全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1453—1458
Acta Horticulturae Sinica
辣椒 Me3基因介导抗根结线虫相关基因的 SSH分析
茆振川 ，谢丙炎 ，杨宇红 ，冯东昕 ，冯兰香 ，杨之为
( 西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌 712100； 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081)
摘 要：以辣椒 (Capsicum annuum L．)双单倍体 HDA149为试验材料 ，接种南方根结线虫 (Mel0ido—
gyne ineognita)12、24、36 h的根尖材料作为测验方 (Tester)，相应的未接种根尖材料作为驱动方 (Driv—
er)，构建一个南方根结线虫诱导Me3基因表达早期的抑制消减杂交 cDNA文库，通过高密度点阵膜杂交差
异筛选，获得了309条表达序列标签 (EST)。通过测序，除去重复序列共得到259条EST序列，在 Gen—
Bank上进行 BLAST分析 ，30个 EST片段未发现同源性基因，229个为具有同源性的已知基因，其中71个
为功能未知的基因。在显微观察和抗性相关 EST表达谱分析的基础上，推测在 Me3基因介导的不亲和互作
中，编码 NBS—LRR结构的抗病基因参与了寄主对根结线虫的识别，激发了过敏性坏死反应的信号基因
，
同时多种抗性相关的转录因子基因表达，使以代谢为基础的防御反应和保护机制发挥抗线虫作用。
关键词：辣椒；Me3基因；根结线虫；抑制性消减杂交
中图分类号：S 641，3 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2007)06—1453-06
Analysis of Pepper M e3 Gene Resistance to Root Knot Nematodes by SSH
MAO Zhen—chuan ，XIE Bing—yan ，YANG Yu—hong ，FENG Dong—xin
， FENG Lan—xiang ，and YANG
Zhi—wei
( Colege of Plant Protection，Northwest A&F University，Yangling，Shaanxi 712100。China： Institute of Vegetables 0nd
Flowers，Chinese Academy ofAgricultural Sciences，Beijing 100081，China)
Abstract：To investigate the early up—regulated expression gene profile in pepper line HAD149 induced
by root—knot nematode(RKN)Meloidogyne incognita，a forward subtracted cDNA library of pepper seedling
root tips was constructed using suppression subtractive hybridization(SSH)．The cDNA of pepper seedling
root tips inoculated with J2 RKN on 1 2，24 and 36 h were used as tester，and that from untreated root tips as
driver．Totaly 309 SSH cDNA fragments were selected with DIG Nonradioactive Nucleic Acid Labeling and
Detection System．Through the DNA sequencing，we got 259 ESTs．With the Blast，30 EST fragments didn’t
find homologous gene，229 had homologous genes，and among of them，7 1 fragments were function unknown
．
Base on the observing with microscope and the ESTs function analyzing，we putative that disease resistant
