全 文 ：园艺学报，2016，43 (3)：564–570.
Acta Horticulturae Sinica
564 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0058；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2016–01–20；修回日期：2016–03–21
基金项目：‘十二五’国家科技计划项目（2012BAD02B02）；现代农业产业技术体系北京市果类蔬菜创新团队项目（BAIC01-2016）；
国家自然科学基金项目（31071806）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：SHL1606@cau.edu.cn）
辣椒 PAP3 和 PPI 蛋白相互作用的鉴定
马 宁，刘 辰，王茹芳，沈火林*
（中国农业大学园艺学院，设施蔬菜生长发育调控北京市重点实验室，北京 100193）
摘 要：PAP3（Gen Bank 登录号：HM104635）和 PPI（Gen Bank 登录号：GU812176）基因是控制
辣椒花器官发育的 B 类基因，共同控制花瓣和雄蕊的发育，均属于 MADS-box 家族基因。为验证 PAP3
蛋白和 PPI 蛋白的相互作用，利用酵母双杂交系统，构建 pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3 酵母表达载体，
转化相应酵母 AH109 感受态细胞后未出现自激活和毒性现象，融合的二倍体酵母（pGBKT7-PPI ×
pGADT7-PAP3）能在营养缺陷型培养基上生长；同时利用体外 GST-Pull down 技术，将诱导的 GST-PAP3
蛋白和 His-PPI 蛋白孵育，结果均表明，PAP3 蛋白和 PPI 蛋白之间存在特异性相互作用。
关键词：辣椒；PAP3；PPI；MADS-box 家族；酵母双杂交；体外 GST-Pull down
中图分类号：S 641.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）03-0564-07

The Identification of Interaction with PAP3 and PPI Protein in Pepper
MA Ning，LIU Chen，WANG Ru-fang，and SHEN Huo-lin*
（Department of Vegetable Science，College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing
100193，China）
Abstract：In MADS-box family，PAP3 and PPI gene jointly control the growth of petals and stamen.
Both of them are class B genes，which in charge of dominating floral organ development. In order to verify
PAP3 protein and PPI protein interaction furtherly，yeast two-hybrid system was used in this study，we
constructed yeast expression vectors pGBKT7-PPI and pGADT7-PAP3 transformed into corresponding
AH109 yeast cells，and made sure that they did not appear the self-activation and toxicity. The yeast zygote
diploids（pGBKT7-PPI × pGADT7-PAP3）exhibit on selective agar plates；Meanwhile，we used fusion
GST-PAP3 protein and His-PPI protein perform the vitro GST-Pull down technology in this study. The two
experimental results showed that specific interactions between PAP3 protein and PPI protein.
Key words：pepper；PAP3；PPI；MADS-box family；Y2H；GST-Pull down

MADS-box 基因的一个显著特点是通过形成复合体来调节高等植物的花器官发育。在四重奏模
型（4 个不同的 MADS-box 蛋白形成四聚体与顺式作用元件调控基因表达）中，MADS-box 家族成
员 SEP（SEPALLATA）类蛋白是形成四聚体蛋白复合体的桥梁（Honma & Goto，2001；Theissen，
2001）。Leseberg 等（2008）利用酵母双杂交系统研究了番茄的 MADS-box 蛋白互作网络，并与拟
南芥、金鱼草比较，表明同源蛋白之间表现出相似的互作模式，但不同物种之间也存在各自的特异

