全 文 ：林 业科 学研 究 2010, 23( 2) : 234～ 240
Forest Research
᭛ゴ㓪ো : 1001-1498( 2010) 02-0234-07
�ሒ⨉⬆ DNA ᦤপᮍ⊩↨䕗Ϣ AFLP
ডᑨԧ㋏ⱘᓎゟ *
ვ ਖ਼1 , ר ࿶* * , ۤ బ, ч໋ਫ਼, ސܵ܃
(中国林业科学研究院资源昆虫研究所 , 国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室 ,云南 昆明 650224)
ᨬ㽕: 采用 CTAB法、改进 SDS- 蛋白酶 K法、SDS - 饱和氯化钠法和提取试剂盒对�尾琵甲的肌肉、虫卵和幼虫进
行 DNA提取 ,比较了 DNA的提取和保存质量 , 并对 AFLP试验的酶切时间、预扩增产物稀释倍数和选择性扩增引物
量等关键因子进行试验和优化。结果表明 : 4种方法对肌肉组织提取的 DNA质量都较好 ; 3种传统方法提取的 DNA
的保存时间长于试剂盒提取的 DNA; 使用 EcoRⅠ /Mse Ⅰ内切酶组合 , 10 UEcoRⅠ和 2 UMse Ⅰ分两步各酶切 2 h,
T4连接酶 3 h连接后, 以 20倍稀释的预扩增产物和 5 ng/35 ng的 E + 3 /M + 3引物量进行选择性扩增 , 建立了�尾
琵甲 AFLP分子标记体系。
݇䬂䆡 : �尾琵甲; 基因组 DNA; DNA提取; AFLP
Ё೒ߚ㉏ো : Q963 ᭛⤂ᷛ䆚ⷕ : A
收稿日期 : 2009-11-20
基金项目 : 国家林业局林业科学技术重点研究项目 ( 2006-65) ; 国家科技支撑计划课题 ( 2006 BAD06 B07)
作者简介 : 赵敏 ( 1980— ) ,男 , 云南昆明人 , 博士研究生 , 从事药用昆虫研究 .
* 西南林学院明宗伟同学在研究中提供了帮助 ,在此致谢 .
* * 通讯作者 .
Genomic DNA Extraction Method and AFLP Amplification Reaction
System of Blaps rhynchopetera ( Coleoptera: Tenebrionidae)
ZHAO Min, FENGYing* , HERui, CHEN Xiao-ming, JI Huan-hong
( Research Institute of Resource Insects, Chinese Academy of Forestry; Key Laboratory of Cultivation and Utilization of Resource Insects of
State Forestry Administration, Kunming 650224, Yunnan, China)
Abstract: The study compared the quality of DNA extracting from muscles, eggs and larvae of Blaps rhynchopetera
with CTAB method, improved SDS-protease-K method, SDS-NaCl method and DNA extraction Kit. Some key
factors affecting the time of digestion, dilution of pre-amplification product and the amount of selective amplification
primer were studied and an optimized AFLP reaction system of B. rhynchopetera was established. High quality
genomic DNA could be isolated using four methods from this beetle muscles. DNA extracted with traditional
extraction method could keep for longer time than DNA extraction Kit did. The optimal reaction time for enzyme
digestion( EcoRⅠ /Mse Ⅰ) was 2 hours for each. Products of the pre-amplification diluted 20 fold and 5 ng/35 ng
( E +3 / M+ 3) was the best amount of the selective amplification primer.