genes encode nucleotide binding／leucine—rich repeat(NBS—LRR)have a key rule to recognizes root knot
nematode，result in the signal transduction—related genes expressed，activate a suitable defensive response and
protection mechanism，it often including hypersensitive response(HR)and Systemic Acquired Resistance
(SAR)．In addition，al of these responses are base on the first and secondary metabolites．
Key words：Pepper；Me3 gene；Root—knot nematode；Suppression subtractive hybridization(SSH)
辣椒野生类型及其野生近缘种中有很多抗线虫材料，存在着多个抗根结线虫 (Meloidogyne spp．)
基因 (黄三文 等，2000)。通过辣椒双单倍体群体遗传分析发现，在 PM217和PM687中存在 5个抗
收稿日期：2007—04—17；修回日期 ：2007—06—25
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30671412，30270236)；科技部 ‘973’重大基础研究前期研究专项 (2004CCA05300)；‘十‘
一 五’国家科技支撑计划项 目 (2006BAD08A08)；农业公益性行业科研专项 (nyhyzx07-050)
}通讯作者 Author for correspondence(E—mail：xieby@mail．caas，net，cn)
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园 艺 学 报 34卷
线虫显性基因，其中Me1和Me3基因抗南方根结线虫 (Mi)、爪哇根结线虫 (Mj)和花生根结线虫
(Ma)，而 Me2、Me4、Me5基因分别控制对一种根结线虫的抗性，Me2、Me5抗 Mj，Me4抗 Ma(Djian．
Caporalino et a1．，1999；de Souza-Sobrinho et a1．，2002)。Me1、Me3两个基因虽然抗性谱相近，但作用
机制不相同。Me1的抗性反应开始于幼虫在取食位点固定之后，抗性反应较慢，主要发生在巨型细胞
形成过程中，在高温下抗性会部分丧失。而 Me3表达发生在根结线虫侵染早期，在幼虫与根接触时
就即刻在侵染点附近产生过敏性坏死，并在42~C的高温下也能保持完全活性 (Teresa et a1．，1998；de
Souza-Sobrinho et a1．，2002)。
Jammes等 (2005)通过微矩阵和 CATMA基因芯片技术，在分子水平上揭示了根结线虫诱导寄主
表达和抑制的相关基因。Lambert等 (1999)通过感病和抗病番茄差异筛选的方法从根结线虫侵染后
表达的cDNA文库中分离出了 8个与早期抗性相关的基因。在辣椒中虽然也发现多个抗线虫基因及一
些防御相关基因，但对于这些基因在抗线虫作用中的互作关系及作用机制等仍然不明确。为确定 Me3
基因介导的辣椒抗线虫作用及抗性相关基因，我们采用抑制消减杂交技术 (SSH)富集、分离线虫诱
导辣椒 HDA149表达的抗性相关基因，确定抗性相关基因的数量、种类，通过基因功能分类，初步揭
示 Me3基因介导抗性表达早期反应机理，以及防御反应所涉及的信号传导途径和代谢反应。
1 材料与方法
辣椒 (Capsicum annuum L．)双单倍体材料 HDA149，由法国 Alain Paloxin博士惠赠，并在中国
农业科学院蔬菜花卉研究所温室中繁殖。4片真叶期的辣椒苗在移栽 10 d后进行接种处理 (Djian．Ca．
poralino et a1．，1999；茆振川 等，2007)。感线虫辣椒品种为茄门，由中国农业科学院蔬菜花卉研究
所辣椒育种组提供。接种线虫为南方根结线虫 (Meloidogyne incognita)生理小种 1。采用单卵块繁殖