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性（Davies et al.，1996；de Folter et al.，2005；Leseberg et al.，2008）。另外，MADS-box 基因中的
MADS 结构域增强了蛋白之间相互作用的特异性。参与调控高等植物花器官发育的 MADS-box 基
因是近年来植物发育生物学研究的热点，至今已经在多种作物上克隆到 B 类基因（Vandenbussche et
al.，2004；Tsai et al.，2005）。经研究表明 B 类基因参与花瓣和雄蕊的形成，在丧失功能的突变体
中，萼片代替第 2 轮花瓣，第 3 轮雄蕊转变为心皮（Shindo et al.，2006；Preston & Hileman，2010）。
PAP3 基因和 PPI 基因均属于 MADS-box 基因家族中控制花器官发育的 B 类基因。
本研究中通过酵母双杂交，体外 GST-Pull down 技术来验证 PAP3 和 PPI 两个蛋白之间是否存在
互作关系，为研究园艺作物花器官发育及与雄性不育形成的分子机理提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以辣椒雄性不育恢复系 121C 为试验材料，2011 年春季在中国农业大学北京上庄实验站大棚内
常规种植。在开花期，取花瓣已开始变白的花蕾，剥取花药立即用液氮冷冻并在–70 ℃保存备用。
酵母双杂交载体：pGBKT7 DNA-BD Cloning Vector 和 pGADT7 AD Cloning Vector 由试剂盒提供
（Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System，Clontech）。GST pull-down 载体：pGEX-6p1 和 pET28a
为本实验室保存。
1.2 质粒构建
酵母双杂交质粒构建，通过对 PPI 和 PAP3 基因序列进行分析，用 Premier 5.0 软件设计了两对
引物（表 1）分别用于扩增辣椒 PPI 和 PAP3 基因的翻译区片段，根据酵母质粒载体 pGPBKT7 与
pGADT7 上的酶切位点，扩增 PPI 基因，引物上下游分别加入酶切位点 EcoRⅠ和 BamHⅠ，而扩增
PAP3 基因引物上下游分别加入酶切位点 EcoRⅠ和 ClaⅠ。PCR 产物经胶回收处理，分别对扩增 PPI
基因进行 EcoRⅠ和 BamHⅠ的双酶切，对扩增到的 PAP3 基因进行 EcoRⅠ和 ClaⅠ的双酶切，并克
隆至 pGBKT7 及 pGADT7 中，转化 E. coli DH5α。菌液 PCR 筛选阳性克隆并测序验证，获得序列
正确的载体质粒即为重组载体 pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3。

表 1 酵母双杂交所用引物
Table 1 Primers used for Y2H
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
产物大小/bp
Product size
J-PPI F：GGAATTCCATGGGGAGAGGGAAAAT R：CGGGATCCCGCTACATTCTTTCATG 666
J-PAP3 F：GGAATTCCATGGCTCGTGGGAAAAT R：CCATCGATGGTCAACCTAGACCAAA 699

GST pull-down 质粒构建，通过对 PAP3 和 PPI 基因序列进行分析，与酵母双杂交相同，均采用
翻译区作为插入目的片段，用 Premier 5.0 软件设计了两对引物（表 2）分别用于扩增 PAP3 和 PPI
基因的翻译区片段，根据 GST pull-down 所需质粒 pGEX-6p1 和 pET28a 的酶切位点，扩增 PPI 基因，
引物上下游分别加入酶切位点 BamHⅠ和 EcoRⅠ，而扩增 PAP3 基因引物上下游分别加入酶切位点
EcoRⅠ和 XhoⅠ。PCR 产物经胶回收处理，分别对扩增 PPI 基因进行 BamHⅠ和 EcoRⅠ的双酶切，
对扩增到的 PAP3 基因进行 EcoRⅠ和 XhoⅠ的双酶切。并克隆至 pGEX-6p1 和 pET28a 中，转化 E. coli
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DH5α中，菌液 PCR 筛选阳性克隆并测序验证，获得序列正确的载体质粒即为重组载体 pET28a-PPI
与 pGEX-6p1-PAP3。

表 2 GST pull-down 所用引物
Table 2 Primers used for GST pull-down
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
产物大小/bp
Product size
G-PPI F：CGGGATCCCGATGGGGAGAGGGAAA R：CGGAATTCCGCTACATTCTTTCATG 666
G-PAP3 F：CGGAATTCCGATGGCTCGTGGGAAA R：CCGCTCGAGCGGTCAACCTAGACCA 699

