全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (10) : 1443 - 1449
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 30; 修回日期 : 2009 - 07 - 06
基金项目 : 国家 ‘863’计划项目 ( 2006AA10Z1A6) ; 国家科技支撑计划项目 ( 2006BAD01A7, 2008BADB1B04) ; 北京市教委
共建项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: SHL1606@ cau1edu1cn)
利用抑制消减杂交技术分离辣椒细胞质雄性不育育
性恢复相关 EST
郭　爽 , 沈火林 3 , 杨文才 , 杨　娟 , 王　雯
(中国农业大学农学与生物技术学院 , 北京 100193)
摘 　要 : 以辣椒 (Capsicum annuum L. ) 细胞质雄性不育系 23A、121A, 和其相应的近等基因恢复系
23C、121C为试验材料 , 利用抑制消减杂交 ( SSH ) 技术成功构建了 CMS恢复基因诱导表达的消减 cDNA
文库。结合高密度点阵膜杂交差异筛选 , 获得了 282个阳性克隆。通过测序 , 除去重复序列共得到 175个
Unique ESTs。在 GenBank上进行 BLAST分析 , 55个 EST片段未找到对应的同源序列 , 可能代表了新基因 ;
120个 EST片段找到了对应的同源序列 , 包括 103个已知功能基因和 17个未知功能基因。按照 M IPS功能
分类法 , 将其分为 14个功能组 , 涉及代谢、胁迫应答、蛋白活性、转录因子、信号转导等多方面的功能。
关键词 : 辣椒 ; 细胞质雄性不育 ; 恢复基因 ; 抑制消减杂交 ; 差异表达
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1021443207
Isola tion of Fertility Restora tion2rela ted ESTs in Pepper Cytopla sm ic M a le
Ster ility L ines Using SSH
GUO Shuang, SHEN Huo2lin3 , YANG W en2cai, YANG Juan, and WANG W en
(College of A gronom y and B iotechnology, China A gricultura l U niversity, B eijing 100193, Ch ina)
Abstract: To isolate fertility restoration2related genes in pepper cytop lasm ic male sterility ( CMS)
lines, a forward subtracted cDNA library was constructed using supp ression subtractive hybridization ( SSH).
The cDNA of pepper CMS line 23A and 121A were used as driver and near2isogenic restorer line 23C and
121C as tester. Genes differentially exp ressed were screened using dot blot hybridization. A total of 175 non2
redundant exp ressed sequence tags ( ESTs) were identified. The genespipotential function analysis showed that
103 of these genes were homologous to known genes, and 55 could be new genes. The ESTs were sorted into
14 functional categories according to the Munich Information Center for Protein Sequences (M IPS) method.
Key words: pepper; cytop lasm ic male sterility; restorer gene; supp ression subtractive hybridization;
differential exp ression
已有研究表明植物细胞质雄性不育 ( cytop lasm ic male sterility, CMS) 中恢复基因对不育基因相关
区域的作用至少有转录水平和翻译水平调控两种方式 ( Gray et al. , 1992)。恢复基因的一种作用方
式可能是编码一种 RNA加工酶 , 通过在转录水平影响不育相关区域转录本的加工、编辑 , 进而导致
