全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (11) : 1671 - 1675
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 08 - 11; 修回日期 : 2008 - 10 - 10
基金项目 : 江苏省高校自然科学基金重点项目 (04KJA210158)3 E2mail: mmm iao@yzu1edu1cn
一个辣椒肌醇半乳糖苷合成酶同源基因全长 cDNA
的克隆与低温表达分析
缪　珉 3 , 李　娜 , 任旭琴 , 张宗东 , 程　皓 , 曹碚生
(扬州大学园艺与植物保护学院 , 江苏扬州 225009)
摘 　要 : 采用 RT2PCR结合 RACE技术 , 从低温处理的辣椒 (Capsicum annuum L. ) 品种 ‘苏长红 ’
叶片中克隆得到一个肌醇半乳糖苷合成酶同源基因 (GS ) 的 cDNA序列 ( GenBank登录号 : EF566470) , 全
长 1 444 bp, 推断其编码 336个氨基酸。序列分析表明该基因与其他高等植物的 GS基因具有较高的同源性。
该基因常温下在辣椒各组织中均无表达 , 经 4 ℃或 10 ℃处理 6 h后在叶片中开始表达 , 而茎和根系中均不
表达。Southern杂交结果表明辣椒基因组中还存在其他 GS同源基因。
关键词 : 辣椒 ; 肌醇半乳糖苷合成酶 ; 低温处理 ; 克隆
中图分类号 : S 64113　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 1121671205
C lon ing , Character iza tion and Expression of a Puta tive Ga lactinol Syn tha se
Gene from Cold Stressed Pepper ( C apsicu m annuu m L . )
M IAO M in2m in3 , L INa, REN Xu2qin, ZHANG Zong2dong, CHENG Hao, and CAO Bei2sheng
(School of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou U niversity, Yangzhou, J iangsu 225009, Ch ina)
Abstract: Full length cDNA sequence of a putative galactinol synthase gene ( GS ) ( GenBank No:
EF566470) was cloned from cold2stressed pepper (Capsicum annuum L. ‘Suchanghong’) leaves using RT2
PCR and rap id amp lification of cDNA ends (RACE). The cDNA consists of 1 444 bp encoding a putative p ro2
tein of 336 am ino acids. Phylogenetic analysis revealed that this gene is high homologous to reported GS genes
of other p lants. RT2PCR analysis showed that the mRNA s of this gene was induced in pepper leaves after 4 ℃
or 10 ℃ cold2treatment for 6 h, but was not accumulated in cold2stressed stem s and roots, no mRNA of this
gene can be detected in pepper tissues under normal temperature. Southern blot analysis indicated that there
may be other GS fam ily gene cop ies in the pepper genome.
Key words: pepper; galactinol synthase; cold stress; cloning
辣椒冬季栽培中常遭遇低温逆境 , 造成减产降质。目前关于低温胁迫后辣椒形态及生理生化反应已
有大量报道 (Tarchoun et al. , 2003; 郁继华 等 , 2005; 张国斌和郁继华 , 2006; 任旭琴 等 , 2007)。
低温胁迫后植物体内常会积累一些可溶性小分子 , 如脯氨酸、甘露醇、寡糖等 , 以增加植物细胞
的渗透压 , 提高耐低温能力。棉子糖家族寡糖 ( raffinose fam ily oligosaccharides, RFO s, 主要为棉子糖
和水苏糖 ) 是上述可溶性小分子中的一类。有研究表明 , 一些体内不含 RFO s或含量极低的植物 , 受
到低温或其他逆境胁迫后 RFO s迅速积累 , 植物的抗逆性也随之增强。肌醇半乳糖苷合成酶 ( galacti2
nol synthase, GS) 是植物体内合成 RFO s的关键酶。目前有一些关于该酶受逆境胁迫表达上升的报
道 , 如低温处理后菜豆种子中 GS的活性迅速提高 (L iu et al. , 1998) ; 拟南芥经干旱、高盐和低温
胁迫后体内会积累大量的 GS ( Taji et al. , 2002) ; 对番茄幼苗进行低温和干燥处理 , 可造成该酶