1.3 酵母双杂交
醋酸锂法制备酵母 AH109 感受态细胞。将酵母细胞在 YPDA 平板上划线培养（可存放 4 ℃冰
箱两个月）长出 2 mm 克隆后，挑取单克隆到 3 mL YPDA 液体培养基，30 ℃，2 500 r · min-1培养 8 h，
然后取 5 mL 上述培养基加入到 50 mL YPDA，再培养 16 ~ 20 h，达到 OD600 = 0.15 ~ 0.30，室温下 2
700 r · min-1 离心 5 min。弃上清，用 100 mL YPDA 重新悬浮，放置在 30 ℃，直至 OD600 = 0.4 ~ 0.5
（3 ~ 5 h），室温 2 700 r · min-1 离心 5 min。弃上清，平均分装两个离心管，各加 30 mL 去离子水重
悬细胞，2 700 r · min-1 离心 5 min，弃上清，每个离心管中用 1.5 mL，1.1× TE/LiAc 溶液重悬细胞，
每管 1.5 mL，13 000 r · min-1 离心 15 s。弃上清，用 600 μL 1.1× TE/LiAc 重悬细胞，为酵母感受态
细胞。每次用量 50 μL。加入 250 μL 高压灭菌的甘油，–80 ℃存放。
采用 PEGP-LiAC 法将诱饵质粒 pET28a-PPI 与 pGEX-6p1-PAP3 质粒共转化 AH109。将新鲜制
备的 AH109 感受态细胞 100 μL，PEG3350 240 μL，LiAC 36.0 μL，鲑鱼精单链 DNA 50.0 μL，
pET28a-PPI 与 pGEX-6p1-PAP3 各 17 μL。将酵母细胞与上述反应组分混匀，先在 42 ℃条件下孵育
30 min，然后再 30 ℃条件下温育 30 min。孵育结束后，1 300 r · min-1 离心 30 s，将酵母沉淀用 500
mL 无菌水重悬，平铺于固体双缺培基（SD-Leu-Trp）上，于 30 ℃培养 3 ~ 4 d。挑取单克隆并接种
于 5 mL 液体双缺培养基中，30 ℃，220 r · min-1 培养至 OD600 = 1.0。3 000 r · min-1 离心 5 min 收集
酵母菌体，并使用无菌水清洗两次。加入 1 mL 无菌水重悬酵母沉淀。使用分光光度计测定 OD600
值，并根据具体浓度将其稀释到 OD600 = 1.0。将酵母菌液按 10-1、10-2 和 10-3 浓度梯度进行稀释，并
将不同浓度的酵母菌液滴在双缺（SD-Leu-Trp）及三缺（SD-Leu-Trp-His）酵母培养基上，30 ℃生
长 4 ~ 5 d。根据酵母生长情况判断蛋白之间的相互作用。
1.4 GST pull-down
使用 Glutathione Sepharose 4B（Amersham）的 GST 标签亲和凝胶，参照使用说明中的变性提
取方法：将每升菌体重悬在 20 ~ 30 mL PBS 缓冲液中，加入终浓度 1 mmol · L-1 的 PMSF，于冰上超
声破碎 3 ~ 6 次，每次 1 min 并设置 3 s 间隔。每次超声完暂停至少 2 min，从而使裂解液保持低温。
将裂解液在 Beckman 高速离心机上以 17 000 r · min-1 离心 20 min，留上清。上清中以每升菌加入 200
μL 的比例加入预先用 PBS 平衡过的 Gluathione Sepharose 4B 亲和珠子，4 ℃冷室摇床上孵育结合
2 ~ 3 h。使用 50 倍体系（10 mL）冰上预冷的 PBS 清洗 Gluathione Sepharose 4B 亲和珠子 3 次。将
珠子移到 2 mL 进口小管中，使用还原型谷胱甘肽在 4 ℃摇床上洗脱过夜，将 GST-PAP3 蛋白从亲
和珠洗脱下来，反应溶液为加入 1 mmol · L-1 DTT 的 PBS（pH 7.3）。离心取上清中的蛋白，Bradford
法测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳检测。回收树脂亲和珠。使用过量的谷胱甘肽洗脱液室温充分洗脱
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图 1 PPI 和 PAP3 基因片段扩增电泳结果
Fig. 1 PPI and PAP3 gene fragments amplified for Y2H
图 2 载体检测电泳图
Fig. 2 Pattern of vector check
树脂亲和珠，再用 PBS 重新平衡，加入终浓度 0.1%的叠氮钠在 4 ℃冰箱保存。
使用 Ni-NTA agarose（Qiagen，Germen），参照使用说明中的非变性条件提取蛋白。裂解缓冲液
中 Imidazole 的浓度提高为 20 mmol · L-1，清洗缓冲液 Imidazole 的浓度提高为 40 mmol · L-1。具体
方法如下：将每升菌体重悬在 20 ~ 30 mL 裂解缓冲液中，加入终浓度 1 mmol · L-1 的 PMSF。于冰上
超声破碎 3 次，将裂解液 17 000 r · min-1 离心 30 min，保留上清。上清中以每升菌加入 100 ~ 200 μL
的比例加入预先用裂解缓冲液平衡过的 Ni-NTA agarose，4 ℃冷室摇床上结合 1 h 左右。使用 50 倍
体系（10 mL）冰上预冷的清洗缓冲液清洗 3 次。使用 1 mL 洗脱缓冲液冰上洗脱 15 ~ 30 min，充分
颠倒混匀。离心取上清中的蛋白，Bradford 法测蛋白浓度，SDS-PAGE 电泳检测。回收树脂亲和珠。
使用过量洗脱缓冲液室温充分洗脱树脂亲和珠，再用裂解缓冲液重新平衡，加入终浓度 0.1%的叠氮
钠在 4 ℃冰箱保存。
取 1 mg GST-PAP3 融合蛋白与 GST 标签蛋白，在 4 ℃条件下分别与 5 mg His-PPI 融合蛋白在
100 μL 结合缓冲液中孵育 1 h。向反应混合物中加入 20 μL 的比例加入预先用 PBS 平衡过的
Gluathione Sepharose 4B 亲和珠子，4 ℃冷室摇床上孵育结合 1 h。结合完毕后，用使用 50 倍体系（1
mL）冰上预冷的 PBS 清洗 Gluathione Sepharose 4B 亲和珠子 3 次。将亲和珠子用 100 μL SDS 上样
缓冲液重悬，并在 95 ℃处理 10 min 左右。取 20 μL 处理好的样品用于 10% SDS-PAGE。分别将
SDS-PAGE 胶用于考马斯亮蓝染色（CBB），并用 anti-His 抗体进行免疫印迹检测（western blot，
WB）。
2 结果与分析
2.1 PAP3 和 PPI 基因片段克隆
以辣椒花药总 RNA 为模板反转录出的 cDNA，通过 PCR 扩增，得到目的基因片段 PPI 的翻译
区为 666 bp，包含两个酶切位点；PAP3 基因的翻译区为 699 bp，包含两个酶切位点。对扩增结果进
行电泳（图 1）及测序分析，得到的 PAP3 和 PPI 基因片段大小与预期的相同，结合序列分析结果，
确定扩增得到了目的基因的片段。
2.2 酵母双杂交质粒 pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3 质粒构建结果
用特异引物对含重组质粒 pGBKT7-PPI 与 pGADT7-PAP3 菌液进行 PCR 扩增，结果分别扩增出
大小约 666 bp 和 699 bp 的片段（图 2），与预期结果一致。结合序列分析结果，确定扩增得到了目