蛋白谱的差异 , 引起育性恢复。另外一种作用方式可能是编码一种蛋白质酶 , 通过减少不育基因编码
的蛋白质积累量而引起育性的恢复。虽然这些假说都能从某一方面解释育性恢复机理 , 但都没有令人
信服的直接证据。辣椒 CMS恢复基因主要分布在辣椒味较浓的小果形辣椒材料中 , 大果形辣椒和甜
椒中相对较少 (王述彬 等 , 2007) , 其育性恢复力呈连续分布的数量性状特点。W ang等 (2004) 已
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将辣椒 CMS主效恢复基因定位在第 6条染色体上 , 并且找到了 4个微效 QTL s, 以及位于主效恢复基
因两侧的 2个 RAPD标记 ( Zhang et al. , 2000)。
抑制消减杂交 ( Supp ression subtractive hybridization, SSH) 技术 (D iatchenko et al. , 1996) 是一
种比较和分离不同细胞系、不同组织或同一细胞系同一组织在不同条件下差别表达基因的方法 , 用于
分离不同器官组织之间、个体不同发育阶段以及受外界因子作用而差异表达的基因等方面的研究。目
前 SSH技术在植物上的应用主要包括两个方面 (孙常青 等 , 2007) , 一方面涉及植物的生长发育及
组织特异性研究 ; 另一方面 , 在植物抵抗各种生物和非生物胁迫的研究中 , SSH技术用于分离生物和
非生物诱导表达的相关基因。
本研究旨在通过 SSH技术 , 分离获得在辣椒恢复系中特异表达、与 CMS育性恢复基因相关的
cDNA片段 , 从中筛选出与育性恢复相关的基因 , 通过基因功能注释及分类分析 , 初步了解辣椒 CMS
育性恢复涉及基因的功能、种类及数量 , 为恢复系相关基因的表达特性分析、功能鉴定以及揭示辣椒
CMS育性恢复的分子机理奠定基础。
1　材料与方法
111　试验材料
以辣椒细胞质雄性不育系 23A、121A及其相应的近等基因恢复系 23C、121C为试验材料 , 分别
作为构建消减文库的驱动方 ( driver) 和试验方 ( tester)。23A和 23C由早熟甜椒自交系转育而成 ,
单果质量 150 g左右 , 纵径约 10 cm, 横径 7 cm; 121A和 121C是从湖南地方品种 ‘伏地尖 ’中选出
的自交系转育而成 , 单果质量 40 g左右 , 纵径约 15 cm, 横径 3 cm。两份不育系均是以 8907A (沈火
林 , 1994) 为不育源经连续回交 7代以上转育成的 100%不育的不育系 , 两份不育系的细胞质来源完
全相同。恢复系是由 8907A ב大金条 ’ (含恢复基因 , 为单基因显性遗传 ) 组合再与 23、121号自
交系连续回交 6代以上转育而成 , 两份恢复系与对应的不育系细胞质均来源于 8907A , 细胞核中除了
恢复基因位点以外其余遗传背景完全相同。不育系与相应的恢复系为近等基因系。2008年春季在中
国农业大学上庄实验站大棚内常规种植。在开花期取花瓣已开始变白的花蕾 , 剥取花药立即用液氮冷
冻并在 - 80 ℃保存。
112　总 RNA的提取与 m RNA的分离
分别取每份材料的恢复系和不育系花药 , 液氮研磨 , 采用 Trizol试剂 (中国普博欣公司 ) 提取总
RNA。然后分别将两份材料的不育系 ( 23A、121A ) 和恢复系 ( 23C、121C) 的总 RNA等量混合 ,
按照 polyATractÓ mRNA isolation system kit (美国 Promega公司 ) 操作说明书分离 mRNA , 1%的琼脂糖
凝胶电泳检测。
113　抑制消减杂交 ( SSH)
抑制消减杂交依照 PCR2Select cDNA Subtraction Kit (美国 Clontech公司 ) 操作说明书进行。以辣
椒细胞质雄性不育恢复系为消减杂交的试验方 , 不育系作为驱动方。分别取 2μg mRNA为起始量 ,
经过 cDNA双链合成 , R saⅠ酶切消化 , 两端连接特殊接头 , 正反向两次消减杂交和两次选择性 PCR
扩增后 , 富集了大量差异表达基因片段。
114　消减 cD NA文库构建及差异筛选
将 SSH第 2次 PCR产物纯化后 , 与 pGEM 2T Easy载体 (美国 Promega公司 ) 连接。连接产物用
热激法转化到 E1coli DH5α感受态细胞 (中国天根公司 ) 中 , 在氨苄青霉素平板上进行阳性克隆筛
选。
挑取白斑菌落在氨苄青霉素液体培养基中 37 ℃振荡过夜培养 , 用巢式引物 1 (5′2TCGAGCGGC2
CGCCCGGGCAGGT23′) 和 2R ( 5′2AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT23′) 进行 PCR, 2%的琼脂糖凝胶电
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泳检测。PCR产物进行点阵膜杂交 , 分别以正向消减杂交 cDNA和反向消减杂交 cDNA为探针 , 差异
筛选探针用地高辛标记 , 与高密度点阵膜杂交 , 杂交方法按照美国罗氏公司地高辛核酸标记指示系统
试剂盒进行。
