全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（10）：1598–1604
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2010–04–19；修回日期：2010–08–06
基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD48B01）
﹡ 通信作者 Author for correspondence（E-mail：itbblzx@yahoo.com.cn）
辣椒脉斑驳病毒CP基因的原核表达及其抗血清
的制备
吴育鹏 1,2，王健华 1,2，冯团诚 1，张雨良 1，王小明 1,2，刘志昕 1,*
（1 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，农业部热带作物生物技术重点开放实验室，海口 571101；2 海南大学
环境与植物保护学院，海南儋州 570228）
摘 要：采用 RT-PCR 方法克隆了辣椒脉斑驳病毒文昌分离物（ChiVMV-WC）的 CP 基因，并将其
连接到原核表达载体 pET-30b（+）上，克隆测序以确定其阅读编码框的正确性，然后将获得的重组质粒
pET30b-ChiVMV CP 转化大肠杆菌 Rosetta（DE3）后，用 IPTG 进行诱导表达。SDS-PAGE 分析结果表明，
CP 基因在大肠杆菌中获得了高效表达，获得的融合蛋白分子量约为 38 kD。用 Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析
纯化的融合蛋白免疫兔子并获得抗血清。Western blot 检测结果表明，抗血清与诱导表达的 ChiVMV-WC
编码 CP 蛋白发生特异性反应。间接酶联免疫吸附法（ID-ELISA）检测抗血清效价为 1/106。通过对田间
20 个样品的 ID-ELISA 检测，证实了所制备的抗血清与 ChiVMV 病叶具有良好的反应特异性。
关键词：辣椒；辣椒脉斑驳病毒；外壳蛋白；原核表达；抗血清
中图分类号：S 641.3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）10-1598-07

Expression of Chilli veinal mottle virus Coat Protein and Preparation of a
Virus-specific Antiserum
WU Yu-peng1,2，WANG Jian-hua1,2，FENG Tuan-cheng1，ZHANG Yu-liang1，WANG Xiao-ming1,2，and
LIU Zhi-xin1,*
（1Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology of Ministry of Agriculture，Institute of Tropical Bioscience and
Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China；2College of Environment and
Plant Protection，Hainan University，Danzhou，Hainan 570228，China）
Abstract：The coat protein（CP）gene of Chilli veinal mottle virus Wenchang isolate（ChiVMV-WC）
was amplified by RT-PCR，and cloned into the expression vectors pET-30b（+）. After the reading frame is
confirmed by sequencing, the recombinant plasmid pET30b-ChiVMV CP was transferred into E. coli
Rosetta（DE3）and the expression of the recombinant CP protein was then induced by IPTG. SDS-PAGE
analysis showed a high level expression of the recombinant CP of about 38 kD. The fusion protein was
then purified with Ni2+-NTA agarose affinity chromatography, and used to immune rabbits for antiserum
preparation. Western blot analysis confirmed that the antiserum reacted strongly and specifically to the CP
of ChiVMV-WC. The optimal titer of the antiserum in indirect enzyme-linked immunosorbent assay
（ID-ELISA）was determined to be 1/106. ID-ELISA testing of a number of field samples demonstrated

10 期 吴育鹏等：辣椒脉斑驳病毒 CP 基因的原核表达及其抗血清的制备 1599

the sensitivity and specificity of the antiserum described in this paper.
Key words：pepper；Chilli veina mottle virus；CP；prokaryotic expression；antiserum

辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus，ChiVMV）是一种（+）ssRNA 病毒，为马铃薯 Y
病毒科 Y 病毒属（Potyvirus）的确定种。1979 年 Ong 等首次报道了 ChiVMV 在辣椒上存在（Ong et
al.，1979），此后陆续在世界各国的辣椒作物上发现并报道（Chiemsombat et al.，1998；Anindya et al.，
2004；Nono-Womdim，2004）。AVRDC（亚洲蔬菜研究发展中心）曾对亚洲的 16 个国家作了调查，
结果显示有 30%的辣椒作物受到该病毒的侵害。尽管国内外对 Potyvirus 属的许多成员的株系分化和
遗传变异做了较深入的研究（Joseph & Savithri，1999），但对于 ChiVMV 的研究尚显不够，对其功
能也大都是与同属其它成员进行比对后推导得出的，而用分子生物学方法研究 ChiVMV 株系分化和
遗传变异的报道更为鲜见。国内在这方面的研究才刚刚起步，对该病毒的分布及为害均缺乏应有的
认识，亦无基因组及株系分化、遗传变异等进一步的研究报道。近年来该病毒对海南‘黄灯笼’辣
椒的危害越发严重。因此，对其分布情况及发展规律进行调查研究势在必行。
免疫技术，特别是酶联免疫吸附分析方法（ELISA）是病毒鉴定、分类以及检测的重要工具，
也是应用最广泛的方法之一（王健华 等，2005）。本试验中利用分子生物学方法在大肠杆菌中高效
表达该病毒的外壳蛋白，以纯化的蛋白免疫大白兔制备专化性抗血清，降低了检测成本，便于进行
血清学检测，为该病毒检测体系的建立打下基础。
1 材料与方法
1.1 材料及其 PCR 扩增和表达载体构建
感染 ChiVMV 的‘黄灯笼’辣椒（Capsicum chinense Jacp.‘Yellow Lantern’）毒源叶片样品于
2009 年 1 月采自海南省文昌市，–80℃贮存备用。采用改良后的尿素法（赵双宜 等，2002）提取
感病辣椒叶片的总 RNA。根据农业部热带作物生物技术重点开发实验室测定的 ChiVMV-WC
（GenBank 的登录号为 GQ981316）CP 基因序列设计一对引物。上游引物 CP-F：5′-ATAT
GAATTCAGGAGAGAGCGTCGAC-3′（下划线部分为 EcoRⅠ酶切位点）；下游引物 CP-R：
5′-GACGAAGCTTACAATCCACGAACAC-3′（下划线部分为 HindⅢ酶切位点）。预期扩增片段 880
bp。为了能适合表达载体的阅读框，EcoRⅠ酶切位点后加 1 个碱基 A。引物由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。E. coli DH5α、Rosetta（DE3）菌株和原核表达载体 pET-30b（+）由本实验室提供。
第一链 cDNA 的合成采用 M-MLV 逆转录酶，以 M4-T[5′-GTTTTCCCAGTCACGAC（T）15-3′]
作为起始引物，合成该病毒分离物的全长 cDNA，于–20 ℃保存备用。接着以 CP-F 和 CP-R 为引物，
采用 Taq DNA 聚合酶对 cDNA 进行 PCR 扩增，94 ℃变性 2 min；94 ℃变性 0.5 min，58 ℃退火 0.5 min，
72 ℃合成 1 min，35 个循环；72 ℃延伸反应 10 min。回收 PCR 产物。EcoRⅠ和 HindⅢ双酶切回收片
段，同样酶切表达载体 pET-30b（+），经凝胶回收纯化后连接，转化 E.coli DH5α（刘金亮 等，2006）。
