全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 1) : 77~ 79
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 03- 13; 修回日期: 2000- 06- 02
基金项目: 农业部重点开放实验室资助项目
* 现在中国农业大学西校区气象系。
辣椒 RAPD系统的建立及在杂种纯度鉴定中的应用
黄三文 张宝玺 郭家珍 杨桂梅 朱德蔚 堵玫珍 杨 婕*
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081)
摘 要: 对辣椒RAPD反应的各个环节, 包括 DNA提取、PCR反应和电泳检测进行了筛选和优
化, 确定了一个简单、高效、相对稳定的RAPD系统, 并筛选出 12个较稳定的RAPD标记。可以用
于 中椒 系列辣椒的 9个杂交种的纯度鉴定。
关键词: 辣椒; RAPD! PCR; 杂种一代; 纯度鉴定
中图分类号: S 641.3 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 01007703
1 目的、材料与方法
本文报道辣椒RAPD技术体系中DNA提取、RAPD ! PCR和电泳检测 3个环节的优化过程,
以及在 中椒 系列辣椒F1代杂种纯度鉴定上的应用结果。∀中椒 4、5、6、7、8、10、11、12
和13号# 及其相应的亲本均随机取10个幼苗全展开的子叶提取 DNA, 测定浓度后, 取等量的
DNA混合成混合样。先筛选双亲混合样间有差异的扩增强度大的标记, 重复扩增 3次以验证其
稳定性。再用F1和双亲共 30个单株 DNA验证稳定标记的一致性。采用 SDS 法、简化 CTAB
法∃1%和碱裂解法 3种方法提取 DNA。用自制的与离心管内壁吻合的玻璃棒研磨子叶, 以充分粉
碎叶片组织细胞释放DNA, 研磨后立即加入适量的 DNA提取液。DNA的浓度和纯度用紫外分
光光度计和琼脂糖凝胶法测定。
总共25 L的RAPD反应体系包括TrisHCl 10 mmol/ L ( pH 8. 3)、KCl 50 mmol/L、MgCl2 1. 5
mmol/ L、dNTP 0. 2mmol/ L及1U Taq DNA 聚合酶 (华美公司)。对模板 DNA 浓度 ( 0、1、5、
10、20、40、80 ng) 进行了单因素试验。扩增反应在PTC200热循环仪 (MJ Research, 美国) 上
进行, 扩增程序依Prince等∃2%的程序加以调整: 预变性94 & 3min; 变性94& 20 s和1 min, 褪
火36 & 40 s和1 min, 延长72 & 1 min 20 s和2min, 40和45个循环; 终延长72& 7 min。每一
次扩增反应都设置不含模板 DNA的阴性对照。
对CTAB (0. 0001、0. 001、0. 01、0. 1、1、10 g/ L)、SDS ( 0. 001、0. 01、0. 1、1、10、100 g/
L)、乙醇 (0. 5%、1%、2. 5%、5%、10%、20%)、EDTA ( 0. 004、0. 008、0. 02、0. 04、0. 08、
0. 2、0. 4、0. 8mmol/ L)、甘油 (1. 5%、3%、6%、12%)、蔗糖 ( 20、40、80、160 g/ L)、聚蔗
糖 (7. 5、15、30、60 g/ L)、溴酚蓝 (0. 125、0. 25、0. 5、1 g/ L) 和二甲苯腈 ( 0. 125、0. 25、0.