115　差异表达基因测序与序列分析
点阵膜杂交后获得的阳性克隆 , 送到北京三博远志生物技术有限责任公司测序 , 以 SP6为测序引
物 , 测序结果去除载体和接头序列 , 得到每个克隆的 EST序列。将所有的 ESTs在 NCB I的网站上进
行 BLAST比对 , 比对结果按 M IPS分类法 , 将比对结果 E值低于 1e205的 ESTs进行功能分类分析。
2　结果与分析
211　总 RNA与 m RNA的检测
不育系和恢复系的总 RNA与 mRNA经 1%琼脂糖凝胶电泳检测 (图 1) , 总 RNA集中在 18S与
28S区域 , 且二者条带的亮度比值接近 2 ∶1, 表明其完整性好 , 降解甚微 , 可进一步用于提取 mR2
NA。纯化的 mRNA呈现弥散条带 , 且在 18S与 28S处有隐约主带 , 说明 mRNA质量良好 , 可用于构
建文库。
图 1　辣椒 CM S恢复系和不育系花药总 RNA ( A) 和 m RNA ( B) 的电泳检测
M1: DL5000 DNA marker; 1: 23A; 2: 121A; 3: 23C; 4: 121C; 5: 恢复系 ; 6: 不育系 ; M2: 100 bp DNA ladder。
F ig. 1　Gel electrophoresis for check ing the qua lity of tota l RNA ( A) and m RNA ( B) extracted from an ther tissue of pepper
M1: DL5000 DNA marker; 1: 23A; 2: 121A; 3: 23C; 4: 121C; 5: restorer line; 6: CMS line; M2: 100 bp DNA ladder.
212　SSH结果分析
抑制消减杂交第 2次 PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上的检测结果如图 2所示 , 试剂盒中提供对照骨
胳肌第 2次消减 PCR产物与对照骨胳肌 marker完全吻合 , 说明 PCR扩增体系是可靠的。正向消减产
物经过两次 PCR后扩增出较短的弥散带 , 且有明显主带出现 , 而未消减产物扩增出较长的弥散带 ,
主带不清晰 , 说明组成性表达的基因已经进行了很好的均衡和消减 , 达到了去除高丰度基因 , 大量富
集恢复基因诱导表达的 cDNA片段的目的。
213　差异筛选消减 cD NA文库构建
随机挑取消减文库中阳性克隆 , 利用巢式引物进行 PCR, 2%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图 3所
示 , 获得克隆片段主要集中于 200～1 000 bp范围内 , 符合建库要求。对获得的 PCR阳性克隆片段进
行高密度点阵膜杂交 ( Zheng et al. , 2004) , 可以与正向消减探针杂交 , 不能与反向消减探针杂交 ,
即正向杂交点信号强于反向杂交点信号的克隆就是差异表达基因 , 对应杂交点信号强度相同或反向杂
交信号强于正向信号的视为假阳性克隆 (图 4)。通过两个标记探针的两次重复杂交 , 最后从 461个
克隆中选定了 282个具有差异表达的阳性克隆。
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214　序列分析
将通过差异筛选消减 cDNA文库得到的 282个阳性克隆全部测序 , 最后得到 269个 EST序列。利
用 Stackpack p rogram进行 EST cluster分析 , 269个 EST总共代表了 175个 Unique ESTs, 其中包括 139
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个 singletons和 36个 contigs。在 NCB I上进行 BLAST比对 , 比对结果中 E值低于 1e205的 ESTs被视为
已知基因 , 共 120个 , 占全部 EST的 6816% , 包括 17个未知功能基因和 103个已知功能基因。与其
他物种同源性较低 , 或者没有有意义的比对结果的 ESTs所代表的可能是新基因 , 共 55个 , 占
3114%。在这 120个已知基因中 , 包括了一些已经报道的与花粉发育相关的基因 , 如花粉变应原
(pollen allergen Cro s 1) (Lee et al. , 2008)、花同源异型蛋白 ( floral homeotic p rotein) ( Kush et al. ,
1993)、果胶甲酯水解酶 (pectin methylesterase) (Bosch et al. , 2005) 等 , 在这一定程度上证明了所
构建消减文库的可靠性。这些同源基因中 , 4516%来自茄科植物 (表 1) , 1416%来自辣椒 , 2110%
来自拟南芥 , 915%来自烟草。
表 1　部分测序克隆的 BLAST结果
Table 1　BLAST search results of som e sequenced ESTs
克隆
Clone No.