Key words:Blaps rhynchopetera; genomic DNA; DNA extraction; AFLP
AFLP是一种基于 PCR的 DNA指纹技术,结合
了 RFLP和 RAPD技术的优点,具有所需 DNA量少、
多态性丰富、对基因组的覆盖比较广等特点 [ 1] 。自
1993 年发明以来 [ 2 ] , 受到了遗传多样性分析 [ 3 - 4] 、
系统分类和进化 [ 5 ]、遗传图谱构建 [ 6 - 7 ] 等方面研究
者的青睐。尽管在动物学研究中的案例相对较
第 2 期 赵 敏等:�尾琵甲 DNA提取方法比较与 AFLP反应体系的建立
少 [ 8] ,技术难度也高于 RAPD[ 9 ] , 但其有效性、可靠
性等特点得到了广泛认同,其技术一直在不断完善
和发展。近年来, AFLP数据作为核基因组技术的代
表与 mtDNA基因测序数据组合,在解决种内遗传分
化、种间系统发育问题方面共同发挥着重要的作
用 [ 10 - 1 1] 。AFLP具有广泛的生物学适应性, 已有效
的应用于真菌、植物和动物等物种的研究 [ 9] ;然而,
AFLP技术体系复杂,操作步骤多,针对特定的物种
或分类群,需要对各个技术环节进行选择和优化,以
利于最终结果的获得。
AFLP实验技术对 DNA的浓度不太敏感 [ 12 ] ,而
对 DNA的质量要求较高 [ 1 3] 。DNA质量直接影响到
酶切是否完全和 PCR 扩增的效果。因此,提取高质
量、无污染的 DNA 是 AFLP 成败的关键。印红
等 [ 14] 、代金霞等 [ 1 5] 曾探讨拟步甲昆虫 DNA的提取
方法,指出难以从干标本中提取该类昆虫的 DNA,
并给出了采样保存建议。
�尾琵甲( Blaps rhynchopetera Fairmaire) 属鞘翅
目( Coleoptera) 拟步甲科 ( Tenebrionidae) 琵琶甲属
( Blaps) ,是云南民间常用的一种药用昆虫 [ 16] 。前
人 [ 17 - 1 8] 对其化学成分、营养学等进行了研究, 分子
生物学研究技术尚未涉及。作者所在的团队对其分
布及生境、生物学生态学特性等进行了一些调查和
研究 [ 19 - 2 1] ,认为随着我国居民生活条件的快速改
善,其以民居为栖境的生存方式将受到重大威胁。
开展分子生物学研究,既能为该种的育种提供遗传
方面的指导,又能为科学保护该重要昆虫资源提供
依据和指导意见。本文对其 DNA提取、酶切体系及
条件、预扩增产物稀释等进行了试验,建立了该昆虫
的 AFLP反应体系,为其遗传多样性分析等研究奠
定了基础。
1 ϫॸֺ֥ۤ
1. 1 ᴤ᭭
1. 1. 1 ٢ೋࣰѫ �尾琵甲于 2008 年至 2009 年
分别采自云南昭通鲁甸、文山马关、楚雄元谋和怒江
兰坪; 作为参照的甘孜琵甲 ( Blaps garzica Ren et
Wang) 于 2008 年采自云南丽江。带回室内饲养,并
收集虫卵,孵育幼虫。
1. 1. 2 ೋޔ 蛋白酶 K( 德国 MERCK公司) ; AFLP
接头及引物由上海生工公司合成; Tru1Ⅰ ( Mse Ⅰ) 、
EcoRⅠ、T4 DNA Ligase 和 λDNA( 立陶宛 MBI( Fer-
mentas) 公司) ; Taq DNA 聚合酶、dNTP、Binding Si-
lane、40%丙烯酰胺溶液( 29∶1) 、EDTA、SDS、硼酸购
自上海生工公司; Repel Silane( 北京索来宝公司 ) ;
TEMD( 德国 Sigma公司) ;血细胞 /细胞 /组织基因组
DNA提取试剂盒 ( 离心柱型) ( TIANGEN公司 ) ;其
它试剂为国产分析纯。
1. 1. 3 ྮ୶ DU800 型核酸分析仪( 美国 Backman
Coulter公司) ; My Cycle PCR扩增仪( 美国 BIO-RAD
公司) ; HERMLE Z323K型低温离心机( 德国 HERM
