全 文 ：第 v|卷 专刊 t
u s s v年 tu 月
林 业 科 学
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Φρανκια菌遗传多样性的 ρ∆ΝΑ ΙΓΣ ΡΦΛΠ研究 3
李志真tl 谢一青vl
k福建省林业科学研究院 福州 vxsstul
陈 坚ul 郑伟文wl
k福建省农业科学研究院生物技术中心 福州 vxsssvl
陈启锋xl
k福建农林大学 福州 vxsssul
关键词 } 放线菌结瘤植物 o Φρανκια o°≤• o • ƒ°分析 o多样性
收稿日期 }ussv p sv p ut ∀
基金项目 }福建省科技厅自然科学基金资助项目k…||vsstl ∀
3 tl !ul !vl !wl !xl为作者排序 ∀参加工作的还有吴忠兴同志 o在此谨致谢意 ∀
∆Ις ΕΡΣΙΤΨ ΟΦ ΑΧΤΙΝΟΡ ΗΙΖΑΛ ΦΡΑΝΚΙΑ ΒΨ ρ∆ΝΑ ΙΓΣ ΡΦΛΠ ΑΝΑΛΨΣΙΣ
¬«¬½«¨ ±tl ÷¬¨ ≠¬´¬±ªvl
k Φυϕιαν Αχαδεµψοφ Φορεστρψ Φυζηουvxsstul
≤«¨ ± ¬¤±ul «¨ ±ª • ¬¨º¨ ±wl
k Βιοτεχηνολογψ Χεντερo Φυϕιαν Αχαδεµψοφ ΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ Φυζηουvxsssul
≤«¨ ± ±¬©¨ ±ªxl
k Φυϕιαν Αγριχυλτυρε ανδ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Φυζηουvxsssvl
Αβστραχτ } ⁄‘„ ¬¨·µ¤¦·¨§§¬µ¨¦·¯¼©µ²°·«¨ ¬¯√¬±ª±²§∏¯ ¶¨²© Χασυαρινα χυννινγηαµιαναo Χqχολλιναo Χqγλαυχαo Αλνυσ
χρεµαστογψνε o Αqτραβεχυλοσα ¤±§ Μψριχα ρυβρα ¤±§¤¯¶²©µ²° ut Φρανκια ¶·µ¤¬±¶¬¶²¯¤·¨§©µ²° ·«¨ µ²²·±²§∏¯ ¶¨²©·«¨
¤¦·¬±²µ«¬½¤¯ ³¯¤±·¶¬± ƒ∏­¬¤±o¬±¦¯∏§¬±ª Χq χυννινγηαµιαναo Χqεθυισετιφολιαo Χqγλαυχαo Αqχρεµαστογψνε ¤±§ Μq
ρυβραq°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± º¤¶¦²±§∏¦·¨§º¬·«·«¨ ³µ¬°¨ µ¶·¤µª¨·¬±ª·«¨ v. ±¨§²©·«¨ ty≥µ⁄‘„ o·«¨ ŒŠ≥ o¤±§·«¨ x. ³¤µ·
²©·«¨ uv≥ µ⁄‘„ k¬q¨ qoµµ± µ¨ª¬²±l q°≤• ³µ²§∏¦·¶º¨ µ¨ ·«¨ ± ¤±¤¯¼½¨ §¥¼ ∏¶¬±ª¤¶¨·²©µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨§²±∏¦¯¨ ¤¶¨¶q׺²
§¬¶·¬±¦·ª¨ ±¨·¬¦ªµ²∏³¶º¨ µ¨ µ¨¦²ª±¬½¨ §²±·«¨ ¥¤¶¬¶²©·«¨¶¨ µ¨¶·µ¬¦·¬²±³¤·¨µ±¶q„¯¯ Φρανκια¶·µ¤¬±¶¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«·«¨ «²¶·
¶³¨¦¬¨¶²© Χασυαρινα º¨ µ¨ ¤¶¶¬ª±¨ §·²·«¨ ¶¤°¨ ªµ²∏³q Φρανκια ¬¯√¬±ª¬±·«¨ ±²§∏¯ ¶¨²© Μψριχᤱ§ Αλνυσ ¥¨ ²¯±ª¨§·²·«¨
