全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（3）：456–468 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–09–10；修回日期：2014–01–15
基金项目：国家自然科学基金项目（31000538）；北京市优秀人才培养资助培养计划项目（2012D002020000006）；北京市农林科学院科
技创新能力建设专项（KJCX201101010-19）；国家‘863’计划项目（2012AA100202-3）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangguixiang@nercv.org）
花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析
吕 晶 1,2，刘 凡 2，宗 梅 2，韩 硕 2，王幼平 1，王桂香 2,*
（1 扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2 北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业部华北地区园艺作物
生物学与种质创新重点实验室，北京 100097）
摘 要：以花椰菜—黑芥体细胞杂种自交及回交后代为材料，结合形态学特征，分子标记和荧光原
位杂交（FISH）等群体分析技术，在 16 份高代回交及自交材料中筛选获得了花椰菜类型渐渗系材料 12
份，偏花椰菜类型异附加系材料 4 份。形态学调查及 FISH 分析表明：12 份渐渗系材料除茎、叶等营养器
官特征与花椰菜近似外，已具有较正常的花球形成，染色体数为 18 条，均来源于花椰菜；植株花粉母细
胞减数分裂行为基本正常。SSR 和 AFLP 分子标记检测表明，渐渗系材料除扩增到数量不等的黑芥多态
性位点外，还扩增到埃塞俄比亚芥特异的多态性位点和少量新位点，另外发现渐渗系材料有丢失亲本花
椰菜多态性位点的现象。FISH 分析 4 份异附加系材料的染色体组成，结果显示：PFCN29BC2S1-4 为 9 条
花椰菜染色体附加 8 条黑芥染色体；PFCN15-2S1BC5-6-2 和 PFCN29BC4-37-7 为 16 条花椰菜染色体分别
附加 7 条和 14 条黑芥染色体；PFCN29BC4-38-5 为花椰菜染色体附加了 5 ~ 7 条黑芥染色体。
关键词：花椰菜；黑芥；渐渗系；SSR；AFLP；FISH
中图分类号：S 635.3 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）03-0456-13

Identification and Characterization of Introgression and Additional Lines
Between Cauliflower and Black Mustard
Lü Jing1,2，LIU Fan2，ZONG Mei2，HAN Shuo2，WANG You-ping1，and WANG Gui-xiang2,*
（1Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2Beijing Vegetable Research Center，Key Laboratory of Biology and
Genetic Improvement of Horticultural Crops（North China），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China）
Abstract：In this research，we analyzed the asymmetrical somatic hybrids of cauliflower（Brassica
oleracea var. botrytis，CC，2n = 18）and black mustard（B. nigra，BB，2n = 16）and their selfed or
backcrossed progenies by integrating morphological，cytological and molecular information．Among 16
advanced selfing and backcrossing descendants in analysis，12 introgression lines displaying the
cauliflower-like morphology were identified with chromosome number 18. Simple sequence repeat（SSR）
and amplified fragment length polymorphism（AFLP）analysis showed that those introgression lines
preserved some DNA banding patterns from B. nigra，B. carinata（BBCC，2n = 34）and some of new
bands，and all of these introgression lines showed an absence of some cauliflower-specific sites. 4 plants
（PFCN29BC2S1-4，PFCN15-2S1BC5-6-2，PFCN29BC4-37-7 and PFCN29BC4-38-5）were confirmed to
have 9，16，16 and 18 cauliflower chromosomes added with 8，7，14 and 5–7 B. nigra-derived

3 期 吕 晶等：花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析 457

chromosomes respectively by fluorescence in situ hybridization（FISH）.
Key words：cauliflower；Brassica nigra；introgression lines；SSR；AFLP；FISH