公司 ) ; G: Box HR 凝胶成像系统 ( 英国 Syngene 公
司) ; Power-Basic 电泳仪、Power-Pac HV 电泳仪和
Sequi-Gen GT测序电泳系统 ( 38 cm×50 cm) ( 美国
BIO-RAD公司 ) ; Barnstead NANopure Dlamond超纯
水系统( 美国 Barnstead公司) 。
1.2 ᮍ⊩
1. 2. 1 DNA ඔ௜ֺ֥ 以�尾琵甲的足部肌肉、
胸部肌肉、幼虫和虫卵等 4 种组织为实验材料,分别
用 CTAB法、SDS - 蛋白酶 K消化法、SDS - 饱和氯
化钠法和 DNA 提取试剂盒提取方式 ( TIANGEN公
司) 共 4 种方法进行基因组 DNA的提取。
( 1)材料的预处理 实验前 1 日,将�尾琵甲成
虫的足和胸部置于 1 mL无水乙醇中浸泡;实验时,
以灭菌的解剖针解剖。幼虫饥饿 1 d,使其消化道内
的食物充分消化和排泄,以防外源 DNA干扰。虫卵
用 75% 的酒精清洗 2 min,除去表面的杂质。实验
时,幼虫和虫卵以灭菌的小杵研磨。
( 2) SDS - 蛋白酶 K消化法 参照代金霞等 [ 15 ]
的方法,略有改进。步骤如下: 解剖后, 用灭菌的剪
刀剪碎肌肉组织,加入匀浆液裂解;用 1∶1 体积混合
的苯酚、CI( 氯仿∶异戊醇 = 24∶1) 沉淀和抽提 2 次蛋
白质; 70%乙醇洗涤之后,再以无水乙醇脱水 1 次,
加快干燥。此外, 比较未经无水乙醇处理及无水乙
醇处理 2、5 和 10 d的腿节肌肉 DNA的提取情况。
( 3) CTAB法和 SDS - 饱和氯化钠法 参照石
晶等 [ 2 2]的方法。
( 4) DNA 提取试剂盒提取 提取流程参照说
明书。
( 5)检测和 DNA保存时间 用 0. 8%琼脂糖凝
胶电泳和紫外分光光度计检测 DNA 提取的浓度和
质量, 以 λDNA 为标准, 调整 DNA 浓度至 50 ng·
μL - 1。将 CTAB法、SDS - 蛋白酶 K法和 SDS - 饱
和氯化钠法提取的 DNA于 4 ℃冰箱分别放置 30 d,
DNA提取试剂盒提取的 DNA 放置 10 d, 0. 8% 琼脂
糖凝胶电泳检测。
532
林 业 科 学 研 究 第 23卷
1. 2. 2 AFLPֱ࿫ඨߑۤညܤಁޙ AFLP反应体
系的建立参照 Vos等 [ 23 ] 的方法,略有改动。除预扩
增引物 E0 和 M0 外,接头和选择性扩增引物序列同
陈敏等 [ 24] 。
( 1) 酶切:使用 EcoRⅠ /MseⅠ内切酶组合分两
步酶切。先用 EcoRⅠ及其体系( 反应体系如表 1) 37
℃分别酶切 1、2、3、4、6 h, 65 ℃ 30 min终止反应。
然后挑选出合适酶切时间的产物,再用 Mse Ⅰ及其
体系( 反应体系如表 1) 65 ℃分别酶切 1、2、3、4、6 h,
80 ℃ 30 min 终止反应。以 1. 2% 琼脂糖胶、6 V·
cm- 1检测酶切结果,确定最佳酶切时间。
( 2) 连接:连接体系如表 1, 22 ℃连接 3 h, 65 ℃
10 min终止反应。以 1. 2%琼脂糖胶、6 V·cm- 1检
测接头的消耗情况。
( 3)预扩增:采用 E + 1 /M + 1 引物组合。引物
序列为 E + 1( A) : 5′-GAC TGC GTA CCA ATT C A-
3′; M + 1( C) : 5′-GAT GAG TCC TGA GTA A C-3′。
取连接产物 5 μL, 加入 15 μL混合液( 反应体系如
表 1) 进行预扩增。扩增程序为 94 ℃ 2 min, 94 ℃
30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s,共 30 个循环。
( 4)选择性扩增:采用 E +3/ M +3 引物组合。预
