全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (1) : 143 - 146
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 05 - 25; 修回日期 : 2006 - 07 - 22
基金项目 : 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wangxw@mail1caas1net1cn)
辣椒 C基因全长序列比较分析
王　岩 1, 2 , 张宝玺 1 , 张延国 1 , 张国裕 1 , 王立浩 1 , 徐有明 2 , 王晓武 13
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 华中农业大学园艺林学学院 , 武汉 470070)
摘 　要 : 辣 /甜椒 C基因测序比对后证实了甜椒 C基因 5′端约 689 bp的缺失可能是造成其辣味缺失的
原因。牛角形甜椒 ‘0538’的 C基因不存在这一缺失 , 却在编码区第 40位碱基处有一个 G到 A的突变 ,
可能导致信号肽内第 14位疏水性天冬氨酸变为亲水性天冬酰胺 , 不能完成辣椒素的合成 , 最终辣味缺失。
辣 /甜椒品种共有长片段 Catf2基因 , 与 C基因在核苷酸序列上有 8819%的相似性。
关键词 : 辣椒 ; 辣椒素合成酶 ; 序列分析 ; 信号肽
中图分类号 : S 64113 　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0120143204
Com par ison and Ana lysis of C Gene from D ifferen t Pepper Accession s
WANG Yan1, 2 , ZHANG Bao2xi1 , ZHANG Yan2guo1 , ZHANG Guo2yu, WANG L i2hao1 , XU You2m ing2 , and
WANG Xiao2wu13
(1 Institu te of V egetables and F low ers, Chinese A cadem y of A gricultural Sciences, B eijing 100081, China; 2 College of Horticulture
and Forestry, Huazhong A gricultura l U niversity, W uhan 430070, Ch ina)
Abstract: Deletion of 689 bp in 5′2term inal of the C gene locus caused an absence of pungency in sweet
pepper after sequencing and alignment. A C gene fragment from non2pungent oxhorn pepper 0538 was amp li2
fied, which does not have the deletion, but a mutation from G to A at 40 bp in the coding region. This muta2
tion led to the change of an am ino acid from hydrophobic aspartic acid to hydrophilic asparaginate in signal
pep tide, which m ight cause the loss of the function of the C gene and finally the pungency. U sing the same
p rimer pair, Ca tf2 gene from all used accessions was amp lified, which shares high sim ilarity about 8819%
with the C gene.
Key words: Pepper; Capsicum annuum L. ; Cap saicinoid synthetase; Sequence analysis; Signal pep tide
