全 文 ：林业科学研究 ２０１２，２５（２）：１７４ １８１
ＦｏｒｅｓｔＲｅｓｅａｒｃｈ
文章编号：１００１１４９８（２０１２）０２０１７４０８
山苍子 ＡＦＬＰ反应体系的建立及其引物筛选
田胜平１，汪阳东１，陈益存１，占志勇１，斯林林２
（１．中国林业科学研究院亚热带林业研究所，浙江 富阳 ３１１４００；２．安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 ２３００３６）
收稿日期：２０１１０７１３
基金项目：浙江省科技计划项目（２００９Ｃ３２１０７）；国家林业局重点科研项目（２０１１０１）
作者简介：田胜平（１９８６—），男，安徽安庆人，硕士研究生，主要从事化工原料植物育种研究．
通讯作者： 汪阳东，副研究员，从事分子生物学研究．Ｅｍａｉｌ：ｗｙｄ１１１１１１＠１２６．ｃｏｍ
摘要：通过对山苍子幼嫩叶片、顶芽、花蕾３种组织的ＤＮＡ提取效果分析和对影响酶切及选择性扩增效果的４个主
要因素（酶切时间、Ｍｇ２＋浓度、ｄＮＴＰｓ浓度、引物浓度）的比较研究，建立了适合于山苍子ＡＦＬＰ分析的技术体系。结
果表明，山苍子的顶芽是较好的ＤＮＡ提取材料；山苍子基因组ＤＮＡ经５ＵＥｃｏＲＩ和５ＵＭｓｅＩ酶切１ｈ即可完全酶
切；最佳的选择性扩增体系为 ２０μＬ反应体系中含有 １．０ＵｒＴａｑ聚合酶、２．０μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液、１．８μＬ２５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２、１．４μＬ２．５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰ、１００ｎｇ·μＬ－１引物各１．０μＬ。使用该反应体系获得了清晰、稳定的
ＤＮＡ指纹图谱，并筛选出１０对多态性较好的ＡＦＬＰ引物组合，为利用ＡＦＬＰ标记技术进一步开展山苍子种群遗传结
构、遗传分化等研究奠定了基础。
关键词：山苍子；基因组ＤＮＡ；ＡＦＬＰ；多态性引物
中图分类号：Ｓ７１８．４６ 文献标识码：Ａ
ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇａｎｄＡＦＬＰＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｏｆＬｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａ
ＴＩＡＮＳｈｅｎｇｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧＹａｎｇｄｏｎｇ１，ＣＨＥＮＹｉｃｕｎ１，ＺＨＡＮＺｈｉｙｏｎｇ１，ＳＩＬｉｎｌｉｎ２
（１．ＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＳｕｂｔｒｏｐｉｃａｌＦｏｒｅｓｔｒｙ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＦｏｒｅｓｔｒｙ，Ｆｕｙａｎｇ ３１１４００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；
２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３６，Ａｎｈｕｉ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｅｆｅｃｔｏｆＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｈｅｙｏｕｎｇｌｅａｆ，ｔｅｒｍｉｎａｌｂｕｄａｎｄｆｌｏｗｅｒｏｆＬｉｔｓｅａ
ｃｕｂｅｂａ．ＴｈｅｔｉｍｅｏｆＤＮＡｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｖｅｒａｌｋｅｙｆａｃｔｏｒｓａｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅＰＣＲｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｕｃｈａｓＭｇ２＋
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｄＮＴＰｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｍｏｕｎｔｏｆｔｈｅｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｉｍｅｒｗｅｒｅａｌｓｏｔｒｉａｌｅｄ．Ａｎｏｐｔｉ
ｍｉｚｅｄＡＦＬＰｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆＬｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｈｉｇｈｑｕａｌｉｔｙｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ
ａｓａＰＣＲｔｅｍｐｌａｔｅｃｏｕｌｄｂｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｂｕｄｔｉｓｓｕｅ；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｃｏｕｌｄｂｅｄｉｇｅｓｔｅｄｉｎａｈｏｕｒｂｙ５ＵＥｃｏＲＩ
ａｎｄ５ＵＭｓｅＩ；Ｔｈｅｏｐｔｉｃａｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｗａｓ２０μＬｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ１．０ＵｒＴａｑｐｏｌｙｍｅｒ
ａｓｅ，２．０μＬ１０×ＰＣＲｂｕｆｅｒ，１．８μＬ２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２，１．４μＬ２．５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１ｄＮＴＰ，１００ｎｇ·μＬ－１ｐｒｉｍｅｒ
ｅａｃｈ１．０μＬ．Ｃｌｅａｒａｎｄｓｔａｂｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｂａｎｄｐａｔｅｒｎｓｃａｎｂｅｏｂｔａｉｎｅｄａｎｄ１０ｐａｉｒｓｏｆＡＦＬＰｐｒｉｍｅｒｓｗｉｔｈｇｏｏｄ
ｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｗｉｌｂｅａｎｅｆｅｃｔｉｖｅｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＬｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａ；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ；ＡＦＬＰ；ｔｈｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃｐｒｉｍｅｒ
山苍子（Ｌｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａ（Ｌｏｕｒ．）Ｐｅｒｓ．）别名山鸡
椒、木姜子等，系樟科（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）木姜子属（Ｌｉｔｓｅａ
Ｌａｍ．）植物，多为灌木或小乔木，高约８ １０ｍ［１］，
全世界大约有２５０余种，中国约有７０余种［２］。原
产于中国，主要分布在长江以南的数十个省份，印
度、印度尼西亚、马来西亚、日本等东南亚、东亚各
国也有分布［３］。其果实、树皮、树叶、树干均可提
炼山苍子油，山苍子油中富含柠檬醛、高级醇、有
第２期 田胜平等：山苍子ＡＦＬＰ反应体系的建立及其引物筛选
机酸，其中柠檬醛含量约占精油的７０％ ８０％，是
制造紫罗兰酮素系列香料的重要原料［４］；此外，山
苍子油还是许多食品的香料添加剂以及各种香水、
ＶＥ、ＶＡ、ＶＫ合成的重要原料来源
［５］；其核仁提炼出
的核仁油含有大量的脂肪酸，主要成分为月桂酸和
癸酸。其中月桂酸的含量达 ５０％以上，可用来代
替椰子油和棕榈仁油，广泛应用于表面活性剂、保
鲜剂、防腐剂制造等工业领域［６－７］。我国是世界上
最大的山苍子油生产国和出口国，年出口量达
３０００ ５０００ｔ左右，产品远销美、日、英、法、德、
瑞士、荷兰、印尼等国［８］。
我国的山苍子野生资源地理分布范围较广，由
于长期的自然选择作用以及地理的隔离效应，导致
了其在自然界中形成了丰富的遗传变异，种内品种
较多，且不同品种的品质和产量均存在很大的差
异，品种选育的空间很大。现有的研究主要侧重于
其精油化学成分分析［９－１１］、繁殖技术［１２－１４］以及精
油加工应用［１５－１９］等方面，有关山苍子的遗传变异
研究和良种选育工作至今尚未开展。探索适合于
山苍子 ＡＦＬＰ分析的技术体系，对于将来深入开展
山苍子的遗传变异研究、分子标记辅助育种以及从
分子水平上研究山苍子品种间的分类鉴定都有重
要的指导作用。ＡＦＬＰ是一种基于 ＰＣＲ的 ＤＮＡ指
纹技术，近年来，ＡＦＬＰ数据作为核基因技术的代
表与 ｍｔＤＮＡ基因测序数据组合，在解决种内遗传
分化、种间系统发育问题方面共同发挥着重要的作
用［２０］。在揭示物种的遗传变异方面，Ｈ．Ｎｙｂｏｍ［２１］
等还认为 ＡＦＬＰ与 ＩＳＳＲ相比，可更为准确地估计
群体内的变异水平。尽管 ＡＦＬＰ实验技术对 ＤＮＡ
的浓度不太敏感，但它对 ＤＮＡ的质量要求比一般
的分子标记技术要高，而且 ＡＦＬＰ技术体系复杂，
操作程序较多，针对特定的物种或分类群，需要对
各个技术环节进行摸索和优化。因此，高质量
ＤＮＡ的提取以及 ＡＦＬＰ反应体系的建立是进行
ＡＦＬＰ成败的关键。本研究通过对山苍子不同组织
材料 ＤＮＡ的提取效果进行比较，以及对 ＡＦＬＰ反
应体系的酶切时间和选择性扩增体系中的几个关
键影响因子进行优化，建立了一套适合于山苍子