²·«¨µªµ²∏³qŒ± Μψριχα2Αλνυ󪵲∏³o·«¨µ¨ º¤¶·º²¶∏¥2ªµ²∏³º«¬¦«²±¨ ¬±¦¯∏§¨§ Αqχρεµαστογψµε ¤±§·«¨ ²·«¨µ¦²±·¤¬±¨ §
Αqτραβεχυλοσα ¤±§ Μqρυβραq׫¨ µ¨¶∏¯·¶²© • ƒ° ¤±¤¯¼¶¬¶¶«²º¨ §·«¤··«¨ ª¨ ±¨·¬¦§¬√¨ µ¶¬·¼ ²© Φρανκια ¤¶¶²¦¬¤·¨§º¬·«
Χασυαρινᦲ∏¯§ ¥¨ ²¯º¨ µo ¥∏·Φρανκια ¬¨¬¶·¨§¬± ·«¨ ¶²¬¯¶²© ƒ∏­¬¤± °µ²√¬±¦¨ º²∏¯§ «¤√¨ °²µ¨ µ¬¦«±¨ ¶¶¬± ª¨ ±¨ ·¬¦
§¬√¨ µ¶¬·¼q׫¨ µ¨¶∏¯·¶¤¯¶²µ¨©¯ ¦¨·¨§·«¤·«²¶·³¯¤±·«¤¶¤± ¤¥¬¯¬·¼·²¦«²²¶¨ ·«¨ ¶·µ¤¬±¶·²©²µ° ¤¶¼°¥¬²±·q
Κεψ ωορδσ} „¦·¬±²µ«¬½¤¯ ³¯¤±·¶o Φρανκιαo°≤• o • ƒ° ¤±¤¯¼¶¬¶o⁄¬√¨ µ¶¬·¼
Φρανκια是一类能与非豆科树木共生结瘤固氮的放线菌 ∀关于其属的分类目前比较确认 o对于种水
平的划分 o虽然从可溶性蛋白类型k张道海等 ot||t ~…¨ ±¶²± ετ αλqot|{v ~Š¤µ§¨¶ετ αλqot|{z¤l !同功酶类型
kŠ¤µ§¨¶ ετ αλqot|{z¥~张道海等 ot|{|l !脂肪酸k • ¨¨¯¨µετ αλqot|{yl !血清k…¤®¨µετ αλqot|{t ~孙慧君等 o
t||tl !宿主特异性k…¤®¨µot|{z ~ײµµ¨¼ ετ αλqot|{|l !⁄‘„同源性kƒ µ¨°¤°§¨¬ ετ αλqot|{| ~„®¬°²√ ετ αλqo
t||ul !基因组k⁄²¥µ¬·¶¤ot|{xl和质粒的限制酶切图谱k≥¬°²±¨ ·ετ αλqot|{xl等诸多方面进行了分析 o但由
于研究的菌株数量有限 o且培养过程中菌株的生物学特性易发生变异 o因而迄今为止仍没有一种有效的
种的分类方法 ∀近年来 oty≥ µ⁄‘„及其 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ 间隔序列作为一个分子标记 o广泛应用于各种微
生物的分子遗传差异和分类鉴定研究k韦革宏等 ot||| ~冯瑞华 ousss ~≤¯ ¤º¶²± ετ αλqot||{ ~t|||l ∀尤其
是 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ 间区 o比 ty≥ µ⁄‘„本身具有更强的高变性 o具有长度和序列上的多态性 o被认为是区
分菌种 !鉴定亲缘关系和了解遗传多样性的一种新方法k韦革宏等 ot||| ~焦振泉等 ousst ~•²∏√¬¨µετ αλqo
t||yl ∀国内对沙棘k Ηιπποπηαε ρηαµνοιδεσl !黄果沙枣k Ελαεαγνυσ οξψχαρπαl !美洲赤杨k Αλνυσρυγοσαl !色赤
杨k Αq τινχτορια σαργl !细枝木麻黄k Χασυαρινα χυννινγηαµιαναl !短枝木麻黄k Χqεθυισετιφολιαl等 tu 个
Φρανκια纯培养菌株和沙棘 !色赤杨 !毛赤杨kΑqινχαναl !冬赤杨kΑqνεπαλενσισl等 w种放线菌结瘤植物根
瘤 Φρανκια内进行了 ty≥ ⁄‘„扩增及酶切图谱分析 o认为 Φρανκια菌株间存在着丰富的遗传多样性k刘