长度 / bp
Length
同源比对结果
Result
来源
Source
E值
Expect
TA136 594 过敏反应帮助蛋白 Hypersensitive response assisting p rotein Capsicum annuum 2e286
TA143 450 胞溶质蛋白 Cyclophilin Capsicum annuum 7e249
TA216 264 泛素结合蛋白 Ubiquitin2conjugating p rotein Capsicum annuum 2e204
TA253 490 硫氧还蛋白过氧化物酶 Thioredoxin peroxidase Capsicum annuum 4e270
TA272 351 泛素结合酶 Ubiquitin2conjugating enzyme 8 Capsicum annuum 2e263
TA316 340 超氧化物歧化酶 Putative Cu /Zn superoxide dismutase Capsicum annuum 2e227
TB5 289 谷酰胺合成酶 Glutam ine synthetase gln123 Capsicum annuum 3e248
TB21 417 腺苷甲硫氨酸合成酶 Putative S2adenosylmethionine synthetase Capsicum annuum 6e265
TF32 329 延长因子 12α Elongation factor 12alpha Capsicum annuum 6e208
30 339 谷胱甘肽过氧化物酶 Putative glutathione peroxidase Capsicum chinense 2e218
TA134 308 核糖体蛋白 60S R ibosomal p rotein L37a Capsicum chinense 4e219
TA213 296 谷胱甘肽转移酶 Glutathione S2transferase 12 Capsicum chinense 2e281
TC1 574 谷胱甘肽转移酶 Glutathione S2transferase /peroxidase Capsicum chinense 8e258
TE5 250 根瘤相关蛋白 Tumor2related p rotein Solanum lycopersicum 7e208
TF2 461 胞浆苹果酸脱氢酶 Cytosolic malate dehydrogenase Solanum lycopersicum 4e231
TG46 353 脱氢酶 Putative dehydrogenase Solanum lycopersicum 4e243
TH5 493 ATP酶蛋白脂质亚基 Vacuolar p roton ATPase p roteolip id subunit Solanum lycopersicum 3e229
TA22 282 真核翻译起始因子 Eukaryotic translation initiation factor 5A22 Solanum lycopersicum 7e232
21 302 酸性磷酸酶 Probable pectate lyase P59 p recursor Solanum lycopersicum 7e229
TA219 443 七跨膜结构域蛋白 Seven2transmembrane2domain p rotein 1 Solanum lycopersicum 1e230
TA271 273 142323蛋白 142323 p rotein Solanum lycopersicum 2e241
TB4 557 真核类型碳酸酐酶 C家族蛋白 Eukaryotic2type carbonic anhydrase fam ily p rotein Solanum lycopersicum 6e260
TE25 654 腺苷甲硫氨酸脱羧酶 S2adenosylmethionine decarboxylase Solanum lycopersicum 4e2110
TF27 406 聚合蛋白 Putative gag2pol polyp rotein Solanum lycopersicum 2e218
TG47 483 β2葡萄糖苷酶 Beta2glucosidase 08 Solanum lycopersicum 4e231
TA162 542 水通道蛋白 Sim ilar to aquaporin Solanum lycopersicum 2e272