ＡＦＬＰ分析的技术体系，为进一步研究山苍子种群
遗传结构、遗传分化以及重要经济性状的关联分析
奠定基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料与试剂
用于ＤＮＡ提取效果分析的山苍子植株新鲜组织
采自中国林科院亚热带林业研究所黄公望森林公园
内；用于多态性引物筛选的山苍子植株个体分别采自
浙江富阳（ＦＹ）、浙江龙泉（ＬＱ）、安徽岳西（ＹＸ）、湖南
衡山（ＨＳ）、福建建瓯（ＪＯ）、云南景东（ＪＤ）。
试剂：ＡＦＬＰ引物及接头由上海生工生物工程有
限公司合成；ＭｓｅＩ、ＥｃｏＲＩ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自ＮＥＢ
公司；λＤＮＡ、ｒＴａｑ聚合酶购自 Ｔａｋａｌａ公司；酚∶氯仿
∶异戊醇（２５∶２４∶１）和氯仿∶异戊醇（２４∶１）、亲和硅
烷购自上海生工生物工程有限公司。
１．２ 山苍子基因组ＤＮＡ的提取及质量检测
本研究参照 Ｊ．Ｊ．Ｄｏｙｌｅ等［２２］的 ＣＴＡＢ法加以
改进。改进的方法中在 ＣＴＡＢ液裂解前，用 ＤＮＡ洗
脱液（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ值８．０），１．４ｍｏｌ
·Ｌ－１ＮａＣｌ，２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ，２％ β巯基乙醇）
反复洗脱几次至上清液不再黏稠；在加入２×ＣＴＡＢ
裂解液（１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣ１（ｐＨ值 ８．０），２０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ，１．４ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣ１，２％ ＣＴＡＢ，
２％ β巯基乙醇，５％ ＰＶＰ）的同时加入２００μＬ的高
盐ＴＥ（１．０ｍｏｌ·Ｌ－１ＮａＣｌ，１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＴｒｉｓＨＣ１
（ｐＨ值８．０），１．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ），混匀，６５℃温
育３０ ６０ｍｉｎ；离心，取上清液于另一离心管，并加
入１／５倍体积的７．５ｍｏｌ·Ｌ－１的 ＮＨ４Ａｃ，颠倒混
匀，冰浴 ３０ｍｉｎ。将提取的 ＤＮＡ浓度调整至 ５０
ｎｇ·μＬ－１备用。将山苍子新鲜幼嫩叶片、顶芽和花
蕾３种组织研磨后，分别取等质量的粉末，用改进的
ＣＴＡＢ法进行各组织基因组 ＤＮＡ的提取，用０．８％
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测 ＤＮＡ的纯
度和浓度。
１．３ ＡＦＬＰ反应体系建立与优化设计
１．３．１ 酶切与连接 本试验选用了 ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ
双酶切组合，为确定酶切效果，试验前分别进行了两
种酶对基因组ＤＮＡ的单独酶切，在确保两种酶单独
酶切效果之后，再进行双酶切和连接反应，单酶切体
系和双酶切反应体系见表１。为确定最佳的酶切反
应时间，设置了６个酶切反应时间梯度试验，时间
分别为１、２、３、４、６、８ｈ；用１％的琼脂糖凝胶电泳检
测酶切效果。连接反应采用３７℃连接４ｈ，连接体
系见表１。
５７１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
表１ 山苍子ＡＦＬＰ反应体系
单酶切体系（２０μＬ） 双酶切体系（２０μＬ） 连接体系（２０μＬ） 预扩增体系（２０μＬ）
ＥｃｏＲＩ５．０ＵＥｃｏＲＩ ５．０ＵＥｃｏＲＩ ２．０ＵＴ４连接酶 ４．０μＬ酶切连接模板
２．０μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液 ５．０ＵＭｓｅＩ ２．０μＬ１０×Ｔ４缓冲液 １．０μＬＭｓｅＩ引物（１００ｎｇ·μＬ－１）
４．０μＬＤＮＡ（５０ｎｇ·μＬ－１） ３．０μＬＤＮＡ（５０ｎｇ·μＬ－１）１．０μＬＭｓｅＩ接头 （５０ｐｍｏｌ·μＬ－１）１．０μＬＥｃｏＲＩ引物（１００ｎｇ·μＬ－１）
加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ 加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ １．０μＬＥｃｏＲＩ接头 （５ｐｍｏｌ·μＬ－１）１．６μＬＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
ＭｓｅＩ５．０ＵＭｓｅＩ 加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ １．６μＬｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