扩增产物分别稀释 10、15、20、30和 50 倍,取稀释产物 4
μL,加入 16 μL混合液( 反应体系如表 1)进行扩增。为
确定选择性扩增引物的量,将稀释 10、20 和 50 倍的预
扩增产物分别组合 5 ng/35 ng、10 ng/70 ng及 20 ng/
140 ng的 EcoRⅠ( E +3) /MseⅠ( M+3)的引物进行选择
性扩增。扩增程序同 Vos等 [ 23]。电泳和银染后,确定
最佳稀释倍数和引物量。
㸼 1 �ሒ⨉⬆ AFLPডᑨԧ㋏
酶切体系( 20μL) 连接体系 ( 20 μL) 预扩增体系 ( 20 μL) 选择性扩增体系( 20μL)
EcoRⅠ10 U EcoR1 2 U T4 ligase 4μL酶切连接模板 4 μL预扩增模板
2 μL 10 ×PCR buffer 2 μL10 ×T4 ligase buffer 1μL MseⅠprimer( M+1,35 ng·μL- 1 ) ) 1 μL MseⅠprimer( M +3,35 ng·μL- 1 )
5 μL DNA ( 100 ng·μL- 1 ) 1 μL MseⅠAdaptor ( 50 ρmol·μL- 1 ) 1μL EcoRⅠprimer( E +1,35 ng·μL- 1 ) ) 1 μL EcoRⅠprimer( E +3,5 ng/μL)
Add ddH2 O to 20 μL 1 μL EcoRⅠAdaptor ( 5 ρmol·μL- 1 ) 1.6 μL MgCl2 ( 25 mmol·L
- 1 ) 1.6 μL MgCl2 ( 25 mmol·L
- 1 )
MseⅠ 2 μL 10 ×PCR buffer 1.6 μL dNTPs ( 2.5 mmol·L - 1 ) 1.6 μL dNTPs ( 2.5 mmol·L- 1 )
2 UMse I 1UTaq polymerase 1U Taq polymerase
15μL DNA ( 100 ng·μL - 1 ) 2μL10 ×Taq buffer 2 μL 10 ×Taq buffer
加 ddH2 O至 20μL 加 ddH2 O至 20 μL 加 ddH2 O至 20 μL 加 ddH2 O至 20μL
( 5) 聚丙烯酰胺凝胶电泳: 选择性扩增产物上
样于 5%的变性聚丙烯酰胺凝胶 ( 40% 胶母液 12. 5
mL +尿素 36 g +5 ×TBE 20 mL,定容至 100 mL后,
加 10%过硫酸胺 500 μL + TEMED 35 μL,视气温调
节 TEMD的量,静置凝胶 1 h以上) ,以 1 ×TBE为电
泳缓冲液、恒功率 100 W预电泳 20 min。选择性扩
增后样品与 Loading Buffer( 98% 甲酰胺、10 mmol·
L- 1 EDTA ( pH 8. 0) 、0. 25%溴酚蓝、0. 25%二甲苯
氰 EF) 以 2∶1 混合, 95 ℃变性 5 min。上样 7μL,恒
功率 80 W电泳2 h 20 min。
( 6) 银染:参照 Bassam B J等 [ 25 ] 的方法。为了
保证染色均匀,所有步骤均在脱色摇床上进行。终
止显影后,水洗 5 min,自然晾干。用扫描仪扫描后
分析。
2 ࠒڴۤד๥
2.1 DNA ᦤপ
2. 1. 1 ඔ௜ֺ֥ۤඔ௜ϫॸΑࠀ 4 种方式对�
尾琵甲的足部肌肉、胸部肌肉、幼虫和虫卵进行提取
的结果见表 2。从提取方法看, CTAB法、SDS - 饱和
氯化钠法、SDS - 蛋白酶 K法和试剂盒法 4 种方法
都可以提取到较完整的基因组 DNA, 各种方法从同
种材料( 组织) 提取的 DNA的质量差异不明显( P >
0. 05) ; SDS - 饱和 NaCl 法对肌肉、幼虫和虫卵的提
取效果略优于其它方法。从提取部位看,肌肉组织
提取的 DNA的 OD260 / 2 80值在 1. 70 ～ 1. 90 之间,纯