TA166 548 抗程序性细胞死亡蛋白 Putative anti2PCD p rotein Solanum lycopersicum 2e214
TA267 430 细胞壁转移酶 Cell wall invertase Solanum lycopersicum 4e231
TH6 522 EF家族蛋白 EF hand fam ily p rotein Solanum dem issum 6e220
TA15 513 豌豆球蛋白 Putative vicilin Solanum dem issum 1e225
TA281 403 BR I1蛋白 BR I1 p rotein Solanum tuberosum 7e240
TD4 291 倍半萜环化合成酶 Vetisp iradiene synthase Solanum tuberosum 2e221
TD7 332 脂肪氧合酶 132lipoxygenase Solanum tuberosum 2e254
TE38 533 核糖体蛋白 R ibosome2associated p rotein p402like Solanum tuberosum 3e261
TG19 918 抗菌肽 Snakin21 Solanum tuberosum 8e230
TG20 314 酸性转化酶 Acid invertase Solanum tuberosum 6e234
TG8 475 核糖体蛋白 60S R ibosomal p rotein L7A2like Solanum tuberosum 1e262
46 676 细胞质葡糖磷酸变位酶 Phosphoglucomutase, cytop lasm ic Solanum tuberosum 4e2117
TA217 311 核糖体蛋白 60S R ibosomal p rotein L102like p rotein Solanum tuberosum 3e253
TA214 432 矮牵牛发芽花粉 NH20 Petunia germ ination pollen NH20 Petunia ×hybrida 1e224
TA280 296 矮牵牛发芽花粉 NH19 Petunia germ ination pollen NH19 Petunia ×hybrida 5e226
TC12 323 矮牵年牛芽花粉 D7 Petunia germ ination pollen D7 Petunia ×hybrida 8e215
TD16 400 花同源异型蛋白 Floral homeotic p rotein Petunia ×hybrida 1e258
TD29 665 β2半乳糖苷酶前体 Beta2galactosidase 2 p recursor Petunia ×hybrida 2e2107
TA228 207 转录因子 DEF M andragora autum nalis 4e231
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215　功能分类
将视为已知基因的 103个 ESTs按 M IPS功能
分类法 (师红雯和黄原 , 2006) 将其分为 14大
类 , 包括基础代谢、胁迫应答、蛋白活性、转运、
翻译、发育、信号转导等 (表 2) , 参与到植物细
胞生命活动的各个方面。其中 , 参与基础代谢的
ESTs最多 , 共 15个。β2半乳糖苷酶前体、胞浆
苹果酸脱氢酶、细胞质葡糖磷酸变位酶等参与了
碳水化合物的代谢过程 ; 羧酸酯酶、磷酸二酯酶
等参与了脂质代谢 ; 谷氨酸脱羧酶、谷胱甘肽转
移酶等参与了蛋白代谢。参与胁迫应答的 ESTs有
11个 , 包括对冷害、热害、干旱、盐胁迫等的胁
迫应答反应。有 5个 ESTs参与了植物发育过程 ,
涉及花发育 ,胚胎发育以及器官发育。8个转运
表 2　103个 ESTs功能分类及比例
Table 2　Percen tage d istr ibution of the isola ted 103 ESTs
ba sed on the functiona l cla sses
功能分类 Functional class 数量 Number 比例 /% Percent
基础代谢 Primary metabolism 15 1416
胁迫应答 Stress response 11 1018
蛋白活性 Protein activity 10 917