２．０μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液 １．０ＵｒＴａｑ聚合酶
４．０μＬＤＮＡ（５０ｎｇ·μＬ－１） ２．０μＬ１０×Ｔａｑ缓冲液
加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ 加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ
１．３．２ 预扩增体系及选择性扩增优化设计 预扩
增引物采用 Ｅ００／Ｍ００引物组合，引物序列 Ｅ００：５
ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣ３； Ｍ００： ５ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴ
ＧＡＧＴＡＡ３。取酶切连接液４．０μＬ，加入１６μＬ混
合液（反应体系如表１）进行预扩增。扩增程序为９４
℃ ３ｍｉｎ，９４℃３０ｓ，５６℃３０ｓ，７２℃６０ｓ，共３０个
循环，将预扩增产物稀释２０倍，备用。
分别对选择性扩增反应体系中的引物浓度、
Ｍｇ２＋浓度和ｄＮＴＰ浓度分别进行了优化，以建立合
适的山苍子 ＡＦＬＰ扩增体系：引物依次设置 ２００、
１００、５０、２５ｎｇ·μＬ－１４个浓度梯度；Ｍｇ２＋浓度梯度
为不同体系中分别加入 ２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＭｇＣｌ２０．８、
１．０、１．２、１．４、１．６、１．８μＬ，ｄＮＴＰ浓度梯度为不同体
系中分别加入２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ｄＮＴＰ０．８、１．０、１．２、
１．４、１．６、１．８μＬ。其余组分为稀释后的预扩增产物
４．０μＬ，１０×ＰＣＲ缓冲液２．０μＬ，ｒＴａｑ聚合酶１．０
Ｕ，加ｄｄＨ２Ｏ至２０μＬ。降落式ＰＣＲ扩增程序为：９４
℃ ３ｍｉｎ，９４℃ ３０ｓ，６５℃ ３０ｓ，７２℃ ６０ｓ，１３个循
环，每次循环降低０．７℃，然后９４℃ ３０ｓ，５６℃ ３０
ｓ，７２℃ ６０ｓ，３０个循环，７２℃ ５ｍｉｎ，４℃保存。
１．４ 电泳及银染检测
为了获得山苍子不同群体植株的 ＤＮＡ指纹图
谱，将选择性扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。使
用质量分数为６％的聚丙烯酰胺凝８０ｍＬ，加入１０％
的ＡＰＳ２４０μＬ和ＴＥＭＥＤ６４μＬ混匀后立刻灌胶，聚
合１ｈ以上，９５Ｗ预电泳约２５ ３０ｍｉｎ。选择性扩
增产物中加入８．０μＬ上样缓冲液（９８％甲酰胺，１０ｍ
ＭＥＤＴＡ（ｐＨ值８．０），０．２５％溴酚蓝，０．２５％二甲苯腈
蓝），混匀，９５℃变性５ｍｉｎ，立刻转移到冰浴中以防扩
增产物复性，上样６．０μＬ，９５Ｗ恒功率电泳７０ｍｉｎ左
右。电泳结束后采用王亚军等［２３］描述的银染检测方
法进行ＡＦＬＰ指纹显色反应。
２ 结果与分析
２．１ ＤＮＡ提取
为了获得适宜于山苍子 ＡＦＬＰ分析的高质量
ＤＮＡ，经过摸索，最终采用改进的 ＣＴＡＢ法提取山苍
子植株芽组织的 ＤＮＡ。改进后的 ＣＴＡＢ法提取的
ＤＮＡ，吸光度比值在１．７ １．９之间，经０．８％的琼
脂糖凝胶电泳检测，条带清晰且无拖尾，无蛋白质、
多糖等杂质残留胶孔（图１），在后续的酶切实验中，
基因组ＤＮＡ均能被ＥｃｏＲＩ和 ＭｓｅＩ充分酶切，说明
用改进的 ＣＴＡＢ法提取的 ＤＮＡ符合 ＡＦＬＰ分析
的要求。
Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１ ８：不同山苍子个体的ＤＮＡ样本
图１ 改进的ＣＴＡＢ法提取山苍子顶芽组织的ＤＮＡ
在以山苍子植株幼嫩叶片、顶芽和花蕾为材料
提取ＤＮＡ的对比实验中，研究发现，山苍子植株的
顶芽、花蕾是较为理想的 ＤＮＡ提取材料，提取的
ＤＮＡ所含的杂质少，条带清晰。然而在以花蕾为材
料的ＤＮＡ提取过程中，发现经酚∶氯仿∶异戊醇
（２５∶２４∶１）和氯仿∶异戊醇（２４∶１）抽提后的上清液
仍含有大量的黄色色素，最终导致经超纯水溶解的
ＤＮＡ含有一定的色素，从而影响下一步的酶切实
验。从叶片提取的 ＤＮＡ纯度较差，ＤＮＡ得率也较
低（图２、表１）。
λ：λＤＮＡ（５０ｎｇ·μＬ－１）；１ ２：叶片；３ ４：顶芽；５ ６：花蕾
图２ 改进的ＣＴＡＢ法提取３种不同组织的ＤＮＡ
６７１
第２期 田胜平等：山苍子ＡＦＬＰ反应体系的建立及其引物筛选
表２ 改进的ＣＴＡＢ法提取山苍子不同组织
类型的ＤＮＡ样品（ｎ＝８）
组织
类型
ＤＮＡ质量
ＤＮＡ浓度／（ｎｇ·μＬ－１）（珔Ｘ±ＳＤ） ＯＤ２６０／ＯＤ２８０（珔Ｘ±ＳＤ）
顶芽 ９８．２３±０．１２ １．８２±０．０１
叶片 ４２．４５±０．０２ ２．１３±０．０２
花蕾 ８５．４６±０．０１ １．９５±０．０２
２．２ 酶切及连接
ＥｃｏＲＩ和 ＭｓｅＩ两种酶的单酶切电泳结果如图
３所示，ＥｃｏＲＩ酶切后，基因组 ＤＮＡ主带消失，酶切