花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis，2n = 18，CC）属十字花科芸薹属甘蓝种。由于长期的
人工定向选择育种，导致目前花椰菜育种材料血缘基础狭窄，遗传多样性降低，目的基因，特别是
针对生物及非生物逆境的目的基因匮乏。黑芥（Brassica nigra，2n = 16，BB）为芸薹属 3 个基本种
之一，作为野生或半野生种在自然生长、生态适应和生存竞争中保留或获得了许多栽培种不具有的
优异基因，成为改善芸薹属栽培种育种材料遗传多样性的基因资源库。研究表明，黒芥中存在对十
字花科作物常见病害黑腐病、根肿病和黑胫病的抗性（Taylor et al.，2002；Tonguç et al.，2003；Saal
& Struss，2005）。有性杂交的不亲和性限制了黑芥野生基因资源的利用，而体细胞杂交可以实现种
间基因组的聚合，并在后代的自交回交过程中实现遗传物质的渐渗，达到野生种基因资源转移和利
用的目的（Wang et al.，2003；Xia，2009）。
种间杂种可以形成异附加系、代换系、易位系等，其中不含完整供体染色体的渐渗系材料通常
具有育性较好，野生性状少的特点，是进入育种应用的优选材料。渐渗系在小麦（Zhong et al.，2002）、
棉花（庞朝友 等，2006）、番茄（余文贵 等，2006）、油菜（Leflon et al.，2007）等作物的种质创
新中起到了重要作用。而芸薹属作物染色体较小，细胞学分析困难，且黒芥基因组信息相对较少，
需要建立一个有效的染色体及分子分析技术来快速准确鉴定芸薹属种间杂种材料的遗传背景。
现代遗传学分析手段揭示：芸薹属的 3 个基本种，白菜（AA，2n = 20）、甘蓝（CC，2n = 18）、
黒芥（BB，2n = 16）在起源上具有共同的祖先，其基因组存在大部分同源性（Schranz et al.，2007）。
A、C 基因组的亲缘关系较 A、B 和 B、C 之间近很多，但 A、C 基因组的大量序列信息和成熟的分
子标记可以部分应用于 B 基因组（Lagercrantz & Lydiate，1996；Lagercrantz，1998；Westman &
Kresovich，1999）。在细胞遗传学分析上，通过基因组原位杂交就可以将 B 基因组染色体与 A、C
基因组区分（Maluszynska & Hasterok，2005；Warwick & Sauder，2005）。随着研究进展，Lim 等（2005，
2007）通过荧光原位杂交鉴定了在 A、C 基因组染色体着丝粒上特异的 176 bp CentBr 串联重复序列，
而在黑芥染色体上没有检测到该序列的杂交信号。因此，CentBr 可以作为优异的细胞学标记，用于
区分染色体来源。
本实验室采用非对称体细胞杂交手段，获得了为数众多的花椰菜与多抗性黑芥的体细胞杂种（张
丽 等，2008），并且通过连续自交及回交，获得了高代自交或回交后代，从中鉴定出了多量的异附
加系材料（唐宇 等，2010；王桂香 等，2011）。在前期工作基础上，本研究中选择植物学形态类似
花椰菜的材料，利用 268 对引物对这些材料进行分子标记分析，结合以 CentBr 及黑芥基因组为探针
的双色 FISH 技术，进一步对杂种后代的染色体和基因组结构进行了分析，鉴定获得 12 份渐渗系和
4 份附加系材料。这些材料将为十字花科蔬菜育种提供新的种质资源。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为花椰菜品种‘Korso’（Brassica oleracea var. botrytis，CC，2n = 18）与黑芥多抗性
种质‘St.461’（B. nigra，BB，2n = 16）及其体细胞杂种后代。所有材料在 2012 年 9 月中同期播种，
在完成苗期人工接种抗病性鉴定后，选择抗性较好的单株，于 12 月初定植在北京市农林科学院蔬菜
研究中心日光温室中，常规管理。以花椰菜（非对称体细胞杂交中的受体）为轮回亲本，杂种套袋
蕾期授粉。各代杂种的获得及鉴定参考张丽等（2008）；唐宇等（2010）；王桂香等（2011）的报道。
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以 16 份整体形态偏向花椰菜类型的杂种单株为试材，另外增加 A 基因组的白菜‘Asko’（B. rapa，
AA，2n = 20）和自然加倍的四倍体材料埃塞俄比亚芥（B. carinata，BBCC，2n = 34）作为对比试
验材料，进行分子标记及染色体组成分析。体细胞杂种后代的编号为 PFCN，代表花椰菜（C）与黒
芥（N）的体细胞融合后代材料，后接数字为体细胞杂种当代独立再生株编号，后接的‘S’代表自
交处理，‘BC’代表回交处理，字母右下方的小字符代表世代数，后接的数字为植株编号。
1.2 方法
形态学性状调查：2013 年 2 月—4 月末，同期调查体细胞杂种后代与花椰菜及黒芥双亲植株的
叶形、叶色、叶片质地、株高、花球形态、花器官特征等性状。
SSR 分子标记分析：以幼嫩叶片为样品组织，CTAB 法提取两亲本、‘Asko’白菜、埃塞俄比亚
芥以及 16 个杂种后代的基因组 DNA。所用标记分为 4 类：（1）从已公布的芸薹属数据库 http：//
brassicadb.org 上每条染色体选择分布于整条染色体的 10 对引物，共获得大白菜 100 对 SSR 引物。
（2）从 Kim 等（2009）构建的白菜遗传图谱的每个连锁群上选择两个分子标记，共 20 个 SSR 分
子标记。（3）在 Lowe 等（2002，2004）开发的芸薹属植物 SSR 引物中，选择 14 个来自黑芥的标
记。（4）从 Panjabi 等（2008）构建的芥菜内含子多态性标记（IP markers）连锁图上选择 14 个 B
基因组分子标记。首先是进行 SSR 引物对花椰菜、黑芥双亲进行基因组扩增多态性筛选，然后选出
在双亲中表现稳定、清晰并且有多态性的引物对 16 份杂种后代进行分析。PCR 扩增产物由 6%聚丙
烯酰胺凝胶电泳检测。
AFLP 分子标记分析：DNA 接头和 AFLP 引物的核苷酸序列引用自刘晓明（2008），引物两两
组合，共 120 个引物组合。试验按照 Vos 等（1995）的操作方法（稍作修改）进行。样品 DNA 浓
度为 50 ng · μL-1，限制性内切酶 MseⅠ和 EcoRⅠ进行酶切，其连接接头连接，然后用接头配套引物
通过 PCR 对连接产物进行预扩增，最后不同引物组合对预扩增产物进行选择扩增。6%聚丙烯酰胺
凝胶电泳检测扩增产物，记录各样品 80 ~ 800 bp 的条带。条带清晰记“1”，不清晰和无条带记“0”。
FISH 分析：上午 9：00—10：00 时将两亲本和杂种小于 3 mm 长的花蕾取下，卡诺固定液（无
水乙醇∶冰醋酸 = 3∶1）固定 24 h，70%酒精储存备用。2%纤维素酶和 1%果胶酶酶解花药，镜检，
选择染色体数清晰、背景干净的片子–20 ℃保存，用于双色 FISH 杂交。着丝粒串联重复序列
（CentBrs；NCBI 登记号：CW978699 和 CW978837）通过克隆连接到 pGEM-T 载体上（Promega，
Madison，WI，USA），并用 Biotin-11-dUTP（Roche，Indianapolis，IN）标记作为探针，生物素标
记的探针在荧光显微镜下显绿色；黑芥基因组 DNA 用 Dig-11-dUTP（Roche，Indianapolis，IN）标
记，地高辛标记的探针在荧光显微镜下显红色，按照 Kato 等（2004）的方法并参照 Lame 和 Birchler
（2006）的报道稍做修改进行 FISH 鉴定。制作好的片子在 Nikon 显微镜进行荧光观察和照相，利
用 Adobe Photoshop v6.0 软件进行图像的合成及亮度和对比度的调节。
2 结果与分析
2.1 所选花椰菜—黑芥杂种后代材料的形态学性状
在叶形上，花椰菜叶片为长卵形，叶缘有浅锯齿，无叶耳，呈浅蓝绿色，表面有蜡粉，叶面光
滑无毛；黑芥叶片近似三角形，有叶裂，具叶耳，呈绿色，表面无蜡粉，叶面被毛。在花器官形态
上，花椰菜的花呈淡黄色，花瓣大且前缘有明显褶皱；黑芥的花为黄色，花瓣短小平滑。盛花期，
花椰菜的花冠直径（2.1 ± 0.2 cm）约为黑芥花冠直径（0.7 ± 0.1 cm）的 3 倍。在植株整体形态上，
花椰菜成株期植株较矮（20 cm），叶呈莲座状，茎节少且节间短，无分支，先形成紧实花球、白色，
3 期 吕 晶等：花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析 459