翻译 Translation 9 817
转录 Transport 8 718
发育 Development 5 419
蛋白结合 Protein binding 5 419
转运 Transcrip tion 4 319
蛋白折叠 Protein folding 3 219
信号转导 Signal transduction 3 219
细胞命运 Cell fate 2 119
其它 O thers 6 518
未知功能 Function unknown 8 718
未找到 Not found 14 1316
因子涉及质子转运 , 糖转运 , 脂质转运、蛋白转运、离子转运等。另外 , 有 8个 ESTs生物学功能未
知 ; 14个 ESTs与拟南芥数据库没有匹配结果。
3　讨论
辣椒 CMS类型已鉴定出有关的线粒体基因 ( Kim et al. , 2007) , 但相关的核育性恢复基因的分
离克隆研究较少 (刘忠松 等 , 2001) , 本研究从辣椒 CMS育性恢复相关基因入手 , 利用 SSH技术分
离辣椒 CMS育性恢复相关 ESTs, 构建辣椒 CMS育性恢复相关 cDNA文库 , 为进一步对辣椒育性恢复
相关基因进行深入研究奠定基础。同时 , 试验材料中不育系与相应的恢复系为近等基因系 , 这在理论
上保证了获得的差异表达基因仅与恢复基因位点有关。
综合整个消减 cDNA文库分析 , 可以看到雄性不育恢复基因诱导表达的相关基因涉及花粉发育、
信号传递、转录调控、基础代谢以及保护机制等多个方面。在获得的 ESTs中 , D EF IC IEN S (D EF )
为植物花器官发育 B类基因 , 控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育 , 属于 MADS2box基因家族 , 编码转
录因子。这些基因的突变能导致花瓣转变为萼片 , 雄蕊转变为心皮。MADS2box是一个保守性很强的
DNA结合结构域 , 在植物花器官发育中 MADS2box蛋白基因起着非常重要的作用 ( Irish, 2003)。蛋
白质可逆磷酸化是细胞内普遍存在的一种共价修饰生理调节反应 , 受蛋白激酶和蛋白磷酸酶的调节。
蛋白磷酸酶是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子 , 与蛋白激酶相对应
存在 , 共同构成了磷酸化和去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统 , 是真核细胞信号转导的共同
通路 , 其动态变化几乎涉及从胚胎发育到个体成熟的所有过程。雌蕊中发出的化学信号、电信号或物
理信号等诱导花粉萌发、花粉管生长 , 调节花粉管伸长的方向性 , 这一过程中蛋白质可逆磷酸化起着
重要的信号转导作用 (Hardin &Wolniak, 2001)。越来越多的证据表明 , 蛋白磷酸酶也是花粉萌发和
花粉管极性顶端生长所必需的 ( Gup ta et al. , 2002) , 同时在花粉和柱头细胞之间的识别 , 胞外信号
转化为胞质信息过程中起着重要的信号转导作用 (Obermeyer et al. , 1998)。另外 , 在筛选到的 EST
中 , 频繁出现与矮牵牛花粉萌发 (petunia germ inating pollen, PGP) 同源性很高的序列 , 包括 NH20、
NH19、D7等多种类型 , 这些类型在矮牵牛花粉萌发前后以及不同器官上的转录本丰度差别很大
( Guyon et al. , 2000) , 推测其可能在花粉发育、花粉管伸长以及花粉和柱头的识别中担当不同角色。
同时 , 在试验中还筛选到了许多在花粉发育过程中没有报道的 ESTs, 如抗性蛋白 , 细胞程序性死亡
因子、豌豆球蛋白、跨膜结构域蛋白等。而试验中分离的许多功能未知的基因可能是一些新的与花粉
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发育有关的基因 , 有待后续进行深入研究。
植物雄配子的发育是一系列有序的生理生化变化过程 , 是基因间相互作用的结果。在这一过程
中 , 这些基因是如何相互作用的 , 到底哪些基因起主导作用 , 需要对每一个基因的功能做深入细致的
研究。这些恢复基因诱导 EST序列的获得 , 为今后研究育性恢复关键基因打下了良好的基础。
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