5、1 g/ L) 浓度做了一系列梯度试验。PCR扩增采用优化后的程序。扩增产物用 1%琼脂糖凝
胶电泳或 4%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色, 聚丙烯酰胺凝胶
用快速银染法∃3%染色。用Gel Doc 1000电泳凝胶分析仪 ( BioRad, 美国) 分析电泳结果。
2 结果与讨论
2. 1 DNA提取方法的筛选 在供试的3种方法中, 碱裂解法虽然最简单, 但所提取的DNA含
有较多多糖和蛋白成分, 影响RAPD ! PCR扩增的稳定性, 不适合于纯度鉴定。SDS 法提取的
DNA用异丙醇或乙醇沉淀后不易溶解于水或TE 缓冲液, 需要在65& 水浴中加热溶解, 耗时较
长。简化 CTAB 法所提取DNA的数量和质量均能够满足扩增的要求, 其A260/A280比值为 1. 9左
右, 表明样品中含有RNA, 但不影响RAPD扩增。一个熟练人员可以在一个工作日 ( 8 h) 提取
200个DNA样品。本试验确定简化CTAB法为辣椒子叶和幼叶DNA提取的标准方法。
2. 2 RAPD! PCR反应条件的优化 由于在实际纯度鉴定操作中不可能对 DNA精确定量, 所
以要求 RAPD! PCR对模板DNA的浓度范围要求较宽。本试验中发现辣椒模板DNA含量为 5、
10、20、40和 80 ng 时的RAPD ! PCR的扩增产物完全一致, 并且没有明显的亮度差异, 但为
1 ng时扩增不太稳定。本试验所设定的不同变性、褪火和延长时间及循环数对辣椒 RAPD扩增
结果均没有影响。因此可以采用比Prince的程序∃3%较短的变性、褪火和延长时间及较少的循环
数, 试验可缩短约110 min。简化的程序在 PTC ! 200 PCR仪上运行约需2 h 45min。
研究表明: SDS对扩增的抑制浓度为1 g/ L, 而CTAB 为 0. 1 g/ L, 因此在用简化 CTAB 法
提取辣椒 DNA时用70%乙醇洗涤 DNA沉淀的步骤是必须的, 这一步可以溶解DNA沉淀中大部
分残余的CTAB; 0. 2 mmol/ L的EDTA 即对扩增有抑制作用, 所以用 0. 1倍TE溶解DNA沉淀比
1倍TE更安全; 乙醇的抑制浓度为 5%, 在实际操作时PCR扩增体系中不可能到达此值, 因此
在风干DNA沉淀时, 不必等到完全蒸发, 因为残余的少量乙醇对扩增没有影响, 同时 DNA也
易于溶解; 在本试验浓度梯度范围内的甘油、蔗糖、聚蔗糖和溴酚蓝对扩增均无影响, 而 0.
25 g/ L的二甲苯腈即可抑制PCR扩增。因此本研究采用聚蔗糖和溴酚蓝为上样缓冲液的成分,
并按适当的浓度把它们直接加入到PCR反应体系中, 这样省略了去扩增后每个样品分别加上样
缓冲液的程序。
2. 3 电泳检测方法的选择 聚丙烯酰胺凝胶
- 银染法比琼脂糖凝胶- EB染色法的灵敏性
高两个数量级, 分辨率也高, 但操作较复杂。
传统的银染法需要5~ 6个步骤, 约需 1. 5 h。
本研究采用快速银染法只需 15 min, 且试剂
可多次重复使用。采用预制胶的方法, 一个
熟练人员可以在 1 h内配制 25块聚丙烯酰胺
凝胶, 用于分析1 000个样品, 并且预制胶密
封后可在室温下保存14 d, 在4& 冰箱中保存
1~ 2个月。此外, 由于琼脂糖价格较高, 琼
脂糖凝胶电泳的成本比聚丙烯酰胺凝胶高一
倍以上。综合以上因素, 本试验确定聚丙烯
酰胺凝胶- 银染法为辣椒 RAPD 技术的
标准电泳检测方法。一般用4%的非变性
表 1 用于鉴定 中椒 系列辣椒品种 F1代杂种
纯度的 RAPD标记
Table 1 RAPD markers selected for genetic purity
testing of Zhongjiao cultivars
中椒 系列 Zhongjiao
cult ivars
与母本区别的标记
Marker ( s) used
for identifying
mother plants
与父本区别的标记
Marker ( s) used
for identifying
father plants
4号 No. 4 RAPD1 RAPD2
5号 No. 5 RAPD1 RAPD2
6号 No. 6 RAPD3, RAPD4 RAPD2, RAPD5
7号 No. 7 RAPD2 RAPD1
8号 No. 8 RAPD1 RAPD2
10号No. 10 RAPD1, RAPD4, RAPD2, RAPD5,
RAPD6 RAPD7
11号No. 11 RAPD8 RAPD9
12号No. 12 RAPD1 RAPD2
13号No. 13 RAPD10 RAPD11, RAPD12
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胶即可达到满意的分辨率, 必要时可适当提高到5%。
2. 4 纯度鉴定标记的筛选 共用 120个长度为10 bp随机引物, 其中114个 ( 95%) 能够扩增
出产物。用琼脂糖凝胶- EB法能够检测出3~ 6条带, 用聚丙烯酰胺凝胶- 银染法能够检测出
8~ 15条带。用双亲 DNA混合样初步筛选共得到30条多态性RAPD条带, 经过可重复性检验和
双亲及F1代单株鉴定后, 获得12个稳定的RAPD标记。中椒 系列辣椒所有F1代杂种的纯度
均可以用这些标记来鉴定 (表 1, 图1)。
图 1 用于 中椒 系列辣椒杂种纯度鉴定的RAPD标记
a. 引物 S01对骨干亲本的扩增