辣椒素不仅决定辣椒辣味 (Bennett et al. , 1968; Suzuki et al. , 2004) , 而且具有很多药理和生
理学活性 , 有很高的应用价值。W ebber (1911) 和 Boswell (1937) 曾报道辣味的缺失是由一个单一
的隐性 c (即 pun1) 基因控制 , 对所有其它的辣味相关基因具有上位作用。C基因是辣味有无的重要
调控子 (B lum et al. , 2002) , 与辣椒素合成过程中重要的乙酰基转移酶 (Charles et al. , 2005) 有
关。本研究利用美国康乃尔大学构建的载体 pB IAT3得到 C基因完整编码序列 , 比较了从辣椒、甜椒
和牛角形甜椒基因组 DNA中克隆的 C基因和 Catf2基因的结构 , 证实甜椒辣味的消失可能是 C基因
5′端 689 bp缺失的结果 , 发现牛角形甜椒 ‘0538’C基因没有缺失 , 但一个单碱基突变显著改变了编
码氨基酸的性质。
1　材料与方法
16个甜椒自交系、10个辣椒品种、2个牛角形甜椒品种和 6个 F1 微辣 (辣 ×甜 ) 品种均由中国
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农科院蔬菜花卉研究所提供。自交系甜椒 ‘051’, 辣椒 ‘0525’和牛角形甜椒 ‘0538’供克隆测序。
双元表达载体 pB IAT3由双元载体 pB I121改造而来 , 携带目的基因 C和 N PT2Ⅱ标记基因 , 启动
子为组成型 CaMV35S。克隆载体 pMD182T Vector、胶回收纯化试剂盒为 TaKaRa公司产品 ; 宿主菌
Ecoli TOP10、Taq DNA聚合酶及 DNA Marker购自北京天根科技有限公司。用 CTAB法提取叶片 DNA ,
用 C 基 因 特 异 引 物 CS2F ( 5′2CATTACCATCATCACTTGTTTCAG23′) 和 CS2R ( 5′2CATTTTGT2
TCGACTTTGTCTTTCTT23′) 进行 PCR扩增 , 95℃变性 3 m in, 58℃复性 50 s, 72℃延伸 80 s, 共 35个
循环。PCR产物经 115%琼脂糖凝胶电泳后 , 用胶回收试剂盒回收。将引物 CS2F和 CS2R对不同辣椒
品种扩增条带切胶回收 , 辣椒 0525长、短片段分别记为 C2P2L、C2P2S, 牛角形甜椒 0538的记为
38L、38S, 甜椒 052长片段记为 C2S, 参考 Choong2Jae等 (2005) 的引物 BF6 (5′2GAAAGATCCGAC2
CTCGTCAA23′) 和 BR8 (5′2TGACACCAATAAGTGGAGTGCT23′) 对辣椒 0525和甜椒 052的扩增 C基
因片段回收后分别记为 C2P2L2和 C2S2S。将回收产物连接于克隆载体 pMD182T Vector, 转化 E1coil
Top10菌株的感受态细胞 , 涂在含有 X2gal + IPTG +Amp的 LB平板上。经蓝白斑筛选和 PCR鉴定得
到重组质粒。取含有目的基因的重组质粒的阳性克隆 , 采用 AB I377全自动序列分析仪利用通用引物
进行测序 ; 每个片段均测定 3个独立完成的克隆 , 进行双向测序。序列同源性比较通过 BLAST完成。
核苷酸和氨基酸序列分析利用 DNAStar分析软件进行。
2　结果分析与讨论
211　C基因序列的获得
35S启动子下游短片段 : 5′2CCTTCGCAAGACCCTTCCTC23′和上游引物 CSF3对载体 pB IAT3进行测
序 , 据测序结果搜索 CD s的前后片段与 pB I121序列比对 , 确定完整开放阅读框为 1 323 bp (图 1)。
图 1　由测序结果推导的 1 323 bp开放阅读框 ( O RF)
方框中分别为起始子与终止子 , 斜体为 3′末端。
F ig. 1　O pen read ing fram e ( O RF) of 1 323 bp is deduced from sequenc ing
Initial and stop coden are boxed, 3′term inal are italic.