产物电泳条带低于基因组ＤＮＡ的主带，并呈现均匀
的弥散现象；ＭｓｅＩ酶切后成相对集中的小分子ＤＮＡ
片段，这表明两种酶都能分别进行山苍子基因组
ＤＮＡ的完全酶切。ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ双酶切产物在凝胶
上呈现连续的大小不同的 ＤＮＡ片段（图３）。这不
仅说明山苍子基因组ＤＮＡ能被ＥｃｏＲＩ和ＭｓｅＩ彻底
消化，而且证明了试验所用的酶切体系适合山苍子
的ＡＦＬＰ分析。
Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１：基因组ＤＮＡ，２ ３：ＥｃｏＲＩ酶切，４ ５：ＭｓｅＩ酶切
图３ ＥｃｏＲＩ和ＭｓｅＩ单酶切效果
双酶切反应中酶切时间对酶切效果有很重要的
影响，酶切结果又直接影响着连接反应。酶切时间
过短，基因组 ＤＮＡ不能被限制性内切酶完全酶切；
时间过长，酶的特异性降低，酶切片段的长度变小，
导致连接反应中的接头不能有效连接。为了进一步
探究适合山苍子的双酶切时间，本实验还设置了６
个不同酶切时间的梯度，如图４所示，设置的６个酶
切时间结果和原基因组ＤＮＡ对比发现，基因组ＤＮＡ
的主带消失，６个酶切时间的带型相近，呈均匀弥散
状，判断１ｈ即可完成酶切。
２．３ 扩增体系的建立和优化
预扩增反应起着承上启下的作用，既反应酶切
Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；７：基因组ＤＮＡ，１ ６：１、２、３、
４、６、８ｈ时间梯度
图４ 双酶切时间梯度对比效果
与连接效果的好坏，又直接影响着选择性扩增的电
泳结果。ＥｃｏＲＩ接头和 ＭｓｅＩ接头与酶切片段连接
后，利用Ｅ００和Ｍ００寡核苷酸为引物进行预扩增，扩增
结果表明，预扩增片段主要集中在１００ ５００ｂｐ之
间，不同样品间预扩增带型相对一致（图５）。这表
明接头与酶切片段已连接上，预扩增效果较好，可为
选择性扩增提供理想的模板；同时也表明此前进行
的基因组ＤＮＡ的提取、酶切和连接操作符合要求。
Ｍ：ＤＬ１５００Ｍａｒｋｅｒ；１ ６：ＦＹ、ＬＱ、ＪＯ、ＨＳ、ＪＤ、ＹＸ样品
图５ 预扩增产物电泳检测
由于选择性扩增直接影响实验结果，本实验对
影响选择性扩增的几个关键因子（ｄＮＴＰｓ浓度、Ｍｇ２＋
浓度以及引物浓度）进行了梯度优化。结果显示，
ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）使用量为１．４μＬ时，选择性
扩增取得了最佳效果，浓度过高或过低均不同程度
地存在非特异性扩增或主带扩增不明显现象（图
６）。Ｍｇ２＋（２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１）使用量小于１．６μＬ时，
没有条带，只有弥散的带痕；Ｍｇ２＋使用量为１．６μＬ
时，主带虚弱；Ｍｇ２＋使用量为１．８μＬ时，主带次带均
７７１
林 业 科 学 研 究 第２５卷
清晰可见（图７）。扩增体系中引物使用量小于１００
ｎｇ时，扩增效果不明显，只有弥散的带痕；引物使用
量为２００ｎｇ时，主带扩增较模糊，且存在非特异性
扩增现象；引物使用量为１００ｎｇ时，主带次带均清
晰可见，扩增效果最好（图 ８）。优化后的山苍子
ＡＦＬＰ选择性扩增的最佳反应体系为：２０μＬ反应体
系中含有１．０ＵｒＴａｑ聚合酶、２．０μＬ１０×ＰＣＲ缓冲
液、１．８μＬ２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１Ｍｇ２＋、１．４μＬ２．５ｍｍｏｌ·
Ｌ－１ｄＮＴＰｓ、１００ｎｇ·μＬ－１引物各１．０μＬ，预扩增产
物稀释２０倍作为选择性扩增模板。使用该体系，不
同山苍子个体经不同引物组合的选择性扩增产物在
１％的琼脂糖凝胶上呈主带明亮，次带虚弱现象，扩
增效果较好（图９）。
Ｍ：ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１ ６：０．２２５、０．２００、０．１７５、
０．１５０、０．１２５、０．１００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
图６ ｄＮＴＰ浓度变化的选择性扩增效果
Ｍ：ＤＬ１５００Ｍａｒｋｅｒ；１ ６：２．２５、２．００、１．７５、
１．５０、１．２５、１．００ｍｍｏｌ·Ｌ－１
图７ Ｍｇ２＋浓度变化的选择性扩增效果
Ｍ：ＤＬ１５００Ｍａｒｋｅｒ；１１、１２：２００ｎｇ·μＬ－１，２１、２２：１００ｎｇ·μＬ－１，
３１、３２：５０ｎｇ·μＬ－１，４１、４２：２５ｎｇ·μＬ－１
图８ 引物浓度变化的选择性扩增效果
Ｍ：ＤＬ１５００Ｍａｒｋｅｒ；１ ３，４ ６，７ ９，１０ １２，１３ １５分别为
ＥＡＡＣ／ＭＴＣＣ、ＥＡＣＧ／ＭＣＴＴ、ＥＡＡＧ／ＭＴＣＣ、ＥＡＣＴ／ＭＣＴＴ、ＥＡＣＴ／ＭＣＣＴ引物组合
图９ 不同引物组合的选择性扩增效果
２．４ 多态性引物的筛选
为了获取可供山苍子自然群体遗传多样性分析
的引物组合，本实验从６个不同群体中选取生态型
差异较大的山苍子个体用于多态性引物的筛选，最