忠等 ousst ~吴少慧等 ousstl ∀本文旨在利用 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ 间区µ• ‘„操纵子基因kµµ±l为分子指标 o对
来自福建不同地区及广州的木麻黄 !赤杨 !杨梅k Μψριχα ρυβραl !胡颓子k Ελαεαγνυ󶳳ql等几种放线菌结
瘤植物共生 Φρανκια进行 °≤• 扩增和 • ƒ°分析 o以其进一步了解 Φρανκια的遗传差异和种群多样性 o为
Φρανκια的分类鉴定提供参考 ∀
1 材料与方法
t1t 供试菌株 供试 Φρανκια菌株 ut株 o其中木麻黄菌株 tu株 o杨梅菌株 z株 o四川桤木和福建胡颓
子k Ελαεαγνυσ ολδηαµιl菌株各 t株 ∀菌株 |xxs和 uutx分别由中国林业科学研究院热带林业研究所康丽
华研究员和中科院微生物研究所刘志恒研究员惠赠 o其余均分离自福建放线菌结瘤植物 o各菌株及宿
主 !来源见表 t ∀
表 1 供试 Φρανκια菌株及宿主 !来源
Ταβ . 1 Φρανκια στραινσ υσεδ ανδ τηειρ ηοστσ ανδ οριγινσ
菌株 ≥·µ¤¬±¶ 宿主植物 ‹²¶·³¯¤±·¶ 来源 ²¦¤·¬²± 土壤生境 ≥²¬¯
ƒ≤¦„≤su 细枝木麻黄 Χq χυννινγηαµιανα 福 州 ƒ∏½«²∏ 珍珠岩 °¨ µ¯¬·¨
ƒ≤¦„≤sw 细枝木麻黄 Χqχυννινγηαµιανα 福 州 ƒ∏½«²∏ 珍珠岩 °¨ µ¯¬·¨
ƒ≤¦yw 细枝木麻黄 Χqχυννινγηαµιανα 福 鼎 ƒ∏§¬±ª 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒ≤¦|t 细枝木麻黄 Χqχυννινγηαµιανα 惠 安 ‹∏¬. ¤± 层积沙壤 ≥¤±§
ƒ≤ t¨| 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 东 山 ⁄²±ª¶«¤± 层积沙壤 ≥¤±§
ƒ≤ u¨v 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 东 山 ⁄²±ª¶«¤± 层积沙壤 ≥¤±§
ƒ≤ v¨z 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 惠 安 ‹∏¬. ¤± 层积沙壤 ≥¤±§
ƒ≤ w¨u 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 莱 舟 ¤¬½«²∏ 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒ≤ z¨u 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 惠 安 ‹∏¬. ¤± 层积沙壤 ≥¤±§
ƒ≤ z¨x 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 惠 安 ‹∏¬. ¤± 层积沙壤 ≥¤±§
|xxs 短枝木麻黄 Χqεθυισετιφολια 广 州 Š∏¤±ª½«²∏ 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒ≤ªs{ 粗枝木麻黄 Χqγλαυχα 东 山 ⁄²±ª¶«¤± 层积沙壤 ≥¤±§