212　基因组 D NA的扩增结果
甜椒自交系和牛角形甜椒 0537为 1条带 , 辣
椒 2条带 , F1 微辣 (辣 ×甜 ) 2条带 , 牛角形甜
椒 0538为 2条带 (图 2, 表 1)。
213　C基因及 C a tf2基因核苷酸序列比对分析
C基因 cDNA全长 1 505 bp, 含 182 bp的 3′
端 , 编码区由 1 323个核苷酸组成。 图 2　引物 CS2F和 CS2R扩增辣椒和甜椒品种基因组 D NA
F ig. 2　PCR of genom ic D NA from d ifferen t pepper var ieties
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　1期 王 　岩等 : 辣椒 C基因全长序列比较分析 　
表 1　引物 CS2F和 CS2R对 36个品种辣椒和甜椒基因组 D NA扩增条带统计结果
Table 1　Result of PCR ana lysis of genom ic D NA from 36 pepper accession s by pr im er CS2F and CS2R
品种
Accession
片段 Fragment
L S
辣味
Pungency
果型
Shape
品种
Accession
片段 Fragment
L S
辣味
Pungency
果型
Shape
品种
Accession
片段 Fragment
L S
辣味
Pungency
果型
Shape
051 1 0 s La 0520 1 0 s La 0541 1 1 p Oh
052 1 0 s La 0521 1 0 s La 0542 1 1 p Oh
053 1 0 s La 0522 1 0 s La 0537 1 0 s Oh
054 1 0 s La 0523 1 0 s La 0538 1 1 s Oh
055 1 0 s La 0524 1 1 p Oh 0544 (F1) 1 1 sp Oh
056 1 0 s La 0525 1 1 p Oh 0546 (F1) 1 1 sp Oh
057 1 0 s La 0526 1 1 p Oh 0547 (F1) 1 1 sp Oh
058 1 0 s La 0527 1 1 p Oh 0548 (F1) 1 1 sp Oh
059 1 0 s La 0528 1 1 p Oh 0549 (F1) 1 1 sp Oh
0512 1 0 s La 0529 1 1 p Oh 0550 (F1) 1 1 sp Oh
0515 1 0 s La 0539 1 1 p Oh Z 1 0 s La
0516 1 0 s La 0540 1 1 p Oh X 1 1 p Oh
　　注 : L: 1 700 bp长片段 ; S: 1 400 bp短片段 ; 1: 有带 ; 0: 无带 ; s: 无辣味 ; p: 辣味 ; sp: 微辣 ; La: 灯笼形 ; Oh: 牛角形 ;
下标 F1 : F1 代 (辣 ×甜 ) ; Z: 中椒 5号 ; X: 湘椒 8号。
Note: L: Long fragment of about 1 700 bp; S: Short fragment of about 1 400 bp; 1: Owning a band; 0: No band in fragment tier; s: Non2
pungent; p: Pungent; sp: L ittle pungent in pungency tier; La: Lantern; Oh: Oxhorn in shape tier; Subscrip t F1 : F1 p rogency (pungent pepper
×non2pungent pepper) ; Z: Zhongjiao 5; X: Xiangjiao 8.
通过对辣椒 0525和牛角形甜椒 0538的 C基因及 AY819026序列分析 , 得到辣椒 C基因全长 1
672 bp, 含 384 bp内含子 , 其编码区 1 323 bp与载体 C基因编码区序列有 9818%的相似性 , 且有相
同的 3′末端。BF6和 BR8′对甜椒 C基因测序比对后证实了 5′端 689 bp缺失的存在 , 因上游引物 CS2F
位于该缺失处 , 所以 C基因条带缺失。
通过对辣椒 0525和甜椒自交系 051的长片段分析 , 认为它是辣椒 (Capsicum annuum L. ) 中与
乙酰基转移酶有关的 Catf2基因 , 与辣味无关 , 其功能有待于进一步研究。辣椒长片段全长 1 996 bp,
含 670 bp的内含子 , 其编码区 1 326 bp与 C基因编码区有 9211%的相似性 , 在 173处有 TAG 3个碱
基的缺失 , 在 572和 1 765处分别有 TGA和 ATA 3个碱基的插入。3′端差异较大 , 与 C基因相比有 3
处缺失 , 分别为 23、4和 28个碱基。同源长片段氨基酸序列与辣椒 C基因氨基酸有约 8819%的相似
性 (图 3)。甜椒长片段在内含子区较辣椒长片段有 15个碱基缺失 , 认为是广泛存在的。