再抽薹开花（图 1，A）；黑芥成株期植株较高，达到 200 cm，茎节多且节间长、分支多，花序不抱
球，直接抽薹开花（图 1，B）。本研究中选取的 16 份试验材料整体形态偏向花椰菜类型，不同单
株在叶片颜色，叶耳有无，花球有无、花球大小和颜色上有一定差异。图 1 展示了其中部分材料的
花球和叶片特征。PFCN15-2S1BC5-15-1 的叶形似花椰菜，叶片蜡质更多一些，能形成基本正常的白
色花球，花球紧实度降低；PFCN14-1S1BC5 的叶色、叶形似花椰菜，能形成松散的花球，且淡黄色
花球上局部有浅紫色；PFCN29BC4-32-3 的叶形近似花椰菜，但可以看到明显的叶耳，能形成较致
密的白色较小花球；PFCN29BC4-37-7 的叶形、叶色都近似花椰菜，花蕾聚集为一簇，但没有形成明
显的花球。

图 1 杂种的花球形态比较
A：花椰菜；B：黑芥；15-2S1BC5-15-1、14-1S1BC5、29BC4-32-3、29BC4-37-7：不同体细胞杂种后代。
Fig. 1 The morphology of flower head in the hybrid progenies
A：Cauliflower；B：Black mustard；15-2S1BC5-15-1，14-1S1BC5，29BC4-32-3，29BC4-37-7：Hybrid progenies.

2.2 杂种后代的分子标记分析
2.2.1 SSR 分子标记分析
从 148 对引物筛选出 65 对引物，在黑芥与花椰菜基因组中表现出稳定清晰的扩增多态性（表 1）。
65 对引物在双亲基因组中共获得 298 条带，165 个多态性条带，平均每对引物产生 2.5 个多态性条
带。以这些引物对 16 份材料基因组 DNA 进行扩增，总结多态性位点，结果显示：（1）虽然 16 份
材料都含有丰富的花椰菜 CC 基因组特异扩增位点，但都存在某些 CC 基因组特异扩增位点的丢失，
如 At4g36960 引物在杂种 14 号材料中没有扩增到亲本花椰菜相应的特异位点（图 2）；（2）其中
15 份材料都扩增到黑芥多态性位点，从 1 ~ 28 个不等，如图 2 中杂种 4、5、11 扩增到黑芥的该位
点特异条带，表明这些材料中有黒芥遗传信息的保留和渗入；（3）所有杂种后代都扩增出了
3 ~ 20 个不等的埃塞俄比亚芥 BBCC 基因组的特异多态性位点，推测人工合成的体细胞杂种与自然
进化形成的 BBCC 物种在基因组进化早期经历一些相似的基因重组事件；（4）在一些材料中，还
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扩增出了 1 ~ 8 个杂种特异的新位点，如图 2 中杂种 9、10、16 在该位点扩增到新条带，表明了杂
种的特质性。

表 1 多态性标记及其扩增结果
Table 1 Polymorphic markers and amplification results
扩增条带数 Number of amplification bands 标记名称
Markers
来源连锁群
Linkage groups 白菜 B. rapa 黑芥 B. nigra 花椰菜 B. oleracea 埃塞俄比亚芥 B. carinata
BrID10277 A1 1 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10985 A1 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10307 A1 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
ENA28(R1) A1 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrFLC2(R2) A2 1 1 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10595 A2 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10199 A2 1 多条 Multi- bands 1 1
BrID10205 A2 1 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10207 A2 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10759 A2 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID101197 A2 1 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID90283 A3 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID90039 A3 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID90430 A3 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10041 A3 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10703 A3 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID101081 A3 多条 Multi- bands 1 多条 Multi-bands 多条 Multi- bands
BrID10881 A4 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10987 A4 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID90277 A4 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10689 A4 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID90143 A4 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10723 A4 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands
BrID10779 A4 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
8C0522 A4 1 1 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10857 A5 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID90333 A5 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID101183 A5 1 0 1 1
BrID101063 A5 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10383 A5 1 0 1 1
BrID10971 A5 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 1 多条 Multi- bands
BrID90105 A6 多条 Multi- bands 1 0 1
BrID101157 A6 多条 Multi- bands 1 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID101161 A6 多条 Multi- bands 0 1 多条 Multi- bands
BrID10381 A6 多条 Multi- bands 0 1 多条 Multi- bands
BrID90311 A6 1 0 多条 Multi- bands 1
BrID10869 A7 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10497 A7 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10493 A7 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10101 A7 1 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10103 A7 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10275 A8 1 0 1 1
BrID10933 A8 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID101199 A8 多条 Multi- bands 0 1 1
BrID10727 A8 1 0 1 多条 Multi- bands
BrID10173 A9 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 1 多条 Multi- bands
BrID10955 A9 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
BrID10227 A10 多条 Multi- bands 1 0 多条 Multi- bands
BrID10223 A10 多条 Multi- bands 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
cnu-m371a A3 1 0 1 1
nia-m014a A5 1 0 1 多条 Multi- bands