ƒ„¦st 四川桤木 Αqχρεµαστογψνε 莱 舟 ¤¬½«²∏ 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒµtv 杨 梅 Μq ρυβρα 莱 舟 ¤¬½«²∏ 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒµty 杨 梅 Μq ρυβρα 莱 舟 ¤¬½«²∏ 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒµuw 杨 梅 Μq ρυβρα 莱 舟 ¤¬½«²∏ 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒµvt 杨 梅 Μq ρυβρα 长 汀 ≤«¤±ª·¬±ª 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒµwv 杨 梅 Μq ρυβρα 武夷山 • ∏¼¬¶«¤± 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒµx| 杨 梅 Μq ρυβρα 福 鼎 ƒ∏§¬±ª 山地红壤 • §¨¶²¬¯
uutx 杨 梅 Μq ρυβρα 云 南 ≠∏±±¤± 山地红壤 • §¨¶²¬¯
ƒ∞²st 福建胡颓子 Ε qολδηαµι 惠 安 ‹∏¬. ¤± 层积沙壤 ≥¤±§
t1u 植物根瘤 供试根瘤为细枝木麻黄 !粗枝木麻黄 !山神木麻黄k Χqχολλιναl !杨梅 !四川桤木k Αλυσ
χρεµαστογψνεl !江南桤木kΑqτραβοχυλοσαl等 y种 o其中粗枝木麻黄 !细枝木麻黄 !山神木麻黄根瘤采自海边
沙地 o杨梅 !四川桤木根瘤采自山地红壤 o江南桤木根瘤来自沼泽地 o海拔约 |ss °∀采集的根瘤保存于
p t{ ε 冰箱直至使用 ∀
t1v 引物及限制性内 切酶 引物 为 ƒŠ°≥{s|¤¦ 和 ƒŠ°tvu . o其核苷 酸序 列为 }x . p
ŠŠŠŠ×≤≤Š×„„ŠŠŠ×≤ p v. 和 x. p ≤≤ŠŠŠ×××≤≤≤≤„××≤ŠŠ p v. k•²∏√¬¨µετ αλqot||yl o由上海生物工程
公司合成 ∀扩增区域为 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„间隔区的核糖体操纵子部分序列kµµ±区l ∀限制性内切酶 Νχι
´ !Ρσα´ !Μσπ ´ !Νδε µ o系 °µ²°¬ª¤公司的产品 ∀
t1w 菌株及根瘤 ⁄‘„的提取 参照彭源东等kt||zl的 ≤ׄ…提取方法 o并略加改进 ∀离心收集 …„°液
体培养 w ∗ {周后菌体k约 ys °ªl o于研浆器中匀浆 o用 ×∞{k×µ¬¶xs °°²¯#pt o∞⁄ׄ us °°²¯#pt o³‹{1sl
溶液洗涤 t次 o之后用 ב∞溶液k×µ¬#‹≤¯ ts °°²¯#pt o‘¤≤¯ tss °°²¯#pt o∞⁄ׄ t°°²¯#pt o³‹{1sl再
{{t 林 业 科 学 v|卷
洗涤 u次 o离心收集菌体悬浮液 o加入 vss ˏu ≅ ≤ׄ…提取缓冲液k≤ׄ…u h o×µ¬#‹≤Œ tss °°²¯ #pt o
∞⁄ׄ us °°²¯#pt o‘¤≤¯ t1w °²¯#pt o³‹{1sl o充分摇匀 ozs ε 水浴 v«∀随后加入等体积的氯仿Β异戊醇
kuwΒtl溶液 o混匀 oz sss ≅ ª离心 v °¬±o移取上清液至新 ∞°管 o加 uΠts体积的 ≤ׄ…沉淀缓冲液k≤ׄ…
x h o‘¤≤¯ s1vx °°²¯#ptl oyx ε 水浴 ts °¬±∀混合物加入以酚Β氯仿Β异戊醇kuwΒuvΒtl溶液 otv sss ≅ ª离
心 ts °¬±o如此抽提 u次后 o加入 tΠts体积 v °²¯#pt Ž„¦o以无水乙醇沉淀 ⁄‘„ o干燥 o以 ×∞k×µ¬¶ts
°°²¯#pt o∞⁄ׄ t °°²¯#ptl溶液保存于 p us ε ∀同时取 u ˏ于 s1{ h琼脂糖凝胶电泳检测 ∀