对经 PCR 扩增和酶切鉴定为阳性的重组质粒进行序列测定以验证 ChiVMV CP 基因阅读框的正确性。
1.2 目的基因的诱导表达与 SDS-PAGE
将阅读框正确的重组子 pET30b-ChiVMV CP 转化 E. coli Rosetta（DE3）菌株，挑取阳性单菌落
接种于 10 mL LB 液体培养基中（含卡那霉素 50 μg · mL-1），于 37 ℃活化过夜后，1︰100 稀释到 20
mL 的 LB 液体培养基中，振荡培养至 OD600 值达到 0.5 ~ 0.8，分别取 1 mL 菌液加到 4 个 2 mL 的离
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图 1 RT-PCR 的结果 图 2 重组质粒 pET30b-ChiVMV CP 的双酶切鉴定
Fig. 1 Result of RT-PCR amplification Fig. 2 Recombination plasmid pET30b-ChiVMV CP digested
with HindⅢ and EcoRⅠ
心管，加入 IPTG 终浓度为 1.0 mmol · L-1，继续于 37 ℃分别培养 2、4、6、8 h；另一组同样分别取
1 mL 菌液加到 4 个 2 mL 的离心管，分别加入 IPTG 终浓度为 0.1、0.3、0.6、1.0 mmol · L-1，继续
于 37 ℃培养 4 h。离心，收集菌体，加入 100 μL 1 × SDS 凝胶加样缓冲液，100 ℃煮沸 5 min，12 000
r · min-1 离心 10 min，取其上清液，用 12%的凝胶进行 SDS-PAGE 分析。考马斯亮蓝 R-250 染色。
1.3 表达产物的可溶性分析及纯化
0.1 mmol · L-1 IPTG 诱导 2 h 后，将 50 mL 菌液于 4 ℃ 12 000 r · min-1 离心 2 min，收集菌体沉
淀，弃上清液。使用超声波破碎法对菌体进行破碎，取上清液和沉淀分别上样 SDS-PAGE，对目的
蛋白进行可溶性分析。采用 Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析进行纯化（Towbin，1979）。用生理盐水对回
收到的蛋白溶液适当稀释，然后用分光光度计分别测定其在 260、280 nm 的光吸收值，根据计算公
式算蛋白浓度（mg · mL-1）= 1.45OD280–0.74OD260。
1.4 抗血清的制备以及 Western blot 检测和效价的测定
参照陈招荣等（2006）和梁文星等（2004）的方法制备抗血清。将抗血清进行一系列稀释后，
用 ID-ELISA 方法（王健华 等，2005）测定血清的效价。
表达的蛋白经 SDS-PAGE 后电转移至硝酸纤维素膜上，用预染蛋白质分子量标准检测转移效
率。转移后的硝酸纤维素膜进行 Western blot 分析（Kimber et al.，1986）。
1.5 田间样品检测
从海南各市县采集到 20 个具有辣椒脉斑驳症状的黄灯笼辣椒样品，用本试验中制备的 ChiVMV
抗血清对这 20 个样品进行 ID-ELISA 检测，然后根据 ChiVMV 序列设计一对能扩增 1 358 bp 片段的
引物对这 20 个样品进行 PCR 检测。
2 结果与分析
2.1 ChiVMV CP 区基因的扩增
以感病叶片的总 RNA 为模板，通过 RT-PCR 扩增到 1 条在 750 ~ 1 000 bp 之间的 DNA 片段（图
1），大小与预期相符。