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mRNA的积累 (Downie et al. , 2003) ; 在水稻 ( Takahashi et al. , 1994)、苜蓿 ( Cunningham et al. ,
2003) 和匍匐筋骨草 (Bachmann et al. , 1994) 等植物中也存在类似的生理现象。
为了验证在辣椒中是否也存在上述类似低温适应机制 , 探索通过提高 GS基因的表达来增强其耐
寒性的可能性 , 作者利用 RT2PCR结合 RACE ( rap id amp lification of cDNA ends) 技术 , 从低温胁迫后
的辣椒叶片中克隆到一个 GS同源基因的全长 cDNA , 并对其在低温下的表达规律进行了分析。
1　材料与方法
111　植物材料和低温处理
以辣椒 (Capsicum annuum L. ) ‘苏长红 ’品种为材料 (江苏省农业科学院蔬菜研究所提供 ) ,
幼苗于 28 ℃ /22 ℃ (昼 /夜 ) 温度下正常生长 , 光照 14 h。幼苗 5～6片真叶时于中午 12: 00开始进
行 4 ℃和 10 ℃的低温处理 , 对照幼苗在 28 ℃ /22 ℃ (昼 /夜 ) 下继续生长。分别剪取常温和低温处
理后 0、1、3、6、12、24、48和 72 h的第 2真叶、茎和根 , 液氮中保存备用。
112　辣椒 GS同源基因 cD NA片段的克隆和分析
以经过低温处理 24 h的辣椒叶片为材料 , 液氮中研磨 , 按照 Q IAGEN公司的 RNeasy Plant M ini
Kit说明书提取总 RNA, - 80 ℃保存备用。根据 GenBank中已发表的番茄 (AF311943 )、黄瓜
(AY237112)、拟南芥 (NM _118758) GS基因的 cDNA序列 , 在同源区域设计 5′端引物 : 5′2GGATAT2
GGGAGTTTGTGGAGTA23′和 3′端引物 : 5′2CCACCATTTCTTCACTAGCAT23′。以总 RNA 为模板 , RT2
PCR反应参照 Promega公司的 AMV Reverse Transcrip tase说明书进行。PCR反应体系为 50μL, 反应条
件为 94 ℃预变性 3 m in, 94 ℃变性 45 s, 50 ℃复性 45 s, 72 ℃延伸 70 s, 40个循环 , 72 ℃延伸 10
m in。PCR产物测序后用 DNAman软件与其他植物 GS基因的 cDNA序列进行同源性比对。
113　辣椒 GS同源基因全长 cD NA序列的克隆和分析
根据上一步骤获得的 cDNA片段序列 , 设计 5′端引物 : 5′2CTCCATGGTTTTGACCCCGCTGCACAG2
3′和 3′端引物 : 5′2CCAGATGGTTATTTCTATGCGGTGATGG23′, RACE反应条件按照 Clontech公司 SM2
ARTTM RACE cDNA Amp lification Kit说明书进行。PCR产物测序后 , 用 Clustalx软件对由其序列推导
的氨基酸序列和 GenBank中已发表的其他植物的 GS氨基酸序列进行聚类分析。
114　Southern杂交
CTAB法提取辣椒基因组 DNA, 分别用 EcoRⅠ和 EcoRⅤ酶切 , 于 1%琼脂糖凝胶上分离 , 转移
到尼龙膜 , 80 ℃烘烤 015 h固定。以基因组 DNA为模板 , 根据 cDNA序列设计 5′端引物 : 5′2GAT2
GATCTCTTGAAGACCCTC23′和 3′端引物 : 5′2TCTGTGGAATAGGGGAGCA23′, PCR法获取探针。探针
的标记按照 Roche公司 PCR D IG Probe Synthesis Kit说明书进行 , 杂交、洗膜、显色按照 Roche公司
D IG W ash and B lock Buffer Set说明书进行。
115　RT2PCR分析低温胁迫后辣椒 GS同源基因的表达
RT2PCR法分析低温处理后 GS同源基因在辣椒各组织中的表达情况 , 引物和反应条件同 112。
2　结果与分析
211　辣椒 GS同源基因全长 cD NA的克隆
以低温处理的辣椒叶片总 RNA为模板 , 以 112中的一对引物进行 RT2PCR 反应 , 得到 505 bp的
片段。将此片段序列与 GenBank中其他植物的 GS基因进行比对 , 发现有较高的同源性。进一步以该
片段为基础利用 RACE技术获得辣椒 GS同源基因的全长 cDNA序列。以低温处理的辣椒叶片总 RNA
为模板 , 经 5′端与 3′端 RACE2PCR分别扩增出 939 bp和 900 bp的片段 , 与上述 505 bp片段进行序列
拼接 , 获得一条 1 444 bp的全长 cDNA序列 (图 1) , GenBank登录号为 EF566470。
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图 1　辣椒 GS同源基因全长 cD NA序列
单下划线表示起始密码子 , 虚线表示 RACE引物结合区 , 双下划线表示终止密码子。
F ig. 1　The full length cD NA sequence of the puta tive pepper GS gene
Initial codon is underlined with a mongline; Regions underscored with dashed line were used for
RACE2PCR p rimer design; Stop codon is indicated by a double underline.