1. 20DNA EcoR I 和Hind III 双酶切分子量标准; 2, 3. 中椒 4号 母本; 4, 5. 中椒 5号 母本;
6, 7. 中椒 4号 父本; 8, 9. 中椒 5号 父本; 10, 11. 中椒 11号 父本; 12, 13. 中椒 7号 母本;
14, 15. 中椒 7号 父本; 16, 17. 中椒 6号 母本; 18, 19. 中椒 6号 父本。4%非变性胶, 银染。
b. 引物 S01对 中椒 7号 父母本和F1 单株 DNA的扩增。
1. 空白对照, 2~ 4. 母本单株, 5~ 7. 父本单株, 8~ 19. F1单株。5%非变性胶, 银染。
Fig. 1 Screening of RAPD markers for purity testing of ∀Zhongjiao# serial hybrid cultivars
a The amplification pattern of key parental lines with primer S01.
1. 20Lamnda DNA restricted by EcoR I and Hind III; 2, 3. female parent of ∀Zhongjiao No. 4# ; 4, 5. female parent
of ∀Zhongjiao No. 5# ; 6, 7. male parent of ∀Zhongjiao No. 4# ; 8, 9. male parent of ∀Zhongjiao No. 5# ; 10, 11. male parent
of ∀Zhongjiao No. 11# ; 12, 13. female parent of ∀Zhongjiao No. 7# ; 14, 15. male parent of ∀Zhongjiao No. 7# ;
16, 17. female parent of ∀Zhongjiao No. 6# ; 18, 19. male parent of ∀Zhongjiao No. 6# . 4% nature PAGE with silver staining.
b The amplif ication pattern of individuals of ∀Zhongjiao No. 7# F1 and its parents, with primer S01.
1. negat ive control; 2- 4. female individuals; 5- 7. male individuals;
8- 19. F1 individuals. 5% nature PAGE with silver staining.
参考文献:
1 Haymes O. Miniprep method suitable for a plant breeding program. Plant Mol. Biol. Rept. , 1996, 14: 280~ 284
2 Prince J P, Lackney V K, Angeles C, et al. A survey of DNA polymorphism within the genus Capsicum and the fingerprinting of pepper
cult ivars. Genome, 1995, 38: 224~ 231
3 Sanguinett i C J, Neto E D, Simpson A J G. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels. Bio.
Techniques, 1994, 17: 915~ 919
Establishment of an Efficient RAPD Protocol in Pepper and Its Application in Genetic
Purity Testing of F1 Seeds
Huang Sanwen, Zhang Baoxi, Guo Jiazhen, Yang Guimei, Zhu Dewei, DuMeizhen, and Yang Jie
( Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 100081)
Abstract: In this report, a simple and efficient protocol for RAPD assay in pepper was established through optimization
in three main proceduresDNA extraction, PCR, electrophoresis. The protocol was employed in screening RAPD markers for
genetic purity testing of ∀Zhongjiao# serial hybrid cultivars. A total of 12 stable and strong RAPDs were identified to distin
guish all 9 F1 s from their parental lines.
Key words: Pepper ( Capsicum annuum L. ) ; RAPDPCR; Hybrid purity determination
791期 黄三文等: 辣椒 RAPD系统的建立及在杂种纯度鉴定中的应用