10 期 吴育鹏等：辣椒脉斑驳病毒 CP 基因的原核表达及其抗血清的制备 1601

图 4 重组菌在不同诱导浓度下的表达产物
M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的空载体 pET30b（+）；2：未诱导
重组菌；3 ~ 6：IPTG 终浓度为 0.1、0.3、0.6 and 1.0 mmol · L-1。
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of ChiVMV CP induced by
different concentrations of IPTG
M：Protein molecular weight markers；1：Uninduced pET30b（+）；
2：Uninduced pET30b-ChiVMV CP recombinant bacteria；
3–6：Induced by IPTG 0.1，0.3，0.6 and 1.0 mmol · L-1.
图 3 重组菌在不同表达时间下的表达产物
M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的空载体 pET30b（+）；
2：未诱导重组菌；3 ~ 6：诱导 2、4、6 和 8 h。
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of ChiVMV CP induced
at different time
M：Protein molecular weight markers；1：Uninduced pET30b（+）；
2：Uninduced pET30b-ChiVMV CP recombinant bacteria；
3–6：Induced 2，4，6 and 8 h.
图 5 重组 ChiVMV CP 蛋白的转化
Fig. 5 ChiVMV CP purification
2.2 表达载体的构建
将重组质粒用 HindIII 和 EcoRⅠ双酶切，得到 5 000 bp 和 880 bp 大小的两条带（图 2），与原核
表达载体 pET30b 和 CP 基因大小一致，经序列测定证明阅读框架正确，表明已成功构建了含有
ChiVMV CP 基因的原核表达载体 pET30b-ChiVMV CP。
2.3 CP 基因的诱导表达
用含有 pET30b-ChiVMV CP 重组子质粒转化大肠杆菌 Rosetta（DE3），经终浓度 1.0 mmol · L-1
IPTG 诱导 2、4、6、8 h（图 3）和 IPTG 终浓度 0.1、0.3、0.6、1.0 mmol · L-1 分别诱导 4 h 后（图 4），
在约 40 kD 处出现一条蛋白带，而对照（空载体）和未诱导菌液无此带；ChiVMV CP 基因片段编码
蛋白的分子量为 32.43 kD 左右，其上下含有载体所编码的 50 个氨基酸，因此重组子产生的融合蛋
白其相对分子量约为 38 kD，与 SDS-PAGE 所测大小相符。

2.4 融合蛋白的可溶性分析及纯化和定量
超声波处理后的沉淀和上清经 12%
SDS-PAGE 分析，结果表明：pET30b-ChiVMV
CP 融合蛋白表达产物主要以可溶性蛋白形式
存在，少数以包涵体形式存在。
将菌液经超声波破碎仪破碎后离心所得的
上清液，采用 Ni2+-NTA 琼脂糖亲和层析进行
纯化，得到纯度较高的表达产物（图 5）。测定
所纯化的表达产物浓度为 0.823 mg · mL-1。
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图 6 Western blot 分析结果
Fig. 6 Western blot analysis using ChiVMV
2.5 抗血清的制备和效价测定
抗血清效价和工作浓度分别以提纯的 CP 蛋白和感病的辣椒叶片汁液为抗原进行 ID-ELISA 测
定。结果（表 1、表 2）表明：当以提纯的 CP 蛋白作抗原时，抗血清稀释 106 倍仍明显地呈阳性反
应；当以发病叶片汁液为抗原时，抗血清在稀释 104 倍仍呈阳性反应。

表 1 不同稀释度的抗血清与纯化的 CP 蛋白的 ELISA 结果的 OD 值
Table 1 ELISA OD values obtained using purified ChiVMV CP protein and different dilutions of ChiVMV CP antiserum
血清稀释 Serum dilutions 样品
Sample 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
CP 蛋白 CP protein（CK+） 3.551 3.501 3.501 3.501 1.638 0.338 0.101
免疫前血清
Un-mmune Serum（CK-）
0.086 0.085 0.082 0.076 0.074 0.068 0.065
空白对照 Control（Blank） 0.059 0.056 0.056 0.053 0.053 0.052 0.052
注：检测标准 CK+ OD/ CK- OD＞2.1，且 CK+OD＞0.1。
Note：When the CK+ OD＞0.1 and the CK+ OD/ CK- OD＞2.1，the reaction was considered as positive.


表 2 不同稀释度的抗血清与病样的 ELISA 结果的 OD 值
Table 2 ELISA OD values obtained using ChiVMV-infected leaves and different dilutions of ChiVMV CP antiserum
血清稀释 Serum dilutions 样品
Sample 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
染病叶片
Infected leaves（CK+）
1.378 1.234 0.741 0.211 0.101 0.072 0.072
健康叶片
Health leaves（CK-）
0.598 0.151 0.126 0.097 0.077 0.073 0.071
空白对照
Control（Blank）
0.281 0.128 0.087 0.077 0.075 0.072 0.070
注：检测标准（CK+ OD405–空白 OD405）/（CK- OD405–空白 OD405）≥ 2。
Note：A reaction with（CK+ OD405–Blank OD405）/（CK- OD405–Blank OD405）≥ 2 was considered as positive.