根瘤内生菌 ⁄‘„的提取参照 •²∏√¬¨µ方法k•²∏√¬¨µετ αλqot||yl o选取幼嫩根瘤瘤瓣k约 t ∗ ts °ªl o
以 vs h ‹u ’u 消毒根瘤表面 o洗净 o剥去表皮 o取根瘤尖端的含菌组织 o于 vss ˏ提取缓冲液1×µ¬¶k³‹{l
tss °°²¯#pt o∞⁄ׄ us °°²¯#pt o‘¤≤¯ t1w °²¯#pt o≤ׄ… u h ot h °∂°°2中研磨 o匀浆液置于 yx ε 水浴
ys °¬±oz sss ≅ ª离心 ts °¬±o除去植物组织 o混合物以等体积酚氯仿等抽提 o以无水乙醇沉淀 ⁄‘„ o干
燥 o加入等体积聚乙醇 p氯化钠混合液纯化k聚乙醇 us h o‘¤≤¯ u1x °²¯#ptl o最后 ⁄‘„在 p us ε ×∞溶
液中保存 ∀
t1x °≤• 扩增 °≤• 扩增反应总体积为 xs ˏo其中包括 u ˏ模板 ⁄‘„k Φρανκια基因组 ⁄‘„l os1u °°²¯
#pt引物 !s1u °°²¯#pt§‘×° oפ´ 酶k°µ²°¬ª¤公司产品lt˜ ∀扩增反应在 °×≤tss扩增仪上进行 }|x ε
变性 v °¬±o然后以 |w ε t °¬±oxs ε t °¬±ozu ε u °¬±程序循环扩增 vx次 o最后 zu ε 延伸 z °¬±∀ °≤• 产
物在 t1x h琼脂糖凝胶上电泳 o∞…染色 o于 …¬²2•¤§⁄²¦usss凝胶成像仪上检查扩增效果 ∀
t1y • ƒ°分析 根据内切酶的酶切位点及 •²∏√¬¨µ的试验结果k•²∏√¬¨µετ αλqot||yl o本试验选用 w种
内切酶 Νχι ´ !Ρσα´ !Μσπ ´ !Νδε µ对 °≤• 产物进行酶切 ∀酶切反应体系均为 x ˏo反应温度为 vz ε o
酶切时间为 u «∀酶切产物在 t1x h的琼脂糖凝胶上电泳 o染色 o照像 o检测 ∀
t1z 聚类分析 对应每一个酶切图谱照片 o不同菌株间迁移率相同的带视为同一性状 ∀酶切片段以
…¬²2•¤§ ±∏¤±·¬·¼ ²±¨ 软件进行带型分析 o用 ˜°Š„方法构建聚类分析图 ∀
2 结果与分析
u1t Φρανκια的 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ µµ±区特异带的扩增 采用 ≤ׄ…法从 ut株供试 Φρανκια菌上均提取到
⁄‘„ ∀用引物 ƒŠ°≥|{|¤¦和 ƒŠ°tvu. 扩增 Φρανκια菌 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ µµ±区 otu株木麻黄 !w株杨梅和 t
株桤木等 tz株菌株获得一条稳定 !清晰的特异条带 o片段约 t syz ¥³左右 o见图 t ∀对杨梅 ƒµvt !
ƒµx| !uutx和福建胡颓子 ƒ∞²st等 |个菌株的 ⁄‘„进行了多次扩增 o但未能获得µµ±区域的扩增带 ∀
图 t 木麻黄 !杨梅 !桤木 Φρανκια ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ 间区序列扩增
ƒ¬ªqt „°³¯¬©¬¨§ Φρανκιαµµ± µ¨ª¬²± ²©ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ ©²µΧq¶³³qo Μq ρυβρα o Αqχρεµαστογψνε
u1u Φρανκια的 °≤•2• ƒ°分析 tz个菌株扩增特异片断经 w种内切酶酶切后结果见图 u ∀在 Νχι ´内
切酶的作用下 otz株 Φρανκια菌扩增产物获得 w条酶切片断 o分为 u种酶谱类型 ∀在这 u种酶谱类型中 o
v条小分子片断大小一致 o第 w条片断存在差异 ∀桤木菌株 ƒ„¦st和杨梅菌株 ƒµwv !ƒµuw !ƒµtv !