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图 4 GST-pull down 基因片段扩增电泳结果
Fig. 4 Fragments amplified for GST-pull down
的基因的片段。以上结果表明：酵母双杂交 pGADT7-PAP3 和 pGBKT7-PPI 载体构建成功，可以用
于酵母双杂交试验的进行。
2.3 酵母感受态细胞 AH109 转化子的自激活和毒性检测
转化 pGBKT7-PPI 的酵母 AH109 细胞和转化 pGADT7-PAP3 的酵母 AH109 细胞分别涂布在
SD\-His\-Trp 和 SD\-Ade\-Leu 平板上，结果不能生长，His、Trp、Ade、Leu 是酵母体内含有的特殊
报告基因，排除了 pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3 具有自激活宿主菌的作用，说明构建的
pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3 能够适用于酵母双杂交系统进行蛋白相互作用的验证。
挑取重组成功的较大的转化子 pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3 分别接种于 50 mL SD\-Trp\-Kan
和 SD\-Leu\-Amp 培养基中，30 ℃，220 r · min-1 转振荡培养 16 ~ 20 h，测定培养液 OD600，并与分
别转化空载体 pGBKT7（BD）和 pGADT7（AD）的对照菌液比较，结果 OD600 大于 0.8，且与对照
无明显差异，表明 pGBKT7-PPI 和 pGADT7-PAP3 对酵母菌株 AH109 无毒性作用。
2.4 酵母双杂交验证 PAP3 和 PPI 蛋白的相互作用
从酵母克隆在双缺（SD-Leu-Trp）及三缺培养基（SD-Leu-Trp-His）的生长情况（图 3）发现，
辣椒 PAP3 和 PPI 蛋白在酵母系统中能够相互作用。同时 PAP3 蛋白和 pGADT7 空载体以及 PPI 蛋
白和 pGPBKT7 空载体的组合均不能在三缺培养基上生长，这表明，PAP3 和 PPI 蛋白之间的相互作
用是特异的。PAP3 和 PPI 蛋白在酵母细胞内结合，使 GAL-AD 和 GAL-BD 蛋白在空间上靠近，His
报告基因被激活表达，酵母菌能在 His 的营养缺陷型培养基上生长。