后共筛选出 １０对多态性引物。总的来看，山苍子
ＡＦＬＰ图谱的片段大小在５０ ５００ｂｐ范围内，各引
物组合平均扩增出的条带数在３０条左右，片段大小
范围较为适中，不同引物组合扩增的多态性高低、条
带清晰度、分布均匀度均相差较大（图１０）。筛选的
１０对引物共扩增出３０３条条带，其中多态性条带为
８７１
第２期 田胜平等：山苍子ＡＦＬＰ反应体系的建立及其引物筛选
２５９条，多态性比率达 ７５．０％ ９４．１％。其中
ＥＡＣＧ／ＭＣＡＡ引物多态性最高（９４．１％），ＥＡＣＴ／
ＭＣＴＴ引物多态性最低（７５．０％）（表３）。筛选出的
这１０对引物多态性较好，可以进一步用于山苍子遗
传多样性研究。
Ｍ：ＤＬ１５００Ｍａｒｋｅｒ；Ｐ１ Ｐ６：ＥＡＡＣ／ＭＴＣＣ、ＥＡＣＧ／ＭＣＴＴ、ＥＡＣＧ／ＭＣＴＡ、ＥＡＡＧ／ＭＴＣＣ、
ＥＡＣＴ／ＭＣＴＴ、ＥＡＣＴ／ＭＣＣＴ引物组合，每６个泳道为筛选的一对引物
图１０ 部分引物组合产生的ＰＡＧＥ谱带
表３ 山苍子ＡＦＬＰ引物筛选结果及条带多态性
引物组合 总条带数 条带范围／ｂｐ 多态条带数 多态性比率／％
ＥＡＡＧ／ＭＴＣＣ ２８ ５０ ４００ ２４ ８５．７％
ＥＡＡＧ／ＭＣＡＡ ２６ ５０ ４００ ２３ ８８．５％
ＥＡＣＴ／ＭＣＴＴ ３２ １００ ５００ ２４ ７５．０％
ＥＡＣＴ／ＭＣＡＡ ３０ １００ ４００ ２６ ８６．７％
ＥＡＣＧ／ＭＣＴＴ ２８ ５０ ４００ ２５ ８９．３％
ＥＡＣＧ／ＭＣＣＴ ２３ ５０ ４００ ２０ ８７．０％
ＥＡＡＣ／ＭＴＣＣ ３４ ５０ ５００ ２８ ８２．４％
ＥＡＣＧ／ＭＣＴＡ ３６ ５０ ４００ ３１ ８６．１％
ＥＡＣＴ／ＭＣＣＴ ３２ ５０ ５００ ２６ ８１．３％
ＥＡＣＧ／ＭＣＡＡ ３４ ５０ ５００ ３２ ９４．１％
３ 讨论
樟科的许多植物如肉桂（Ｃｉｒｍａｍｏｎｕｃａｓｉａ
Ｐｒｅｓ１．）、锡兰肉桂（Ｃ．ｚｅｙｌａｎｉｃｕｍＢｌ．Ｂｉｊｄｒ．）、阴香
（Ｃ．ｂｕｒｍａｎｎｉ（Ｃ．Ｇ．ｅｔＴｈ．Ｎｅｅｓ）Ｂ１．）等属于分
子生物学家所称的顽拗植物（ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔｐｌａｎｔ）。这
类植物细胞内含有大量的多糖、鞣质、多酚等多种次
生代谢产物，采用常规的 ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、高盐低
ｐＨ法提取总ＤＮＡ时，都不能很好地除掉这些物质，
导致提取分离出的 ＤＮＡ由于不可逆地结合了这些
次生代谢物而呈棕褐色，ＤＮＡ溶液粘稠，这种不纯
的ＤＮＡ既不能被内切酶酶切，也不能作为 ＰＣＲ模
板，不能用于常规的分子生物学分析和研究［２４］。在
实验初期，本研究分别采用了常规 ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法
和试剂盒法提取山苍子基因组 ＤＮＡ。结果发现，
ＳＤＳ法的提取效果最差，提取的 ＤＮＡ含杂质较多，
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林 业 科 学 研 究 第２５卷
且ＤＮＡ溶液的粘稠度较高；试剂盒法提取的 ＤＮＡ
溶液尽管不存在ＤＮＡ粘稠的问题，但研磨后的山苍
子叶片粉末经裂解液裂解后粘稠度仍较高，所释放
出的ＤＮＡ大多被次生代谢物质所包裹，最终导致提
取的ＤＮＡ得率较低，此外，试剂盒法提取的 ＤＮＡ降
解较严重，这可能与试剂盒所采用的离心柱有关；在
采用常规的 ＣＴＡＢ法提取山苍子基因组 ＤＮＡ时发
现，经ＣＴＡＢ液裂解后的上清液粘稠度极高，下一步
抽提操作也难以进行。为此，作者在传统 ＣＴＡＢ法
的基础上加以改进，如在加入ＣＴＡＢ裂解液前，先用
ＤＮＡ洗脱液反复洗脱几次、水浴裂解时加入高盐ＴＥ
以及在裂解液中加入醋酸铵冰浴３０ｍｉｎ，以达到降
低粘稠度的目的。实验证明，这些处理对 ＤＮＡ的提
取有一定的有效性，所得 ＤＮＡ粘稠度较低，但尚不
能满足于 ＡＦＬＰ实验对高质量 ＤＮＡ的要求。采用
改进的ＣＴＡＢ法在以山苍子植株幼嫩叶片、顶芽和
花蕾为材料提取 ＤＮＡ的对比实验中，作者发现，以
山苍子顶芽组织为材料提取 ＤＮＡ时，经 ＣＴＡＢ裂解
后的上清液粘稠性较低，经两次抽提后，上清液呈较
为透明状的液体，所得ＤＮＡ纯度和得率都较高。这
可能是由于在山苍子叶片组织中存在的难以抽提的
次生代谢物质在芽的发育早期还尚未参与合成或含
量较低的缘故。因此，选用山苍子植株的顶芽组织，
并采用改良的ＣＴＡＢ法进行样本 ＤＮＡ的提取，所得
ＤＮＡ质量能满足ＡＦＬＰ分子标记实验的要求。
酶切反应是ＡＦＬＰ反应的关键步骤之一。本研
究选用ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ酶切组合，获得的条带分布均
匀，能满足后续分析的要求。在以往的研究中，为了
使基因组ＤＮＡ得到充分酶切，一般采用延长酶切时
间的方法，然而，随着酶切时间的延长，内切酶的特
异性降低，很容易形成非特异性酶切现象，这势必会
对连接和后续的实验产生影响。为了确定合适的酶