方式进行扩繁，收集 2龄幼虫，在24 h内用于接种。在苗根际接种 500条2龄线虫，对照用无菌水
做模拟接种。分别在接种后 l2、24、36 h时取样。取 1．0～1．5 cm长的根尖经过液氮冷冻，于 一80E
备用。在0、6、12、24、36、48 h随机取2株，根尖采用酸性品红染色，在显微镜下检测线虫的侵
染率，并对比HDA149和茄门接种线虫后的症状 (茆振川 等，2007)。
在每一时间点取样品各 500 mg，采用 Trizol试剂 (Invitrogen公司)提取总 RNA，mRNA采用磁
珠纯化试剂盒分离 (NO 610．12，Invitrogen公司)，检测其浓度、纯度与完整性。取 HDA149样品的
mRNA，以接种南方根结线虫的材料作为试验方 (Tester)，以对照作为驱动方 (Driver)，依照抑制性
消减杂交试剂盒 (NO 637401，Clontech公司)进行差显杂交。SSH产物与 pGM—T载体连接、转化，
通过阳性克隆筛选 、EST点阵列杂交、序列分析，构建差显文库并进行功能分类分析。
2 结果与分析
2．1 侵染试验观察
在显微镜 (100×)下可见，在0和6 h时根结线虫的侵染率为0，12 h有少量线虫开始侵入个
别根尖，在24和36 h线虫大量侵入，平均分别为 16．0和 16．3条。在线虫周围有许多被染成深红色
的坏死细胞 (图 1)，在线虫较多的根尖中线虫周围的坏死细胞往往连在一起，使整个根尖被染成黑
红色。根尖不染色直接观察，HDA149辣椒0和6 h根尖呈现白色，24和36 h变成浅黄褐色。感病品
种茄门 12 h以后有大量线虫侵入，但根尖没有变色现象，也没有发现线虫周围有坏死细胞。
2．2 SSH检测结果
对处理和对照的mRNA进行检测，浓度分别为0．557和0．548 Ixg·IxL～，R比值 (OD 260 。)分
别为 1．931和 1．891。合成的cDNA通过 Rsa I酶消化后的片段主要集中于250～1 000 bp之问 (图
2)。图3为两轮正向消减PCR产物凝胶检测结果，第1轮扩增产物的循环数为33，第2轮为19，在
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2．4 SSH cDNA序列分析
经过测序去除重复序列，在 NCBI中用 BLAST同源对比，共有 229个可以找到同源序列，其中
71个为功能未知的基因，3O个没有发现同源序列。表 1为消减文库中与病原识别 、过敏性反应、保
护机制及转录相关的 EST片段对比结果。获得的消减文库中的 EST同源基因主要来 自拟南芥 (47
条，23．O％)，烟草 (29条，14．2％)，马铃薯 (24条，11．8％)，辣椒 (17条，8．3％)，水稻 (17
条，8．3％)。
表1 与病源识别、过敏性反应、保护及转录相关的 EST
Table 1 The ESTs of pathogens recogmze。hypersensitive response。protection and transc~ption factors
为了进一步了解已知功能的 EST所涉及的代谢反应，在 Blastx和 AmiGO (www．Geneontology．org)
中进行基因功能分析的基础上，参照南方根结线虫基因功能分类方法，对所获得消减 EST进行功能
分类 (James et a1．，2003)，将所得的功能已知的 158个 EST进行功能分类，可知表达的抗线虫相关
基因涉及抗病反应的全过程，包括对线虫识别作用、防御、信号转导、转录调控、代谢调控以及细胞
组分等多个方面。
在Me3基因所介导的抗性表达 EST功能分类中可以看出，除功能未知的 EST外，数量最多的为
代谢反应 (24％)，其次为抗性反应和信号转导相关EST，分别为13％和12％，而涉及到病原物识别
作用的EST只有 1％。这个体系与 J7v基因介导的抗性表达基因 (茆振川 等，2007)、辣椒的非寄主
性抗性表达基因 (Lee et a1．，2004)、孢囊线虫诱导大豆表达基因体系 (Khan et a1．，2004)，以及根
结线虫诱导拟南芥下调基因系统 (Jammes et a1．，2005)相似。特别是在J7v基因和Me3基因两个单显
性抗性基因介导的基因表达中均分离到病原识别基因，这进一步说明 Me3与线虫的互作是一个复杂
的调控系统。
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6期 茆振川等 ：辣椒 Me3基因介导抗根结线虫相关基因的 SSH分析