ƒµty的第 w条片断大小约 xts¥³o其余 tu株木麻黄菌株的第 w条酶切片断较小 o约为 uxs¥³∀ Ρσα´酶
切扩增产物后 otz株菌株均获得同样大小的 v条片断 o为同一种酶谱类型 ∀用 Μσπ ´和 Νδε µ酶切 o供
试菌株的扩增产物同样分成 u种酶谱类群 o木麻黄菌株共有一种酶切图谱 o杨梅和桤木菌株为另一种酶
切图谱 o这 u种内切酶作用后各个酶切片段均较小 ∀
|{t 专刊 t 李志真等 }Φρανκια菌遗传多样性的µ⁄‘„ ŒŠ≥ • ƒ°研究
图 v ƒµ±¤®¬¤ty≥ ∗ uv≥µ⁄‘„间区 °≤• 扩增产物酶切图谱分析聚类树状图
ƒ¬ªqv ׫¨ ¦¯∏¶·¨µ¬±ª²©·«¨ ³µ²§∏¦·¶²©ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ ¶³¤¦¨µ¬± Φρανκια ¥¼ °≤•
图 u Νχι ´ !Ρσα´ !Μσπ ´ !Νδε µ酶切 Φρανκια t syz ¥³特异片段图谱
ƒ¬ªqu ׫¨ ©¬±ª¨µ³µ¬±·¶ª¨ ±¨ µ¤·¨§¤©·¨µ Νχι ´ !Ρσα´ !Μσπ ´ !Νδε µ §¬ª¨¶·¬²± ²©¤°³¯¬©¬¨§
Φρανκια t syz ¥³¯¨ ±ª·«¶¨ ∏´¨±¦¨ ©µ²° ¶·µ¤¬±¶²© Χασυαρινα !Αλνυσ!Μψριχα
u1v 聚类分析 为了直
观反映菌株间的 ty≥ ∗
uv≥ µ⁄‘„ 基因的遗传关
系 o将参试菌株的 w种酶
切图谱以 ˜°Š„ 方法进
行聚类分析 o构建了相似
性树状图 o结果见图 v ∀
从图 v 可以看出 otz
株供试 Φρανκια菌可以分
为 u个类群 }木麻黄类群
和杨梅 p桤木类群 ∀来自
福建东部福鼎 !中部惠安
和南部东山和广州等不同
地点的细枝木麻黄 !短枝
木麻黄以及粗枝木麻黄的
tu株共生 Φρανκια菌亲缘
关系比较近 o同属于一个
类群 o来自武夷山和莱舟
的 w个杨梅菌株和来自莱
舟的桤木菌株在 {s h 的
相似性水平聚类为另一类
群 ∀各类群菌株之间存在
一定的差异 o如在木麻黄
类群中 o来自惠安的短枝
木麻黄菌株 ƒ≤ v¨z与来自
东山的 ƒ≤ u¨v 相似性极
高 o而 与 同 一 地 点 的
ƒ≤ z¨x 和 ƒ≤ z¨u 差异较
大 o来自东山的粗枝木麻
黄菌株 ƒ≤ªs{则与来自惠
安的短枝木麻黄 ƒ≤ z¨u相
似性高 ∀在杨梅 p桤木类
群中 o来自莱舟的杨梅菌
株 ƒµuw与同一地点的四
川桤木菌株 ƒ„¦st相似性
在 |u h以上 o而与同一地
点的杨梅 ƒµty相似性水
平只有 {s h o说明在同一
类 群 中 的 同 一 地 点
Φρανκια菌也有较大差异
性 ∀
u1w 根瘤内 Φρανκια 的
• ƒ°分析 对生长于福
s|t 林 业 科 学 v|卷
建的细枝木麻黄 !粗枝木麻黄 !山神木麻黄 !杨梅 !四川桤木和江南桤木根瘤进行了 ⁄‘„的提取 o均获得
⁄‘„提取物 ∀以引物 ƒŠ°≥|{|¤¦和 ƒŠ°tvu.进行 ty≥ ∗ uv≥的µµ±区域扩增 oy种放线菌结瘤植物均获
得一条大小为 t syz ¥³的扩增片段 ∀
图 w y种放线菌结瘤植物根瘤内生菌 t syz ¥³
扩增产物的 Νχι ´酶切图谱
ƒ¬ªqw ׫¨ ©¬±ª¨µ³µ¬±·¶ª¨ ±¨ µ¤·¨§¤©·¨µ Νχι ´ §¬ª¨¶·¬²± ²©¤°³¯¬©¬¨§ Φρανκια
t syz ¥³¯¨ ±ª·«¶¨ ∏´¨±¦¨ ©µ²° ±²§∏¯ ¶¨²©y ¶³¨¦¬¨¶²©¤¦·¬±²µ«¬½¤¯ ³¯¤±·¶
„ }四川桤木 Αqχρεµαστογψνε ~ Β }杨梅 Μqρυβρα ~ Χ}江南桤木 Αqτραβεχυp