3 期 吕 晶等：花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析 461

续表 1
扩增条带数 Number of amplification bands 标记名称
Markers
来源连锁群
Linkage groups 白菜 B. rapa 黑芥 B. nigra 花椰菜 B. oleracea 埃塞俄比亚芥 B. carinata
cnu-m472a A5 0 0 1 1
nia-m037a A6 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 1
nia-m063a A7 1 1 1 多条 Multi- bands
cnu-m052a A7 1 0 1 1
Ni4-B10 N11 0 1 1 1
Ni4-C11 N15 0 1 0 1
Ni2-H06 未知 Unknown 0 1 0 1
At1g58220 B1，G7，A1 1 0 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
At1g03180 B7，G3，A8 1 1 1 1
At1g68310 B2，G5，A2，A7 1 1 1 1
At2g38130 B4，G6 多条 Multi- bands 1 1 多条 Multi- bands
At3g55005a B3，G8，A7，B4 1 1 1 多条 Multi- bands
At3g51260 B8，G2，A9 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands 多条 Multi- bands
At4g36960 B2，G5，A3 1 1 1 1
注：连锁群 A：白菜；G：黑芥；B：芥菜（AABB）中的 B 基因组；N：甘蓝型油菜（AACC）。名称 cnu 和 nia，A 基因组来源 SSR
标记；Ni，B 基因组来源的 SSR 标记；At，B. juncea（AABB）来源内含子多态性标记。
Notes：Linkage groups A：B. rapa；G：B. nigra；B：B-genome in B. juncea；N：B.napus. Name cnu & nia：A-genome SSR markers；N：
B-genome SSR markers；At：Intron polymorphism（IP）markers from B. juncea.


图 2 At4g36960 引物扩增结果
C：花椰菜；B：黑芥；1 ~ 16：杂种后代；M：DNA 分子量标记。
Fig. 2 The amplification result of At4g36960
C：Cauliflower；B：Black mustard；1–16：Hybrid progenies；M：DNA molecular marker.