图 3 双杂交酵母菌在缺陷培养基上的表型鉴定
Fig. 3 Growth of co-transformed yeast on selective media

2.5 GST pull-down 中 PAP3 和 PPI 基因片段
克隆与序列分析
以辣椒花药总 RNA 为模板反转录出的
cDNA，通过 PCR 扩增到目的基因片段 PPI 的
翻译区为 666 bp，包含两个酶切位点；通过 PCR
扩增到目的基因片段 PAP3 基因的翻译区为
699 bp，包含两个酶切位点。对扩增结果进行
电泳（图 4）及测序分析，得到的 PAP3 和 PPI
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图 5 载体检测电泳图
Fig. 5 Pattern of vector check
图 6 GST-pull down 结果
Fig. 6 The result of GST-pull down
基因片段大小与预期的相同，结合序列分析结果，确定扩增得到了目的基因的片段。
2.6 GST pull-down 试验 pET28a-PPI 和 pGEX-6p1-PAP3 质粒构建结果
用特异引物对重组质粒 pET28a-PPI 与
pGEX-6p1-PAP3 进行菌液 PCR 的扩增，结果
能分别扩增出大小约 666 bp 和 699 bp 的片段，
与预期结果一致（图 5）。结合序列分析结果，
确定扩增得到了目的基因的片段。
以上结果表明：pull-down 试验所需质粒
pET28a-PPI与 pGEX-6p1-PAP3载体构建成功，
可以进行 GST-pull down 试验。
2.7 GST pull-down 试验验证 PAP3 和 PPI 蛋
白的相互作用
如图 6 所示，通过考马斯亮蓝染色（CBB）
与免疫印迹检测（WB）试验，发现辣椒蛋白
GST-PAP3 能够在体外与 His-PPI 相互作用，而
作为负对照的 GST 标签蛋白则不能与 His-PPI
相互作用。
以上结果表明，辣椒蛋白 PPI 和 PAP3 的
相互作用是特异的。
3 讨论
Shin 等（2010）运用体外的 pull down 和酵母双杂交方法证明了 PIRF1（光敏色素相互作用的
ROP 鸟苷酸交换因子）通过一种光敏色素依赖的方式与 ROPs 相互作用，提示光敏色素与 ROP 信号
转导是通过 PIRF1 进行互相联系的，共同调节拟南芥根的生长和发育。酵母双杂交技术是研究蛋白
与蛋白之间相互作用十分经典的方法。酵母双杂交技术相对别的研究蛋白质技术来说，操作简单，
不需要提纯蛋白，消除了在提纯过程中蛋白质的变性，因此被广泛应用于蛋白质之间相互作用的研
究。但是该技术出现假阳性的现象较多，需要其他技术予以佐证。因此，本试验中进一步采用了 GST
pull-down 的方法接着在体外对两者之间的相互作用进行鉴定。通过分别将 PAP3 蛋白与 PPI 蛋白用
标签蛋白树脂洗脱纯化出来，在体外研究 PAP3 蛋白与 PPI 蛋白的相互关系，得出的结论与酵母双
杂交方法一致。因此将 GST pull-down 和酵母双杂交技术联用既排除假阳性，又保留了试验的灵敏
度，从而最大程度保障研究结果的可信度。拟南芥中，AP3 和 PI 蛋白的互作区域被标记在 MADS-box
的保守 K 区域（Yang et al.，2003）。在番茄中，PI 同源基因 TPI 所编码的蛋白质与 AP3 同源基因
TAP3 所编码的蛋白质通过酵母双杂交技术验证，两蛋白相互作用（De Martino et al.，2006）。最新
研究结果表明，在加州罂粟中，AP3-like 和 PI-like 蛋白的互作区域被标记在 MADS-box 的 C 末端
（Lange et al.，2013），所以在辣椒中研究 AP3 和 PI 蛋白的互作区域，可以作为下一步研究两基因
功能的思路。
通过酵母双杂交及 GST pull-down 方法，对辣椒花发育 PAP3 蛋白与 PPI 蛋白之间的相互作用做
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了研究，不仅加深了蛋白质之间相互作用方法的认识，而且通过 VIGS 的研究及了解到 PAP3 与 PPI
两种蛋白之间的协同表达及可以通过基因调控手段影响花器官雄蕊的发育，实现对辣椒育性的调控。
但是两者协同表达具体的作用机制以及如何调控育性控制的问题有待更深入一步的研究。

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