λοσα~ ∆ }粗枝木麻黄 Χqγλαυχα ~ Ε }山神木麻黄 Χqχολλινα ~ Φ}细枝木麻
黄 Χqχυννινγηαµιανα
选择内切酶 Νχι ´进行酶切 o获得图 w 结
果 ∀细枝木麻黄 !粗枝木麻黄和山神木麻黄的
扩增带酶切后均获得 w条酶切片段 o片段大小
相同 ∀杨梅 !四川桤木和江南桤木获得 v条酶
切片段 o第 t !u条片段相同 o分别为 txu ¥³和
vw{ ¥³o在第 v条片段上存在着差异 o四川桤木
为 xwu ¥³o杨梅和江南桤木的为 zy| ¥³∀酶切谱
带聚类分析结果k图 xl表明 oy种放线菌结瘤植
物共生 Φρανκια可分成 u个类群 }v种木麻黄的
Φρανκια遗传相似性水平在 |s h以上 o聚为一个
类群 o杨梅和四川桤木 !江南桤木聚类为另一类
群 ∀在杨梅 p 桤木类群中 o四川桤木根瘤内
Φρανκια与杨梅 !江南桤木的根瘤内生菌亲缘关
系较远k相关系数约为 s1yw ∗ s1{zl o可再分成
两个亚群 o四川桤木为一个亚群 o杨梅和江南桤
木同属另一个亚群 ∀值得注意的是 o杨梅根瘤
与四川桤木根瘤采自同一地点 o其内生菌却差
异较大 o而与沼泽地生长的江南桤木的内生菌亲缘关系近得多 o这说明了在不同的生境中存在着亲缘关
系相近的 Φρανκια o同时在同一地点也存在着亲源关系远的 Φρανκια类群 ∀
图 x y种放线菌结瘤植物根瘤内生菌相似性树状图
ƒ¬ªqx °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨¤±¤¯¼¶¬¶²© Φρανκια©µ²° ±²§∏¯ ¶¨²©y ¶³¨¦¬¨¶²©¤¦·¬±²µ«¬½¤¯ ³¯¤±·¶
3 讨论
本研究在国内首次以 ty≥ ∗ uv≥ °≤•2• ƒ°方法对福建及广州的木麻黄 !杨梅 !桤木和福建胡颓子共
生 Φρανκια菌的遗传多样性进行了分析 ∀引物 ƒŠ°≥|{|¤¦和 ƒŠ°tvu. 可以扩增全部的供试木麻黄 !桤
木以及部分杨梅 Φρανκια菌株 ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„ µµ±区域 o但是无法扩增杨梅菌株 ƒµvt !ƒµx| !uutx和福
建胡颓子菌株 ƒ∞²st ∀该引物为 …²¶¦²等人设计 o用于扩增木麻黄和桤木接种类群 Φρανκια的µµ±区域 o
但不能扩增来自木麻黄根瘤上的无效菌株和非典型性菌株k•²∏√¬¨µετ αλqot||yl ∀本试验结果也说明了
t|t 专刊 t 李志真等 }Φρανκια菌遗传多样性的µ⁄‘„ ŒŠ≥ • ƒ°研究
它能有效地区分可木麻黄 Φρανκια类群 o同时还适合部分杨梅 Φρανκια菌株 o但对另一些杨梅菌株和胡
颓子菌株无效 o因此利用 ty≥ ∗ uv≥间区了解杨梅和胡颓子 Φρανκια类群菌株的遗传多态性 o尚需要进一
步设计和筛选引物 ∀
本试验酶切结果说明 Νχι ´ !Μσπ ´和 Νδε µ等 v种内切酶能较好地区别供试 tz株 Φρανκια菌的差
异性 o其中 Νχι ´酶切后木麻黄类群菌株和杨梅 !桤木类群菌株的酶切片段大小差异明显 o可以认为 Νχι
´是木麻黄 Φρανκια ty≥ ∗ uv≥扩增的判别性内切酶 o该结论与 •²∏√¬¨µ等kt||yl的试验结果一致 ∀ Ρσα´
酶切后 tz个菌株所形成的片段数及大小均相同 o说明该内切酶无法区别这些菌株的多态性 ∀
Φρανκια纯培养菌株的 °≤•2• ƒ°研究结果说明来自福建不同地区和广州的木麻黄共生 Φρανκια菌
同源性程度很高 o为同一种类群 o这与 ƒ µ¨±¤±§¨½等kt|{|l用 ⁄‘„相关性分析法 !‘¤½¤µ¨·等kt||tl用 ty≥