2.2.2 AFLP分子标记分析
根据 SSR 分析结果，对扩增到黑芥特异多态性位点小于 3 个的 10 份材料进一步进行 AFLP 分
子标记分析。筛选出 77 对组合，在黑芥与花椰菜基因组中表现出稳定、清晰的扩增多态性。77 对
引物组合在双亲基因组中共获得 1 317 个多态性位点，平均每组引物产生 5.8 个多态性条带。总结
多态性位点结果显示：（1）10 份材料都含有丰富的花椰菜 CC 基因组特异多态性位点，但这 10 份
材料都存在某些酶切引物组合 CC 基因组的特异扩增位点丢失的情况；（2）10 份材料都扩增到黑芥
多态性位点，表明杂种包含黑芥遗传信息。值得注意的是，材料 PFCN15-2 S1BC5-15-3 虽然在 65 对
SSR 引物的分析中没有检测到黒芥遗传信息，但在 77 对引物的 AFLP 分析中，检测到了 25 个黒芥
特异多态性位点，表明该材料基因组中仍然有黒芥基因的渗入，是一渐渗系；（3）所有杂种都扩增
到埃塞俄比亚芥（BBCC）特异的多态性位点；（4）所有杂种都扩增到 6 个新条带。AFLP 分子标记
分析结果与 SSR 分子标记结果相吻合，进一步证明了杂种后代基因组中存在受体花椰菜基因组部份
丢失，野生种黒芥基因的渐渗，以及由 DNA 的重组交换等导致的新位点形成，并且也为人工合成
杂种与自然进化形成杂种会在早期发生类似基因组变化提供了进一步证据。
图 3 是引物 E45-M57 的扩增结果，该引物在 10 份材料中都扩增到花椰菜特异位点，4、9、10
号材料扩增到黑芥的特异位点。
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图 3 引物 E45-M57 对双亲及杂种后代基因组 DNA 的 AFLP 扩增图
A：花椰菜；B：黑芥；1 ~ 10：杂种后代；→：花椰菜特征带；↑：黑芥特征带。
Fig. 3 AFLP fingerprint with primer pair E45–M57 of the parents and somatic hybrids
A：Cauliflower；B：Black mustard；1–10：progenies of somatic hybrids；
→：Specific bands of cauliflower；↑：Specific bands of black mustard.
2.3 杂种后代的染色体组成鉴定
分子标记结果确认了形态上偏花椰菜的材料基因组中包含黑芥遗传信息，为了了解黑芥染色体
在杂种中的存在形式，准确分辨出渐渗系及异附加系材料，进行了双色 FISH 荧光原位杂交。结果
表明：标记红色的黑芥基因组探针在供体黑芥上可杂交 16 个信号（图 4，A）；在受体花椰菜上有两
对杂交信号（图 4，B），但是信号在随体而不在染色体上，一对较强（三角箭头指示），一对较弱（方
形箭头指示），应该是 45SrDNA 的杂交信号（Fukui et al.，1998）。
标记绿色的 CentBr 探针在供体黑芥上没有信号（图 4，A）；在受体花椰菜上（图 4，B）可杂
交 7 对强信号，1 对弱信号（圆形箭头指示），1 对无信号（普通箭头指示）。
PFCN15-2S1BC5-15-2（图 4，C）等 12 份材料都是 18 条染色体，可观察到 7 对绿色强信号，1
对绿色弱信号。且与花椰菜相同：黑芥基因组红色探针杂交到的一对较强信号与绿色的弱信号在同
一对染色体上（分别用三角和圆形箭头指示）；另一对较弱的红信号上也检测到绿色信号（方形箭头
指示）；1 对染色体上既无绿信号也无红色信号（箭头指示）。
PFCN29BC2S1-4 为 9 条花椰菜染色体（图 4，D），包括绿色杂交信号明显的 7 条，无杂交信号
的 1 条（用箭头指示）和 1 条有红绿信号（用方形箭头指示）；另外附加 8 条红色杂交信号明显的黑
芥染色体。
PFCN29BC4-38-5 除亲本花椰菜 18 条染色体外，另附加 5 ~ 7 条供体黑芥染色体（图 4，E），呈
混倍体状态。从图 4，F 可见：花粉母细胞减数分裂后期Ⅰ染色体向两级移动，红色的黑芥染色体
滞后于花椰菜染色体。另外，同样的双色 FISH 杂交显示：PFCN15-2S1BC5-6-2 除 16 条花椰菜染色
体外，附加 7 条黑芥染色体；PFCN29BC4-37-7 除 16 条花椰菜染色体外，附加 14 条黑芥染色体。
2.4 分子标记、FISH 和表型整合分析及渐渗系和异附加系的判定
将 16 份材料的形态学特征，分子标记和 FISH 杂交结果分析整理见表 2。其中 PFCN2S3BC3-3-3
到 PFCN29BC4-37-6 这 12 份材料表型与花椰菜近似，在叶耳有无、花球颜色、大小及紧实度上有一
些差别；细胞染色体数目与花椰菜相同，均为 18 条，双色 FISH 检测不到黑芥染色体，但 SSR 及
AFLP标记分析证实其基因组中含有黑芥特异位点，因此可以判断为渐渗系材料。以 PFCN2S3BC3-3-3
为例，分子标记分析表明：其扩增的黑芥多态性位点数是 25 个，其中 23 个是 AFLP 标记，并在表
中列出了除 AFLP 标记以外的标记名称。同样列出了丢失花椰菜位点、扩增的埃塞俄比亚芥特异位
点和新位点数量，以及对应的除 AFLP 标记外的所有标记名称。 PFCN15-2S1BC5-6-2 、
PFCN29BC4-37-7、PFCN29BC4-38-5 和 PFCN29BC2S1-4 为 4 份异附加系材料，分别保留了数量不等
3 期 吕 晶等：花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析 463

的黑芥染色体，分子标记分析上也较渐渗系材料保留了更多的黑芥特异性位点。还有的材料丢失了
部分花椰菜染色体，表型为中间偏花椰菜类型。以 PFCN29BC2S1-4 为例：FISH 杂交表明其染色体
组成为 9 条花椰菜染色体，附加 8 条黑芥染色体，在分子标记分析上也表现出较其它材料拥有更多
的黑芥特异条带，也较多地丢失了花椰菜位点，表性特征上呈中间偏花椰菜类型，不形成花球，花
瓣短小，发育不好。表 2 总结了本研究材料的分子标记、FISH 和表型分析结果，也说明材料的遗传
分析结果与表型相符合。



图 4 亲本及部分杂种的荧光原位杂交分析
CentBr（绿）和黑芥基因组（红）在亲本及后代细胞的染色体（蓝）上的双色 FISH 定位。
A：二倍体黑芥细胞减数分裂中期Ⅰ；B：二倍体花椰菜细胞有丝分裂中期Ⅰ；C：杂种 15-2S1BC5-15-2 细胞减数分裂中期Ⅰ；
D：杂种 29BC2S1-4 细胞的减数分裂中期Ⅰ；E：杂种 29BC4-38-5 细胞的减数分裂末期Ⅰ；
F：杂种 29BC4-38-5 细胞的减数分裂后期Ⅰ。
和 分别指示较强和较弱的两对红色杂交信号， 指示较弱的绿色杂交信号，
指示无红绿杂交信号的染色体。标尺为 5 μm。
Fig. 4 FISH analysis of parents and hybrids
The location of CentBr（green）and black mustard genomic DNA（red）on chromosomes（blue）of parents and hybrid progenies.
A：Meiosis metaphaseⅠof black mustard；B：Mitosis metaphaseⅠof cauliflower；C：Meiosis metaphaseⅠof 15-2S1BC5-15-2；
D：Meiosis metaphase I chromosomes of 29BC2S1-4；E：Meiosis telophase I chromosomes of 29BC4-38-5；
F：Meiosis anaphase I chromosomes of 29BC4-38-5.
and point out the bright and weak red signals respectively， point out the weak green signal，
point out the chromosome with no red nor green signals. Bar = 5 μm.
464 园 艺 学 报 41 卷

表 2 杂种后代分子标记、FISH 及表型总结
Table 2 The summary of molecular marker，FISH and phenotypic analysis of the hybrids
材料
Plant
materials
黑芥多态性位点
数及部分标记
The number of
B. nigra-specific
loci and markers
丢失的花椰菜多态性位
点数及部分标记
Lost of cauliflower-
specific loci and markers
埃塞俄比亚芥多态性
位点数及部分标记
B. carinata-specific
loci and markers
新位点数及
部分标记
Novel loci
and markers
荧光原位杂交
结果
FISH results
表型特征
Phenotype
PFCN2S3BC3-3-3 25（23 AFLP）
BrID10227；
nia-m037a