3 讨论
3．1 病原物的识别作用
尺基因负责对病原物的识别，编码具有 NBS—LRR结构的蛋白 (Hwang&Wiliamson，2003)。本
试验分离到3个编码 NBS—LRR结构的基因 (H-40、H-634、H-614)，其中，H-634与番茄中抗根结
线虫的 Mi一1基因编码蛋白的相似度达到 71％。同时分离到 3种抗病基因，说明这些基因具有协同作
用。有报道证实植物寄生性线虫可以加重黄萎病的发生 (Saeedizadeh et a1．，2003)，因此线虫有可能
激发多个抗性基因。
3．2 信号相关途径
在线虫诱导表达的基因中有29条约 17％属于信号传导体系，在这些信号中钙调节蛋白比例最
高。转录因子是信号传递体系中一个重要部分，在试验中分离到 11个转录因子，约占5％，如
WRKY转录因子、乙烯转录因子、MYB型转录因子等。在辣椒、大豆、拟南芥中，已经证实 WRKY
转录因子、乙烯转录因子参与了寄主对线虫的防御反应 (Eulgem et a1．，2000；茆振川 等，2007；
Mazarei et a1．，2007)，这些说明线虫诱导寄主表达了大量的抗逆境胁迫的信号。
3．3 防御相关基因
在线虫诱导表达 EST中有 33条为防御相关基因，占 13％。其中有6条 (3％)与 HR反应相关，
包括 HR诱导蛋白、Avr9／Cf一9快速激发蛋白、hinl蛋白等。这说明在根结线虫侵染后，寄主使线虫
周围的细胞过敏性坏死，从而抵御线虫的侵染。有27条 (10％)与 SAR相关，包括酯氧合酶、辣椒
酯酶、几丁质酶、奇果蛋白、过氧化物酶、病程相关蛋白、Kunitz蛋白酶抑制剂、Pin 1型蛋白酶抑
制剂等。其中许多是与番茄、拟南芥、辣椒中报道的抗线虫的防御相关基因相一致。
3．4 代谢相关途径
大约有24％ (54条)EST是与代谢相关的基因，包括多酚氧化酶、脂肪酸降解酶、酮醇酸异构
酶、戊二酸加氧酶、类磷脂胆固醇酰基转移酶、甾酮脱氢酶、羟甲基苯基 CoA还原酶 (HMG)等。
植物的防御反应主要涉及苯丙氨酸及莽草酸代谢等次生代谢途径，其产物多为生物碱和萜类化合物。
Cramer等 (1993)报道，在根结线虫侵染番茄后 hmg2基因 (羟甲基苯基 CoA还原酶)被强烈激活。
植物寄主与根结线虫的不亲和互作涉及到苯丙氨酸代谢途径 ，苯丙氨酸的代谢在真菌毒素处理的番茄
及真菌侵染的拟南芥中均得到证实，与 sA的产生相关 (Schaler&Frasson，2000)。试验中分离出的
代谢相关基因的种类和数量最多，说明Me3介导的抗线虫作用是以植物代谢为基础的抗性表达。
3．5 保护机制
在分离到的基因中有些具有细胞自我保护作用机制，如枯草杆菌蛋白、多效药物抗性蛋白，它们对
多种病原物和逆境胁迫均有防御作用 (Kohai et a1．，1997；Stukkens et a1．，2O05)。AGO1-2是介导基因沉默
的重要基因 (Jones et a1．，20O6)。而这些基因在植物防御根结线虫侵染中的作用有待于进一步的研究。
3．6 细胞组成及修复及其它相关基因
在试验中约 8％的 EST是与植物细胞修复及交换运输相关的基因，如纤维素合成酶、多聚葡聚糖
酶、内切葡聚糖酶等。其中关于细胞壁和细胞修复相关的基因在真菌侵染的拟南芥及其它抗线虫研究
报道中得到证实 (Cheong et a1．，2003；Jones et a1．，2006)。其它一些转运蛋白和细胞膜蛋白也是重
要的信号传递蛋白，这些都说明细胞壁的生物合成及修复是防御反应的重要组成。
通过组织观察和消减杂交，初步确定了Me3基因介导的抗性机制包含了 HR和 SAR反应，了解了
抗性相关的基因的种类和数量。通过对所获得的 EST功能分析，推断寄主和线虫之间早期不亲和互作涉
及到对病原线虫的识别、信号传递、转录调控、防御反应、初生代谢、次生代谢以及保护机制等多个方
面。同时，分离出了许多重要的 EST，如抗线虫基因 (H-634)、WRKY转录因子基因 (H-155、H-706)、
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1458 园 艺 学 报 34卷
枯草杆菌蛋白酶基因 (H-47)、过敏『生坏死基因 (H-179)、AGO1—2基因 (H-1050)等，它们在抗线虫中的
作用值得进一步的研究，而试验中获得功能未知的基因和未发现同源性的基因仍有待于更深入的研究。
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