切反应时间，在保证 ＤＮＡ质量的前提下，对酶切时
间进行优化，实验发现，山苍子基因组ＤＮＡ在３７℃
条件下经ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ双酶切１ｈ即可完全完成酶
切，这一结论与赵敏在进行喙尾琵甲（Ｂｌａｐｓｒｈｙｎｃｈｏ
ｐｅｔｅｒａＦａｉｒｍａｉｒｅ）基因组 ＤＮＡ酶切反应时的结论一
致［２０］。在后续的预扩增反应中也充分显示出酶切１
ｈ和其它酶切时间的预扩增片段范围也近乎一致，
这与通常所认为的酶切反应时间至少需要４ｈ以上
有所不同，大大缩短了试验时间，说明在保证 ＤＮＡ
模板质量和内切酶高效率的前提下，较短的时间内
就可以完成基因组 ＤＮＡ的限制性酶切。预扩增的
引物一般只含有１个选择性碱基或不含选择性碱
基，选择性较差，在琼脂糖凝胶中往往形成连续的一
片［２５］。理论上，预扩增产物分子量大小应在１００
１５００ｂｐ［２６］。然而，山苍子预扩增产物却仅集中在
１００ ５００ｂｐ范围之间，这在许多其它植物ＡＦＬＰ反
应过程中是非常少见的，可能与其基因组中酶切位
点的分布有关。
本试验采用单因子 ＰＣＲ优化设计对各个影响
因素进行研究，对最佳水平的确定更为直观，综合各
因素最佳水平，确定了最佳反应体系；并筛选出可供
山苍子遗传多样性研究的１０对多态性高、条带较为
丰富的引物组合。所构建的山苍子 ＡＦＬＰ反应体系
为进一步开展山苍子种群遗传学研究奠定了良好的
技术基础。然而，由于 ＡＦＬＰ不能同 ＩＳＳＲ或 ＲＡＰＤ
等标记一样可以直接通过琼脂糖电泳进行条带的优
化比较，本实验没有进一步采用正交设计或均匀设
计来考虑选择性体系中各因素的交互作用，ＡＦＬＰ条
带的优化将在接下来的银染步骤中进一步地探索。
参考文献：
［１］ＭａｏＡＡ，ＷｅｔｅｎＡ，ＦａｙＭ，ｅｔａｌ．ＩｎｖｉｔｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎｏｆＬｉｔｓｅａ
ｃｕｂｅｂａ（Ｌｏｕｒｓ．）Ｐｅｒｓ．，ａｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅｔｒｅｅ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌＲｅｐｏｒｔ，
２０００，１９（３）：２６３－２６７
［２］王 旭，杨关锋．我国山苍子开发利用中存在的问题研究与发
展对策［Ｊ］．经济林研究，２０１０，２８（３）：１３６－１３９
［３］陈卫军，龚洵胜，游小敏．山苍子播种繁殖及扦插育苗初探
［Ｊ］．经济林研究，２００４，２２（４）：５９－６０
［４］汤青云，钟桐生，汤建国，等．山苍子中油脂的提取与利用［Ｊ］．
湘南学院学报，２００４，２５（５）：６１－６３
［５］ＬｕｏＭ，ＪｉａｎｇＬＫ，ＺｏｕＧＬ．Ａｃｕｔｅａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｏｉｌｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍＬｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａ（Ｌｏｕｒ．）Ｐｅｒｓ．［Ｊ］．ＦｏｏｄＰｒｏｔ，
２００５，６８（３）：５８１－５８４
［６］黄光文，卢向阳．我国山苍子油研究概况［Ｊ］．湖南科技学院学
报，２００５，２６（１１）：９７－１００
［７］陈铁壁，袁先友，张 敏，等．超临界ＣＯ２萃取山苍子核仁油的
工艺研究［Ｊ］．生物质化学工程，２００９，４３（１）：５－８
［８］潘晓杰，陈卫军，侯红波．山苍子资源利用加工现状及开发前
景的研究［Ｊ］．经济林研究，２００３，２１（１）：７９－８０
［９］ＹｕＹ，ＪｉａＺＪ，ＬｕｏＢ，ｅｔａｌ．Ｔｈｅｆｕｎｇｉｃｉｄａｌｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓａｎｄｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｏｉｌｆｒｏｍＬｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａｉｎＴｉｂｅｔ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１０，１５（１０）：７０７５
－７０８２
［１０］ＲｕｍｉＫ，ＰａｔｈａｋＭＧ，ＫａｎｊｉｌａＰＢ．Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓ
ｔｉｃｓｏｆｓｅｅｄｏｉｌｓｏｆｓｏｍｅＬｉｔｓｅａｓｐｅｃｉｅｓｆｏｕｎｄｉｎｎｏｒｔｈｅａｓｔＩｎｄｉａ
［Ｊ］．ＮａｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔＲａｄｉａｎｃｅ，２００７，６（４）：２９７－３００
［１１］王发松，杨得坡，任三香，等．山苍子叶挥发油的化学成分与
抗真菌活性［Ｊ］．中药材，１９９９，２２（８）：４００－４０２