12（8 AFLP）
BrID10205；nia-m037a；
At3g55005a；cnu-m472a

40（32 AFLP）
BrID10205；BrID101161；
BrID10223；At3g55005a；
cnu-m472a；cnu-m052a
7（6 AFLP）
BrID10223

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，
形成紧实白色小花球
Leaf color，leaf type
like the cauliflower，
have a small white
flower head
PFCN14-4S5BC1-8-3 26（25 AFLP）
BrID10227

13（8 AFLP）
BrID10205；BrID10381；
BrID10173；nia-m037a
35（32 AFLP）
BrID10985；
BrID101161；
BrID10381
6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，
形成紧实白色小花球
Leaf color，leaf type
like the cauliflower，
have a small white
flower head
PFCN14-4S5BC1-8-7 31（29 AFLP）
BrFLC2(R2)；
BrID10227

16（9 AFLP）
BrID10277；BrID10205；
BrFLC2(R2)；nia-m037a；
cnu-m472a；nia-m063
49（41 AFLP）
BrID10277；
BrID10205；
BrFLC2(R2)；
BrID101161；
cnu-m472a；
cnu-m052a
6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，
形成紧实白色小花球
Leaf color，leaf type
like the cauliflower，
have a small white
flower head
PFCN14-4S5BC1-8-8 20（18 AFLP）
BrFLC2(R2)；
BrID101081

23（8 AFLP）
BrID10277；BrID10205；
BrFLC2(R2)；BrID10881；
BrID101157；BrID101183；
BrID90311；BrID10493；
BrID10223；BrID10173；
nia-m037a；nia-m063a
40（32 AFLP）
BrID10277；
BrFLC2(R2)；
BrID90430；
BrID101161；
cnu-m052a

6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，
形成紧实白色小花球
Leaf color，leaf type
like the cauliflower，
have a small white
flower head
PFCN14-1S1BC5 22（21 AFLP）
At4g36960

26（9 AFLP）
BrID10277；BrID10205；
BrID10881；BrID101157；
BrID101161；BrID10971；
BrID10381；BrID90311；
BrID10493；BrID10173；
nia-m037a；At3g55005a；
nia-m063a；At3g51260
40（33 AFLP）
BrID90430；
BrID10381；
BrID10493；
At3g55005a；
nia-m063a；
cnu-m052a

6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形似花椰菜，形
成松散花球，且淡黄白
色，局部浅紫色
Leaf color，leaf type like
the cauliflower，have a
loose flower head and
somewhere showed to
be light purple
PFCN15-2S1BC5-6-7 27（25 AFLP）
BrID10227；
At4g36960

11（7 AFLP）
BrID10205；BrID10493；
cnu-m472a

35（31 AFLP）
BrID10493；
cnu-m472a；
cnu-m052a

6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，形
成紧实白色花球，较小
Leaf color，leaf type
like the cauliflower，
have a small white
flower head
PFCN15-2S1BC5-9-4 32（31 AFLP）
At4g36960

30（9 AFLP）
BrID10277；BrID10205；
BrID10881；BrID10381；
BrID101183；BrID10971；
BrID90311；BrID10103；
BrID10493；BrID10101；
BrID10275；BrID101199；
nia-m037a；At3g55005a；
cnu-m472a；At3g51260
48（40 AFLP）
BrID10277；
BrID90430；
BrID101161；
BrID10381；
At3g55005a；
cnu-m472a；
cnu-m052a

6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，
形成紧实白色花球
Leaf color，leaf type
like the cauliflower，
have a tight flower
head

PFCN15-2S1BC5-15-1 27（25 AFLP）
BrID10985；
BrFLC2(R2)

32（13 AFLP），
BrID10205；BrFLC2(R2)；
BrID101157；BrID101183；
BrID90311；BrID10493；
BrID10101；BrID10971；
BrID10275；BrID101199；
BrID10173；At1g58220；
nia-m037a；At3g55005a；
At4g36960；At3g51260
49（41 AFLP）
BrID10277；
BrID10985；
BrID10205；
BrFLC2(R2)；
BrID90430；
At3g55005a；
cnu-m052a

6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶形似花椰菜，叶片蜡
质更多，形成基本正常
的白色花球，紧实度降
低
Have more wax on the
leaf，the flower head
were looser

3 期 吕 晶等：花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析 465

续表 2
材料
Plant
materials
黑芥多态性位点
数及部分标记
The number of
B. nigra-specific
loci and markers
丢失的花椰菜多态性位
点数及部分标记
Lost of cauliflower-
specific loci and markers
埃塞俄比亚芥多态性
位点数及部分标记
B. carinata-specific
loci and markers
新位点数及
部分标记
Novel loci
and markers
荧光原位杂交
结果
FISH results
表型特征
Phenotype
PFCN15-2S1BC5-15-2 33（31 AFLP）
BrFLC2(R2)；
BrID10227

17（11 AFLP）
BrID10277；BrID10205；
BrFLC2(R2)；BrID101157；
nia-m037a；cnu-m472a
45（38 AFLP）
BrID10277；BrID10205；
BrFLC2(R2)；BrID101161；
cnu-m472a；cnu-m052a
6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶形似花椰菜，形成基
本正常的白色花球，紧
实度降低 The flower
head were looser
PFCN15-2S1BC5-15-3 25 AFLP