度满足 AFLP实验的需要;幼虫和卵提取的 DNA的
OD260 / 280值低于 1. 70,与这 2 种组织含大量的蛋白质
等杂质有关,需要增加杂质去除步骤。
㸼 2 4⾡ᮍ⊩ᦤপϡৠᴤ᭭ DNA ḋક
ᑇഛ OD260/280ؐ( n = 8)
方法
OD260/ 280 ( X±SD)
足肌肉 胸部肌肉 幼虫 虫卵
CTAB法 1.82 ±0. 12 1.70 ±0. 14 1.65±0.27 1. 50±0.14
SDS - 饱和 NaCl法 1.84 ±0. 12 1.81 ±0. 12 1.66±0.14 1. 61±0.24
SDS - 蛋白酶 K法 1.76 ±0. 09 1.73 ±0. 08 1.52±0.14 1. 50±0.14
试剂盒提取法 1.85 ±0. 23 1.72 ±0. 30 - -
2. 1. 2 DNAͬӉನ޷Αࠀ 对不同方法提取的肌
肉组织 DNA, 4 ℃保存 10 d和 30 d后的电泳结果如
图 1。由图 1 可见:试剂盒提取的 DNA 仅保存 10 d
632
第 2 期 赵 敏等:�尾琵甲 DNA提取方法比较与 AFLP反应体系的建立
就出现了降解,不宜长时间保存;其余 3 种传统提取
方法提取的 DNA保存 30 d后,条带依然完整,且相
互之间几乎没有差异。试剂盒方式提取速度较快,
但所提 DNA不能较长时间保存,分析原因可能与其
试剂及离心柱有关。实验中, 若实验个体多、周期
长,采用传统提取方法较能满足需要。
M—Marker; 1、2—试剂盒提取 (保存 10 d) ; 3、4—CTAB法 3( 30 d) ;
5、6— SDS - 蛋白酶 K法 ( 30 d) ;7、8—SDS - 饱和 NaCl法( 30 d)
图 1 不同方法提取的 DNA 降解比较电泳检测图
2. 1. 3 ํഃྐྵҟ҉सನ޷Αࠀ 用无水乙醇处理
足 2、5、10 d后,以 SDS - 蛋白酶 K法提取腿节肌肉
DNA,同未处理直接提取活虫的 DNA 进行比较 ( 图
2) ,结果表明: 2、5、10 d 预处理的材料提取出的
DNA同活虫提取的 DNA 条带一致,带型完整,没有
降解。试验中发现该虫死亡后很难提取到 DNA,而
活虫的组织经无水乙醇处理后,表现出 10 d的保存
能力。推测无水乙醇快速吸收了组织中的水, 抑制
了核酸酶对 DNA的降解。因此,需要进行分子生物
学研究的�尾琵甲开展研究之前,可在无水乙醇中
暂时保存 10 d左右。
M—Marker; 1、2—未经无水乙醇处理 ; 3、4—处理 2 d; 5、6—处理
5 d; 7、8—处理 10 d
图 2 电泳检测经无水乙醇不同时间处理后对 DNA提取效果的影响
综上所述, 4 种方法都能提取到质量较高的
DNA,其中, 3 种传统方法提取的�尾琵甲 DNA 都
能保存 30 d;�尾琵甲肌肉组织经无水乙醇处理 10
d后,以 SDS - 蛋白酶 K 法提取到无明显降解的
DNA,且 SDS - 蛋白酶 K法以酶消化组织,能释放出
大部分核酸, 本文选用 SDS - 蛋白酶 K法提取的
DNA进行 AFLP体系的建立。
2.2 AFLPডᑨԧ㋏ᓎゟ
2. 2. 1 ਝ஭ۤॕࠄ EcoRⅠ酶切结果如图 3 所示。
设置的 5 个时间的酶切结果和原基因组 DNA对比发
现,基因组 DNA的主带消失, EcoRⅠ酶切产物电泳条
带低于基因组 DNA的主带,并呈现出拖尾; 5 个酶切
时间的带型相近,判断 1 h即可完成酶切。
选取 EcoR Ⅰ 2 h酶切产物,以 Mse Ⅰ酶切的结
果( 分步的双酶切) 如图 3, 5 个酶切时间的酶切产物
的电泳条带相同,均已弥散,表明 5 个酶切时间处理
下的基因组 DNA均已完成 Mse Ⅰ酶切。为了保证
酶切完全,选取 2 h酶切。
M—Marker; 1 ～ 5 —EcoR Ⅰ分别酶切 1、2、3、4、6 h的产物 ; 6 ～
