –0.843 –1.164 –1.035 –1.612 2.003
峰度系数 Kurtosis 1.678 2.373 1.747 5.216 9.482
表 3 麻疯树种子性状的频率分布
Table 3 Frequency distribution of seed traits in Jatropha curcas
种子质量
Seed weight
(g)
种仁质量
Kernel weight
(g)
出仁率
Seed-kernel rate
(%)
含油量
Oil content
(%)
可溶性蛋白含量
Soluble protein content
(mg g-1)
Curcin
(mg g-1)
组 Group Pij (%) 组 Group Pij (%) 组 Group Pij (%) 组 Group Pij (%) 组 Group Pij (%) 组 Group Pij (%)
0.467~ 4.17 0.235~ 2.08 50.0~ 1.04 16.1~ 1.04 7.30~ 8.33 0.27~ 5.21
0.512~ 1.04 0.272~ 1.04 52.4~ 2.08 18.6~ 1.04 14.1~ 23.96 0.57~ 8.33
0.557~ 4.17 0.309~ 2.08 54.8~ 3.13 21.1~ 1.04 20.9~ 39.58 0.87~ 22.92
0.602~ 8.33 0.346~ 3.13 57.2~ 7.29 23.6~ 1.04 27.7~ 19.79 1.17~ 27.08
0.647~ 16.67 0.383~ 10.42 59.6~ 7.29 26.1~ 2.08 34.5~ 2.08 1.47~ 18.75
0.692~ 29.17 0.420~ 21.88 62.0~ 8.33 28.6~ 6.25 41.3~ 2.08 1.77~ 6.25
0.737~ 23.96 0.457~ 31.25 64.4~ 45.83 31.1~ 20.83 48.1~ 1.04 2.07~ 7.29
0.782~ 10.42 0.494~ 19.79 66.8~ 19.79 33.6~ 28.13 54.9~ 1.04 2.37~ 2.08
0.827~ 1.04 0.531~ 7.29 69.2~ 2.08 36.1~ 26.04 61.7~ 1.04 2.67~ 1.04
0.872~ 1.04 0.568~ 1.04 71.6~ 3.13 38.6~ 12.50 68.5~ 1.04 2.97~ 1.04
第5期 429
2.4 curcin含量与其他性状的相关性
Pearson 相关性分析结果(表 4) 表明,麻疯树种
子 curcin 含量与其他 5 个性状的相关性均未达到
显著水平,但存在一定程度的相关性。其中 curcin
含量与种子质量、种仁质量及含油量存在一定程度
的负相关,而与出仁率和可溶性蛋白含量存在一定
的正相关,其中 curcin 含量与可溶性蛋白含量的正
相关系数(0.190)和与含油率的负相关系数(–0.177)
相对较高。
表 4 麻疯树种子性状的相关性分析
Table 4 Correlation analysis of seed traits in Jatropha curcas
种子质量
Seed weight
种仁质量
Kernel weight
出仁率
Seed-kernel rate
含油量
Oil content
可溶性蛋白含量
Soluble protein content
Curcin
种子质量 Seed weight 0.931** 0.432** 0.443** – 0.278** – 0.061
种仁质量 Kernel weight 0.726** – 0.474 – 0.228* – 0.011
出仁率 Seed-kernel rate 0.402** – 0.108 0.067
含油量 Oil content – 0.479** – 0.177
可溶性蛋白含量 Soluble protein content 0.190
Curcin
**: P<0.01; *: P<0.05.
3 讨论
近年来,国内外关于麻疯树种子资源调查的研
究报道较多[26–27]。本研究首次报道了麻疯树种子
curcin 含量与种子含油量等其它性状的相关性,尤
其是以单颗种子为单位进行分析。虽然核糖体失
活蛋白可以利用原核表达系统大量获得,但是植物
种子生产的真核蛋白在蛋白质折叠、修饰方面具有
优势,同时兼具安全性和经济性的特点,已成为基
因工程药物发展的趋势[28],因此本研究工作对于高
curcin 含量麻疯树品种的选育具有重要的意义。
本研究在金沙江干热河谷地区随机收集当年
收获的麻疯树种子。从种子质量、出仁率和含油量
等等特性来看,与李化[27]、严秉意[29]的报道相近,因
此本研究结果能够基本反映出该区域麻疯树种质
资源 curcin 含量和其他性状的真实水平,具有一定
的代表性。
本研究结果表明,麻疯树种子的 curcin 含量
为 0.275~3.183 mg g-1,即 curcin 约 占 种 仁 重 量 的
0.0275%~0.3183%,比辜小苹等 [21] 的研究结果范围
大些,但远低于蓖麻种仁中同为核糖体失活蛋白的
ricin 含量(1%~5%)[30]。麻疯树和蓖麻虽然同属于
大戟科植物,但是 curcin 和 ricin 分别属于Ⅰ型和
Ⅱ型 RIP,二者在分子量、蛋白结构上均存在差异。
两者在含量上的巨大差异不仅暗示二者可能存在
功能上的差异,更暗示了核糖体失活蛋白在种子的
发育过程中可能是非必需蛋白。
为了减少提取过程中由于样品损失而造成的
误差,我们进一步计算了 curcin 含量与种仁可溶性
蛋白含量的比率,约为 12.105~185.194 μg mg-1,均
值为(61.54±3.23) μg mg-1,变异系数高达 51.46%。
由于可溶性蛋白含量(CV=36.67%)和 curcin 含量
(CV=39.01%)本身的变异程度都较大,从而导致了
单粒麻疯树种子 curcin 含量的比浓度存在较大差
异,这也暗示了 curcin 含量与可溶性蛋白含量间的
相关性不显著,二者在生物学功能上可能相对
独立。
表型变异是基因组的遗传变异与环境适应修
饰共同作用的结果 [31]。本研究结果表明,6 个性状
都表现出一定的变异,但无论是从标准差还是从变
异系数来看,单粒麻疯树种仁 curcin 含量的变异程
度最大。这除了环境因素有关外,一方面还可能与
酶联免疫测试方法本身稳定性较低有关,也可能与
curcin 的生理作用有关。群体中丰富变异的存在,
暗示进行高 curcin 含量的单株选育工作的可行性。
本研究结果表明,curcin 含量尽管与其他性
状没有达到显著相关关系,但其与可溶性蛋白含
量的正相关系数(0.190)和与含油率的负相关系数
(–0.177)相对较高。种子积累贮藏物质时,蛋白质
和油脂的积累存在“底物竞争”的关系[32],这说明选
育高油、高 curcin 的双高麻疯树品种可能具有一
定的限制性。不过我们还是观察到多粒含油量和
谢瑜等:金沙江干热河谷地区麻疯树单粒种子核糖体失活蛋白含量及其与种子性状的相关性
430                       热带亚热带植物学报               第20卷
curcin 含量均较高的个体(数据未发表),具体机制
还有待进一步研究。
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