17（8 AFLP）
BrID10881；BrID101157；
BrID101183；BrID10971；
BrID10493；nia-m037a；
At3g55005a；At3g51260
34（31 AFLP）
BrID101161；
At3g55005a；
At3g51260

6 AFLP

18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶形似花椰菜，叶片蜡
质更多，形成松散的白
色花球 Have more wax
on the leaf and a loose
flower head
PFCN29BC4-32-3 3
BrID10227；
nia-m037a；
At3g55005a
7
BrID10277；BrID10205；
BrID101157；BrID10381；
nia-m037a；At3g55005a；
Ni4-B10
4
BrID10277；
BrID10205；
BrID10381
1
Ni4-B10
18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶形近似花椰菜，但有
叶耳，形成较致密的白
色较小花球
Have ligule，and a
small tight flower head
PFCN29BC4-37-6 5
BrID10277；
BrID10985；
nia-m037a；
At3g55005a；
At2g38130
27
BrID10205；BrFLC2(R2)；
BrID10881；BrID101157；
BrID101183；BrID90311；
BrID10971；BrID10103；
BrID10493；BrID10101；
BrID10275；BrID101199；
BrID10173；At1g58220；
nia-m037a；At3g55005a；
cnu-m472a；nia-m063a；
Ni4-B10；At3g51260
5
BrID10277；
BrID10223；
BrID90430；
At2g38130；
nia-m063a
2
BrID10223；
Ni4-B10；
18 条花椰菜染
色体
18 cauliflower
chromosomes
叶色灰绿色，叶形偏花
椰菜，形成紧实的白色
较小花球。
Leaf color is gray
green，have a firm
small flower head
PFCN15-2S1BC5-6-2 17
BrID10985；
BrID10199；
ENA28(R1)；
BrID90430；
BrID10881；
BrID10971；
BrID10173；
At1g68310；
nia-m037a；
Ni4-B10；
At3g51260
16
BrID10985；BrID10205；
BrID101157；BrID101183；
BrID90311；BrID10971；
BrID10759；BrID10493；
BrID10173；At1g03180；
nia-m037a；At3g55005a；
At2g38130；Ni4-B10；
At3g51260
4
BrID10277；BrID10881；
BrID10971；At1g68310
1
BrID10759
16 条花椰菜染
色体，附加 7
条黑芥染色体
16 cauliflower
chromosomes
and 7 black
mustard-derived
chromosomes
叶色为绿色，叶形为中
间偏黑芥类型，没有花
球形成
Leaf color is green，leaf
type presents middle
biased to black
mustard，no flower
head

PFCN29BC4-37-7 10
BrID10985；
BrID10595；
BrID10199；
BrID90105；
BrID10227；
At1g68310；
nia-m037a；
Ni4-B10；
At3g51260
6
BrID90105；At1g03180；
At1g68310；nia-m037a；
At3g55005a；cnu-m472a
7
BrID10277；BrID10985；
BrID10595；BrID101161；
BrID90105；At1g68310；
At3g51260

0 16 条花椰菜染
色体，附加 14
条黑芥染色体
16 cauliflower
chromosomes
and 14 black
mustard-derived
chromosomes
叶色叶形近似花椰菜，
花蕾无分支，聚集为一
簇，没有形成明显的花
球
Leaf color，leaf type
were all like the
cauliflower， the buds
gather into a cluster，
but not forming a
flower head
PFCN29BC4-38-5 20
BrID10985；
BrID10595；
BrID10199；
BrID10971；
BrFLC2(R2)；
ENA28(R1)；
BrID10881；
BrID90105；
BrID10227；
At1g68310；
nia-m037a；
At3g55005a；
Ni4-B10
7
BrFLC2(R2)；BrID90105；
BrID10971；BrID10493；
At1g03180；nia-m037a；
At2g38130
13
BrID10277；BrID10985；
BrFLC2(R2)；BrID10881；
BrID10971；BrID101161；
BrID90105；BrID10223；
BrID10493；BrID10727；
At1g68310；cnu-m472a；
At4g36960
5
BrID10987；
BrID10223；
At3g55005a；
At2g38130
18 条花椰菜
染色体，附加
5 ~ 7 条黑芥染
色体
18 cauliflower
chromosomes
and 5 ~ 7 black
mustard-derived
chromosomes
叶色为灰绿色，叶形为
偏花椰菜，形成花球绿
白色
Leaf color is gray
green，leaf type like the
cauliflower，have a
light green white
flower head