10—EcoR Ⅰ酶切 2 h后 , Mse Ⅰ分别酶切 1、2、3、4、6 h的产物 ;
图示总 DNA 约 100 ng, 未除去 RNA, 用于酶切的 DNA为 250 ng
·泳道 - 1。
图 3 EcoRⅠ和 MseⅠ不同酶切时间的效果
M—Marker; 1、2—酶切连接产物 ( 3 h) ; 3—EcoR Ⅰ接头 ( 5 pmol
·μL - 1) ; 4—Mse Ⅰ接头 ( 50 pmol·μL - 1)
图 4 酶切 - 连接效果电泳检测
本实验的酶切和连接分 2 步完成。T4 连接酶
连接产物与连接接头的电泳图如图 4。图 4 表明,连
接后,接头仍有剩余,表明接头浓度和数量充足。
732
林 业 科 学 研 究 第 23卷
2. 2. 2 ၇ࣴ႙С๞๮ೄͿ೴ۤ༪႔໿ࣴ႙ԅ࿤๞
ૉէ 预扩增产物稀释 10、15、20、30 和 50 倍后,选
择性扩增产物的聚丙烯酰胺电泳银染结果见图 5。
由图可见,各稀释倍数均能获得清晰的条带,而随着
稀释倍数的增加,条带的信号强度逐渐降低。10、15
倍稀释后的产物,部分条带浓度过高,略有拖尾,影
响了部分信号较强的统计; 30、50 倍的弱信号条带
区域略微模糊; 20 倍的条带信号相对均匀, 满足上
下区域记带的需要。
M—Marker; 1—甘孜琵甲 ; 2 ～ 5—�尾琵甲 , 依次采自云南怒江
兰坪、楚雄元谋、文山马关和昭通鲁甸 ; 6 ～ 25—每 5 个 1 组 , 重
复 1 ～ 5 号的材料
图 5 5% PAGE检测�尾琵甲预扩产物不同稀释倍数的选择性
扩增结果 ( E + AAC/ M + CTA)
E +3 / M+ 3 引物量分别为 5 ng/35 ng、10 ng/70
ng和 20 ng/140 ng组合的选择性扩增产物经 PAGE
后,银染的结果见图 6。从图中可以看到,随着引物
浓度增加,条带信号强度明显增强,其中,强条带的
增强明显于弱条带,因而造成部分强信号条带拖尾,
掩盖了周围的条带,即浓度增加后,会对较强条带和
较弱条带的统计造成困难。因此, 相较之下, 35 ng
引物量较适宜。
通过上述试验, 确定�尾琵甲 AFLP反应体系
为 250 ng DNA 模板经 EcoR Ⅰ 37 ℃酶切 2 h、Mse
Ⅰ 65 ℃酶切 2 h、连接 3 h、预扩产物稀释 20 倍, 5
ng/35 ng的 E +3 / M +3 引物量组合。
M—Marker; 1—甘孜琵甲 ; 2 ～ 3—�尾琵甲 , 分布采自云南怒江
兰坪、昭通鲁甸 ; 4 ～ 27—每 3 个 1 组 ,重复 1 ～ 3 号的材料
图 6 预扩产物不同稀释倍数与引物量对 PAGE
银染胶的影响 ( E + AAC /M + CTA)
3 ໌ࠒۤඉৢ
CTAB法、SDS - 饱和氯化钠法、SDS - 蛋白酶 K
法和 DNA试剂盒 4 种方式从�尾琵甲肌肉组织都
能提取到较高质量的 DNA,对幼虫和虫卵的提取则
需进一步优化。传统提取方法的 DNA 保存时间较
试剂盒方法提取的长,以 SDS - 蛋白酶 K法从无水
乙醇浸泡 10 d 的�尾琵甲足中仍能提取出完整的
DNA。对�尾琵甲 AFLP 反应体系的研究结果显
示,以改进 SDS - 蛋白酶 K法提取 DNA 后, 250 ng
DNA模板经 EcoR Ⅰ 37 ℃酶切 2 h、Mse Ⅰ 65 ℃酶
切 2 h、连接 3 h、预扩产物稀释 20 倍后, 5 ng/35 ng
的 E + 3 /M +3 引物量组合选择性扩增,产物经 5%
变性聚丙烯酰胺电泳能得到清晰、稳定性好的扩增
片段。
3.1 DNAᦤপ
DNA提取是所有物种分子生物学研究的起始
步骤。为解决不同物种的 DNA 提取问题,已开发出
许多的提取方法,如 CTAB法、SDS法, 以及方便的
试剂盒来解决 DNA 提取的问题; 但对具体物种的