µ⁄‘„序列扩增 !•²∏√¬¨µ等kt|yyl用 °≤•2• ƒ°和彭源东等kt||{l用 • „°⁄研究方法的结果一致 o但
•²∏√¬¨µ等kt|yyl同时又指出 o实际上存在于细枝木麻黄 !短枝木麻黄根瘤内 Φρανκια菌的遗传多样性非
常高 o有 x种 °≤• p • ƒ°类群 ∀从福建省木麻黄根瘤 Φρανκια的 °≤•2• ƒ°分析结果看 o与福建不同种
木麻黄共生的 Φρανκια菌只有一个类群 o遗传多样性相对低 ∀
不少研究表明杨梅是最古老的放线菌结瘤植物 o与其共生的 Φρανκια有多个分支 o较为混乱 o一部
分内生菌与木麻黄 p桤木类群相似 o一部分则具有胡颓子类群的遗传特性k‹∏ª∏¨·ετ αλqousstl ∀本研
究经多次试验未能获得部分杨梅和胡颓子菌株的 °≤• 产物 o暗示这些菌株可能不同于木麻黄 Φρανκια
菌 ∀由于菌株 ƒ∞²st的宿主植物福建胡颓子生长在木麻黄林分内 o由此推论在木麻黄林地土壤中有不
同类群的 Φρανκια存在 o而宿主植物对与其共生的 Φρανκια菌具有选择性 ∀木麻黄菌株 ƒ≤¦„≤su和 ƒ≤¦„≤
sw是从四川桤木根瘤匀浆液接种细枝木麻黄所形成的根瘤上分离所得的 o°≤•2• ƒ°的研究表明它们
与四川桤木菌株 ƒ„¦st分属不同的 Φρανκια类群 o这暗示接种木麻黄的四川桤木内生菌或者接种根瘤土
壤上所附着的 Φρανκια与 ƒ„¦st菌不同 ∀从 Φρανκια纯培养和根瘤的 °≤•2• ƒ°结果也能充分表明 o存
在于福建省土壤中的 Φρανκια菌差异大 o至少有 u个类群 o遗传多样性是比较丰富的 ∀本研究结果同时
说明了 ty≥ ∗ uv≥µ⁄‘„ °≤•2• ƒ°方法作为一种分子指标 o能很好地区别 Φρανκια菌群的遗传多态性 ∀
参 考 文 献
冯瑞华 q用 „ƒ°技术和 ty≥ µ⁄‘„ °≤•2• ƒ°分析毛苜宿根瘤菌的遗传多样性 q微生物学报 ousss owskwl }vwt p vww
焦振泉 o刘秀美 q细菌分类与鉴定的新热点 }ty≥ ∗ uv≥ µ⁄‘„间区 q微生物学通报 ousst ou{ktl }{x p {|
刘 忠 o吴少慧 o周 斌等 q应用 „• ⁄• „技术研究 Φρανκια菌多样性 q微生物杂志 ousst outktl }us p uv
彭源东 o柯丹兵 o张忠泽 q Φρανκια基因型 ⁄‘„提取及其 °≤• 带型 q微生物学杂志 ot||z otzkvl }t p x
彭源东 o张忠泽 q Φρανκια菌的遗传多样性的 • „°⁄研究 q应用生态学报 ot||{ o|ktl }x| p yv
孙慧君 o丁 鉴 o吴 阳等 q不同寄主来源的 Φρανκια血清学关系 q微生物杂志 ot||t ottktl }{u
韦革宏 o朱铭莪 q分子生物学新方法在根瘤菌分类中的应用 q西北农业大学学报 ot||| ouzkul }{w p {|
吴少慧 o张惠文 o熊 智等 q„• ⁄• „对植物根瘤内生放线菌 Φρανκια多样性的研究 q应用生态学报 ousst otukyl }{{v p {{y
张道海 o苏凤岩 o丁 鉴等 q Φρανκια菌同功酶图谱分析和分类 q微生物杂志 ot|{| o|kvl }tx p ut
张道海 o苏凤岩 o丁 鉴等 q Φρανκια菌全细胞可溶性蛋白图谱分析及分类 q微生物杂志 ot||t ott }v{ p wu
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u|t 林 业 科 学 v|卷
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v|t 专刊 t 李志真等 }Φρανκια菌遗传多样性的µ⁄‘„ ŒŠ≥ • ƒ°研究