466 园 艺 学 报 41 卷
续表 2
材料
Plant
materials
黑芥多态性位点
数及部分标记
The number of
B. nigra-specific
loci and markers
丢失的花椰菜多态性位
点数及部分标记
Lost of cauliflower-
specific loci and markers
埃塞俄比亚芥多态性
位点数及部分标记
B. carinata-specific
loci and markers
新位点数及
部分标记
Novel loci
and markers
荧光原位杂交
结果
FISH results
表型特征
Phenotype
PFCN29BC2S1-4 26
BrID10985；
BrID10199；
BrFLC2(R2)；
BrID10723；
ENA28(R1)；
8C0522；
BrID10881；
BrID101081；
BrID10971；
BrID90105；
BrID10173；
At1g03180；
At1g68310；
nia-m037a；
At3g55005a；
Ni4-B10
17
BrID10277；BrID10985；
BrID10205；BrFLC2(R2)；
BrID90105；BrID10869；
BrID10493；BrID10223；
BrID10971；BrID10955；
nia-m037a；At2g38130；
Ni4-B10；At3g5126
18
BrID10277；BrFLC2(R2)；
BrID10723；8C0522；
BrID10881；BrID10689；
BrID101161；BrID90105；
BrID10971；BrID10869；
BrID10173；BrID10955；
BrID10223；BrID10227；
At1g68310；At3g55005a；
cnu-m472a；At4g36960
8
BrID90283；
BrID10987；
BrID10227；
nia-m037a；
9 条花椰菜染
色体，附加 8
条黑芥染色体
9 cauliflower
chromosomes
and 8 black
mustard-derived
chromosomes
叶色为绿色，叶形为中
间偏花椰菜类型，无
球，花瓣短小，发育不
好
Leaf color is green，leaf
type presents middle
biased to black
mustard，no flower
head，the petals is small
注：多态性位点数大于 SSR 及 AFLP 标记数之和，是因为有些标记会产生几个多态性位点。
Note：Some markers have several polymorphic loci and so the number of polymorphic loci is usually greater than the total number of markers.
3 讨论
本研究中，PFCN15-2S1BC5-15-2 等 12 株花椰菜类型的杂种，都为 18 条染色体，且 FISH 检测
到 CentBr 的 7 对强信号、1 对弱信号和 1 对无信号，证明其染色体组与亲本花椰菜相同；同时，SSR
和 AFLP 分子检测表明：这些杂种包含供体黑芥特异多态性位点，证实这 12 份材料为花椰菜—黑芥
渐渗系，这些材料将进入多方面的性状检测和育种应用评价。另外 4 份材料中，PFCN29BC4-38-5
为花椰菜染色体组附加了 5 ~ 7 条黑芥染色体的混倍体异附加系， PFCN29BC2S1-4，
PFCN15-2S1BC5-6-2 和 PFCN29BC4-37-7 的基因组均为部分花椰菜染色体和部分黑芥染色体组成，
这些材料可以作为育种桥梁进行下一步的回交以期获得花椰菜—黑芥渐渗系，应用于育种。同时，
在基因组互作、减数分裂的染色体行为、倍性演化等相关研究中，这些材料都将提供独特的素材。
研究材料都有丢失亲本花椰菜多态性位点和扩增的新位点（表 2），说明在杂交过程中的基因
组互作是复杂而非单一的。其中 SSR 分子标记分析中，丢失亲本花椰菜位点为 4 ~ 27 个，扩增到新
位点为 1 ~ 8 个，在 10 份渐渗系材料的 AFLP 分子标记分析中，丢失花椰菜位点 7 ~ 13 个，都扩增
到新位点 6 个，与 Wang 等（2005）得到的结果类似，杂种丢失亲本特异性条带的频率高于扩增到
的新条带。埃塞俄比亚芥（BBCC，2n = 34）是黑芥（BB，2n = 16）和甘蓝（CC，2n = 18）自然
形成的异源四倍体。 Jourdan 和 Salazar（1993）采用原生质体融合方法通过 B.nigra（BB）和 B.oleracea
（CC）获得 B. carinata（BBCC）的体细胞杂种 64 株，在同工酶（GPI，EC 5.3.1.9）分析中，64
株体细胞杂种都可检测到埃塞俄比亚芥的同工酶位点，47%体细胞杂种含有融合亲本和埃塞俄比亚
芥的全部同工酶（gpi-2）位点，并出现新的位点。本研究在体细胞杂种的渐渗系及异附加系中，SSR
和 AFLP 分子标记分析都扩增到数量不等的埃塞俄比亚芥特异多态性位点（表 2），与前人研究结
果有一致性，推测人工合成多倍体和自然进化的多倍体早期世代中，两套基因组可能发生了一些相
同的变化事件。在本试验的 SSR 分子标记分析中，位于 A10 连锁群的 SSR 引物 BrID10227 只能在
供体黑芥上扩增到多态性位点，6 份渐渗系材料扩增到此位点；位于 A2 连锁群的 SSR 引物 BrFLC2
（R2）可在双亲上扩增到不同的多态性位点，有 4 份渐渗系材料扩增到这对引物在黑芥上的多态性
位点；位于 B2，G5 和 A3 连锁群的 SSR 引物 At4g36960 可在双亲上扩增到不同的多态性位点，3
3 期 吕 晶等：花椰菜—黑芥渐渗系和异附加系的获得与分析 467

份渐渗系材料扩增到这对引物在黑芥上的多态性位点。推测在杂种后代自交或回交过程中，这 3 对
SSR 引物所在的位置发生了染色体交换重组。B 和 C 基因组的相遇可能存在某些特定区域更容易发
生染色体交换、基因组重排等结构变化和互作，将在后续进行深入研究。
本研究中成功地将双色 FISH 和分子标记分析相结合用于芸薹属渐渗系和异附加系的鉴定。对
芸薹属 3 个二倍体种间杂种的细胞学观察表明，基因组结构和相似性影响同源配对频率，在种间杂
种减数分裂时，观察到更多的 A-C 基因组的关联，而 A-B 或 B-C 基因组之间的关联则很少，进一
步证实 B 基因组与 A、C 基因组的亲缘关系更远一些（Cui et al.，2012），这是可以通过 GISH 技术
在杂种中区分出 B 基因组染色体的前提。Panjabi 等（2008）研究表明，在芸薹属物种进化过程中，
祖先群发生重排，B 基因组（B4、B5 和 B6）和 A 基因组（A4、A5 和 A6）的 3 个连锁群存在显著
的同源性。这种同源性使得本研究中在 B 基因组遗传信息量较少的情况下可以通过白菜基因组的
SSR 分子标记检测 B、C 基因组体细胞杂种的多态性，并成功地在杂种中检测到黑芥的多态性位点。
随着分子生物学的发展和白菜全基因组序列及遗传图谱的公布，在芸薹属内可以借用不同物种的分
子标记辅助检测种间杂种和基因组渐渗。

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