DNA提取, 需要综合文献、仪器、实验周期和 DNA
储存时间、适当的性价比等因素, 确定适合的方法。
832
第 2 期 赵 敏等:�尾琵甲 DNA提取方法比较与 AFLP反应体系的建立
本文以优化后的 SDS - 蛋白酶 K法结合其它 DNA
提取方法和保存时间进行比较, SDS - 蛋白酶 K法
获得了较好的提取质量和保存效果, 以其提取的
DNA建立 AFLP反应体系, 获得了很好的效果。从
提取部位看,拟步甲科昆虫多以前胸背板下的肌肉
为材料 [ 1 4 - 1 5]。因该类昆虫腿节粗壮,本文尝试以�
尾琵甲 3 只足 ( 前、中和后足各 1 只 ) 的腿节进行
DNA的提取,发现该取材部位既能防止其肠道食物
污染,又能保持标本形态和鉴定特征的完整,还可根
据个头大小调整使用足的数量,以满足对 DNA提取
量的需要。试验中也发现,其外骨骼坚硬,新鲜个体
直接解剖获取肌肉较为困难。以无水乙醇或 TE浸
泡 1 d后,外骨骼变软,易于解剖。同时, 无水乙醇
在解剖过程中快速挥发,带走水分,解剖完数分钟,
肌肉即脱水干燥, 很容易剪碎成粉末, 省却了研磨
过程。
代金霞等 [ 15 ] 发现,由于外骨骼坚硬, 该类昆虫
标本不易提取出 DNA,建议采集该类昆虫时,剪碎
以无水乙醇保存。本文对无水乙醇 2、5、10 d 保存
的标本进行试提,验证了该建议,对今后该类昆虫的
短期野外采样提供了参考。
3.2 䝊㒘ড়Ϣ䝊ߛℹ偸
酶切是 AFLP技术的关键步骤之一,酶切组合、
酶切完全与否都将影响后续实验的成败。适用于
AFLP分析的内切酶组合有: EcoR Ⅰ /Taq Ⅰ、EcoR
Ⅰ /Mse Ⅰ、PstⅠ /Taq Ⅰ、Pst Ⅰ /Mse Ⅰ和 Hind Ⅲ /
Mse Ⅰ等 [ 26 ]。综合前人研究成果 [ 24 , 27 ] ,本研究选用
了 EcoR Ⅰ /Mse Ⅰ内切酶组合,获得的条带均匀,完
全满足后续分析的需要。
目前, AFLP反应体系多用一步酶切法。本研究
使用 2 步酶切法, EcoR Ⅰ内切酶切完, 失活, 再以
Mse Ⅰ内切酶切, 该方法使 2 种内切酶分别能在其
最适反应温度 37、65 ℃内分别工作,充分保证了酶
切的效率和质量。其次, 同其它昆虫 AFLP酶切体
系 [ 24, 27 ]相比,分步酶切后,提高了酶切的效率, Tru1
Ⅰ( MseⅠ) 内切酶的用量由 12. 0、12. 5 U降低至 2.
0 U,节约了成本。同时,酶切总时间 ( 4 h) 也较为
接近。
3. 3 ᠽ๲ѻ⠽ⱘẔ⌟੠䗝ᢽᗻᠽ๲ᓩ⠽ⱘ䞣ᇍ䫊
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预扩增产物经稀释不同倍数后选择性扩增,以
合适的稀释倍数获得适当信号强度的条带用于统
计。这一试验以及对选择性扩增引物用量的分析对
于银染方法的 AFLP实验非常重要, 关系到条带的
判读。以往的研究 [ 24 , 26 - 27] 以琼脂糖胶进行检测,对
体系建立提供前期参考,但琼脂糖凝胶因分辨率低,
可靠性相对不足,本文在此基础上进行变性 PAGE
胶检测,获得了高分辨率的图谱,为确定合适的稀释
倍数和适当的引物量提供了准确的依据。
3.4 ⬉⋇Ϣᶧ㡆
本文中使用的是目前最大的垂直板( 38 cm×50
cm) ,操作上有一定的难度。从制胶到染色的每一
步操作都会对结果产生影响,难度较大,需要每一步
都小心谨慎。涂板时,剥离硅烷一定要认真涂匀,否
则,分离玻板时易粘胶,导致条带的缺失。制胶过程
中,特别需要注意防止产生气泡,以免对胶图的判读
造成影响。制胶时室内温度不能太低,电泳过程中,
则需注意温度的波动,否则会使电泳槽变形,导致电
泳条带变形难以判读。显色时,条带清楚了应立即
取出,终止显色,否则过度显色导致背景变深。
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