图 3　载体 C基因编码序列 , 辣椒 C基因 , 甜椒 C基因及长片段 ca tf2基因的结构示意图
F ig. 3　Schema tic d iagram of the com par ison of C gene from cod ing sequence in vector, pungen t pepper,
non2pungen t pepper and Ca tf2 gene
214　C基因及载体 C基因核苷酸与氨基酸序列同源性比较及功能分析
牛角形甜椒 0538C基因与辣椒 0525、AY819026及载体 C基因编码序列相比分别存在 8个、18个
和 9个核苷酸的差异 , 且都表现为碱基替代。碱基变异特征分析发现 , 相对于辣椒 0525, 4个核苷酸
变异中有 3处变异引起了氨基酸序列的变化 , 分别是 40位核苷酸的 G→A导致 14位天冬氨酸 →天冬
酰胺 , 572位核苷酸的 C→G导致 191位脯氨酸 →精氨酸 , 1 306位核苷酸 G→C的导致 436位缬氨酸
→亮氨酸。但 436位氨基酸的变化因与 CD s和 AY819026相同 , 认为是辣椒 0525的一个非功能性的
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变异 ; 其它碱基替换都是无义变异 , 未引起氨基酸的改变。相对于载体 C基因 , 80位 A→C导致 27
位赖氨酸 →苏氨酸 , 679位 G→C导致 227位谷氨酸 →谷氨酰胺 , 898位 A→G导致 300位苏氨酸 →丙
氨酸 , 1 099位 G→A导致 367位谷氨酸 →赖氨酸 , 这些都因辣椒 0525的相同变异而排除对辣味的影
响。同样 , 相对于 AY819026, 12、211、227、367位的氨基酸序列变化也可排除对辣味的影响。最
终发现基因编码区内的碱基替换 , C40→T40引起的 D14→N14或 A572→G572导致 H191→R191的变
化 , 可能造成了辣椒素合成酶活性的变化 , 从而影响辣椒素的合成 (表 2)。
表 2　不同辣椒品种基因组 D NA的 C基因及载体 C基因编码序列和 AY819026编码氨基酸序列的比较
Table 2　Com par ison of C gene am ino ac ids from d ifferen t pepper accession s, pB IAT3 and AY819026 d ifferen t ba ses
and an im o ac ids am ong d ifferen t C genes are ita lic and overstr ik ing
核苷酸序列
位点 Nucleotide
sequence
载体 C基因编
码序列 C gene
coding sequence
牛角形甜椒 0538
Oxhorn non2pungent
pepper 0538
辣椒 0525 (Cp s)
Pungent pepper
0525
AY81
9026
氨基酸序列
位点 Am ino acids
sequence
载体 C基因编码
序列 C gene coding
sequence
牛角形甜椒 0538
Oxhorn non2pungent
pepper 0538
辣椒 0525 (Cp s)
Pungent pepper
0525
AY81
9026
　34 G G G A 12 U U U I
　40 G A G G 14 D N D D
　80 A C C C 27 K T T T
572 A G C A 191 H R P H
631 C C C A 211 Q Q Q K
679 G C C G 227 E Q Q E
898 A G R G 300 T A A A
1 099 G A A G 367 E K K E
1 306 C C G C 436 L L V L
经 SOSU I预测 , 载体 C 基因第 1 ～14 个氨基酸为跨膜螺旋结构域 , 跨膜区氨基酸序列为
MAFALPSSLVSVCD , 属信号肽。牛角形甜椒 0538第 1～16个氨基酸为跨膜螺旋结构域 , 跨膜区氨基
酸序列为 MAFALPSSLVSVCNKS。辣椒 0525的 C基因和 AY819026跨膜区氨基酸序列与载体 C基因的
相同。信号肽 ( Signal pep tide) 是引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽 , 位于新合成肽链的 N
端 , 作用是使核蛋白体与内质网上的受体结合。牛角形甜椒 0538中 C基因的信号肽的变化恰是由 N
端疏水性 D (天冬氨酸 ) 变为亲水性 NKS (天冬酰胺 , 赖氨酸 , 丝氨酸 ) , 导致信号肽功能的丧失 ,
不能引导肽链进入内质网腔并运至靶器官 , 使辣椒素合成酶蛋白后期的加工不能完成继而导致辣味缺
失。因此 , 单碱基替换 G40→A40造成 14位氨基酸的改变可能是导致牛角形甜椒 0538中 C基因失去
功能 , 辣味消失并表现为甜椒的遗传基础。
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