2.6 Western blot 结果分析
Western blot 结果显示，ChiVMV 抗血清仅
与 38 kD 的诱导表达产物反应，而与其它条带
之间均无反应（图 6）。
Western blot 证明了抗血清的特异性。

2.7 田间样品检测
用所制备的抗血清对从海南各个市县采集
到的 20 个病样进行 ID-ELISA 检测，有 13 个样品出现显色反应，而其他 7 个样品没有，CK-和 Blank
没有出现显色反应（图 7）。
用 PCR 技术对 20 个样品再次检测，有 13 个样品出现一条很亮且与预期大小相符的条带，而其
他 7 个没有条带（图 8）。
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图 7 ID-ELISA 检测结果
Fig. 7 ID-ELISA detection of ChiVMV in field samples


图 8 PCR 检测结果
Fig. 8 PCR amplification of ChiVMV CP gene from field samples
3 讨论
ChiVMV 对辣椒的危害严重，建立一种快速可靠的检测技术对于控制该病毒的传播和蔓延尤为
重要。血清学方法具有灵敏、快速、适合大量样品检测等特点，在植物病毒检测中得到应用（蔡文
启 等，1985；田波和裴美云，1987；刘志昕 等，1994）。Joseph 等（1999）从提纯的 PVBV（ChiVMV
的不同命名）病毒中获得高纯度的基因组 RNA，经反转录后扩增 CP 基因进行原核表达但并没有制
备抗血清，病毒提纯过程复杂烦琐，对仪器设备的要求高而得率低，这大大限制了病毒抗血清的制
备（梁文星 等，2004）。作者通过提取病叶总 RNA 经反转录后扩增 CP 基因进行原核表达及制备
抗血清，这样大大缩短了抗血清的制备周期。
原核表达过程中重组菌经诱导后表达产物得率高低和存在形式是试验的关键所在，为此设计了
诱导时间梯度和诱导物 IPTG 的浓度梯度对重组菌诱导表达产物得率高低和存在形式进行了分析。
在时间梯度中，诱导 2 h 即见蛋白表达，而与 4、6、8 h 表达量相差不大；在浓度梯度中，IPTG 终
浓度为 0.1 mmol · L-1 即可见蛋白表达，而与其他较高的诱导浓度表达量相差不大。可见，在本试验
中所设计的诱导条件范围内，诱导时间和 IPTG 浓度对诱导产物表达量无显著影响。考虑到成本问
题和 IPTG 对细胞有毒性的特征，最终确定 IPTG 终浓度 0.1 mmol · L-1、诱导时间 2 h、诱导温度 37
℃，为 pET30b-ChiVMV CP 重组子质粒在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中的诱导条件。这一条件下的
诱导产物得率较高，时间较短，且大多以可溶性蛋白形式存在，为后续免疫程序奠定了良好基础。
以纯化蛋白和感病叶片分别为抗原，利用制备的ChiVMV抗血清进行ELISA试验，重复3次，以
测定所制备抗血清的效价与工作浓度。在以纯化的CP蛋白为抗原试验中，抗血清稀释106倍仍明显
地呈阳性反应，说明制备的抗血清效价为1/106。可见，所制备的抗血清具有较高的效价水平。以感
病叶片为抗原试验中抗血清稀释10和100倍时，健康叶片和空白对照均出现显色反应，说明抗血清稀
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释度较高时，有很强的本底反应，不适合用于样品检测；当抗血清稀释103和104倍时，只有感病的
叶片显色，而稀释105倍时没有出现显色反应，说明抗血清稀释103 ~ 104倍是检测叶片的最佳浓度，
可基本满足于样品检测要求。作者采用ID-ELISA技术和PCR技术分别对20个样品进行检测，两次检
测的结果一致，从而初步证实了有13个病样携带的是ChiVMV，可见本试验所制备的ChiVMV抗血
清基本上可以应用于田间样品检测。

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