［１２］孙雁霞，石大兴，王米力，等．山苍子的离体培养和植株再生
［Ｊ］．植物生理学通讯，２００２，３８（４）：３５３
０８１
第２期 田胜平等：山苍子ＡＦＬＰ反应体系的建立及其引物筛选
［１３］陈卫军，龚洵胜，游小敏，等．山苍子播种繁殖及扦插育苗初
探［Ｊ］．经济林研究，２００４，２２（４）：５９－６０
［１４］赵佐敏．影响山苍子离体快繁效果的主要因素研究［Ｊ］．安徽
农业科学，２００５，３３（９）：１６５０－１６５２
［１５］ＷａｎｇＹ，ＪｉａｎｇＺＴ，ＬｉＲ．Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｉｃｒｏｃａｐ
ｓｕｌｅｓｏｆＬｉｔｓｅａｃｕｂｅｂａｅｓｓｅｎｔｉａｌｏｉｌｗｉｔｈβｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎａｎｄｉｔｓｄｅｒｉｖａ
ｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＥｕｒＦｏｏｄＲｅｓＴｅｃｈｎｏｌ，２００９，２２８：８６５－８７３
［１６］ＬｕｏＭ，ＪｉａｎｇＬＫ，ＸｉａｏＭ，ｅｔａｌ．ＥｆｅｃｔｓｏｆｃｉｔｒａｌｏｎＡｓｐｅｒｇｉｌｕｓ
ｆｌａｖｕｓｓｐｏｒｅｓｂｙｑｕａｓｉ－ｅｌａｓｔｉｃｌｉｇｈｔｓｃａｔｅｒｉｎｇａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘｍｉｃｒｏ
ａｎａｌｙｓｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＳｉｎ，２００４，３６（４）：
２７７－２８３
［１７］殷志勇，王秋娟，贾 莹．山苍子水提物柠檬醛抗哮喘作用的
实验研究［Ｊ］．中国临床药理学与治疗学，２００５，１１（２）：１９７
－２０１
［１８］肖 勇，李 良．木姜子属挥发油成分及其生物活性研究概况
［Ｊ］．云南化工，２００７，３４（５）：８５－９２
［１９］蔡海清，钟世安，艾海东．山苍籽核仁油合成生物柴油研究
［Ｊ］．中南大学学报：自然科学版，２００９，４０（６）：１５１６－１５２１
［２０］赵 敏，冯 颖，和 锐，等．喙尾琵甲ＤＮＡ提取方法比较与
ＡＦＬＰ反应体系建立［Ｊ］．林业科学研究，２０１０，２３（２）：２３４－２４０
［２１］ＣｉＸＱ，ＣｈｅｎＪＱ，ＬｉＱＭ．ＡＦＬＰａｎｄＩＳＳＲａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｈｉｇｈ
ｇｅｎｅｔｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎａｎｄｉｎｔｅｒｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎｆｒａｇｍｅｎｔｅｄ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｅｎｄａｎｇｅｒｅｄＬｉｔｓｅａｓｚｅｍａｏｉｓ（Ｌａｕｒａｃｅａｅ）ｆｒｏｍ
ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＣｈｉｎａ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｙｓｔＥｖｏｌ，２００８，２７３（３－４）：２３７
－２４６
［２２］ＤｏｙｌｅＪＪ，ＤｏｙｌｅＪＬ．ＡｒａｐｉｄＤＮＡｉｓｏｌａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｆｏｒｓｍａｌ
ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｆｒｅｓｈｌｅａｆｔｉｓｓｕｅ［Ｊ］．ＰｈｙｔｏｃｈｅｍＢｕｌ，１９８７，１９：１１
－１５
［２３］王亚军，吴立山，厉盛华，等．几种药品对聚丙烯酰胺凝胶电
泳银染的影响［Ｊ］．水利渔业，２００５，２５（２）：１３－１４
［２４］ＶｒｏｈＢｉＩ，ＨａｒｖｅｎｇｈｔＬ，ＣｈａｎｄｅｌｉｅｒＡ，ｅｔａｌ．ＩｍｐｒｏｖｅｄＲＡＰＤａｍ
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｔｐｌａｎｔＤＮＡｂｙｔｈｅｕｓｅｏｆａｃｔｉｖａｔｅｄｃｈａｒｃｏａｌ
ｄｕｒｉｎｇＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＢｒｅｅｄ，１９９６，１１５（３）：２０５
－２０６
［２５］萨姆布鲁克 Ｊ，弗里奇 ＥＦ，曼尼阿蒂斯 Ｔ．分子克隆实验指南
［Ｍ］．金冬雁，黎孟枫，译．２版．北京，科学出版社，１９９６
［２６］王 斌，翁曼丽．ＡＦＬＰ的原理及其应用［Ｊ］．杂交水稻，１９９６，
（５）：２７－３０
［２７］李 鹏，汪阳东，陈益存，等．油桐ＩＳＳＲＰＣＲ最佳反应体系的
建立［Ｊ］．林业科学研究，２００８，２１（２）：１９４－１９９
［２８］萨姆布鲁克 Ｊ，拉赛尔 ＤＷ．分子克隆实验指南［Ｍ］．黄培堂，
王嘉玺，朱厚础，等，译．３版．北京：科学出版社，２００２
１８１