212　辣椒 GS同源基因的序列分析
推导该 cDNA的氨基酸序列 , 其开放阅读框为 136 - 1 144 bp, 编码 337个氨基酸。将该序列与
GenBank中其他植物的 GS基因进行同源性比对 , 发现与番茄 ( EF566470)、黄瓜 (AY237112)、大
豆 (AY126715)、豌豆 (AJ243815 ) GS cDNA 序列的同源性分别达 57123%、54137%、61108%和
61122% , 氨基酸序列的同源性分别为 61183%、70192%、74148%和 74126%。
　　用 Clustalx软件对该 cDNA推导所得的氨基酸
序列和 GenBank中的其他植物的 26个 GS氨基酸
序列进行聚类分析 , 结果表明 GS基因在拟南芥、
玉米、甜瓜、匍匐筋骨草等植物中均以多种形式
存在 , 且同种植物中不同形式的 GS 序列差异较
大 , 常被归入不同的聚类组。本试验克隆的基因
与拟南芥 GS6及小盐芥 GS 的序列相似度高 , 而
与同科的番茄 GS序列相差较大 (图 2)。
213　GS基因在辣椒基因组中的拷贝数
以辣椒基因组 DNA为模板 , 用 114中的引物
扩增得到一段长度为 679 bp包含内含子序列的片
段 , 采用地高辛标记获得探针。以在探针序列中
没有酶切位点的 EcoR Ⅰ和含有一个酶切位点的
EcoRⅤ两种限制性内切酶对辣椒基因组进行酶
切 , 杂交结果均显示有多个条带 (图 3)。
图 3　辣椒基因组 D NA的 Southern印迹分析
1: 基因组 DNA EcoRⅠ酶切 ; 2: 基因组 DNA EcoRⅤ酶切。
F ig. 3　Southern blot ana lysis of pepper genom e D NA
M: DNA marker DL 15000; 1: Genome DNA digested with EcoRⅠ;
2: Genome DNA digested with EcoRⅤ.
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图 2　辣椒 GS同源基因氨基酸序列与其他植物 GS氨基酸序列聚类分析
F ig. 2　Phylogenetic ana lysis of am ino ac id sequences of the puta tive pepper GS gene w ith other reported GS genes
214　低温胁迫下 GS同源基因在辣椒各组织的表达
由图 4可知 , 未经低温胁迫的以及经 4 ℃和 10 ℃胁迫 3 h之内的辣椒叶片中无 GS同源基因表
达 , 低温胁迫 6 h后该基因开始在叶中表达 , 一直能持续至低温胁迫后 72 h。
无论低温胁迫与否 , GS同源基因在辣椒茎和根中均无表达 (结果未显示 )。
图 4　RT2PCR分析低温胁迫后辣椒叶片中 GS同源基因的表达
F ig. 4　RT2PCR ana lysis of GS fam ily gene expression in pepper leaves after cold stress
M: Generuler 100 bp DNA ladder p lus.
3　讨论
GS是催化植物体内 RFO s生物合成的第一步。本试验中克隆的辣椒 GS同源基因受低温诱导而表
达 , 表明辣椒体内可能存在着低温胁迫后 RFO s积累的适应机制 , 这为进一步研究辣椒体内 RFO s的
生理功能及通过生物技术提高辣椒的耐寒性提供了线索。当然 , 该基因的表达产物是否确有 GS活性
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　11期 缪 　珉等 : 一个辣椒肌醇半乳糖苷合成酶同源基因全长 cDNA的克隆与低温表达分析 　
目前尚未经过功能验证 , 将该基因克隆到原核表达载体中进行功能表达验证的工作目前正在进行中。
本试验结果表明 , 低温胁迫后该基因仅在叶片中表达 (嫩叶与老叶均有表达 , 结果未显示 ) , 而茎和
根系中均无表达 , 这种组织表达特异性的生理意义及该机制与其他植物耐寒机制之间的关系有待进一
步研究。
GS基因在植物体内常以多种形式存在 , 如在拟南芥基因组中发现有 7个 GS基因 (图 2)。Taji
等 (2002) 研究表明 , 拟南芥 GS1和 GS2受干旱和盐胁迫诱导表达 , 但不被低温诱导 , 而 GS3被低
温诱导 , 但对干旱和盐胁迫无反应。聚类图中与本文克隆的基因最相似的小盐芥 GS基因受盐胁迫后
表达 (W ang et al. , 2004) , 该基因在低温胁迫下是否表达并不清楚 , 同时与辣椒 GS同源基因序列较
相似的拟南芥 GS6低温胁迫下是否表达也未见报道。Downie等 ( 2003) 发现番茄幼苗在失水和低温
胁迫后 GS表达上升 , 但该基因序列与本文获得的辣椒 GS同源基因相似度并不高 , 考虑到辣椒和番
茄属于同一个科 , 可以判断这两个基因并不属于同一类 GS基因。植物体内的各种 GS基因对各种逆
境胁迫的反应相当复杂 , 同一类 GS基因可以对不同的逆境胁迫作出反应 , 而不同的 GS基因也可以
受同一种胁迫诱导表达。本文所获得的基因是否会被其他逆境胁迫诱导表达 , 值得进一步研究。
辣椒 GS同源基因的 Southern杂交结果呈现出多个条带 (图 3) , 因为本试验所使用的探针序列包
含有基因编码区 , 所以该杂交结果可能表明 GS基因在辣椒基因组以多拷贝形式存在 , 也可能表明辣
椒基因组中存在其他与本试验中所克隆的基因同源性较高的序列 , 如其他形式的 GS同源基因。
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