全 文 ：武汉植物学研究 2004，22(3)：201~204
Journal of Wuhan Botanical Research
苏云金杆菌抗虫基因 crylAc转化辣椒的研究
袁 静 ，舒庆尧 ，刘中来
(1．华中师范大学分子遗传学实验室，武汉 430079；2．浙江大学原子核农业科学研究所，杭州 310029)
摘 要 ：通过农杆菌介导法将杀虫结晶蛋白基因 crylAc导入到辣椒子叶外植体中，经卡那霉素筛选、组织化学法
检测 GUS活性以及 PCR、Southern杂交分析证实 crylAc基因已整合进辣椒核基因组中。
关键词 ：辣椒 ；Bt杀虫基因；农杆菌介导法 ；转基因植株
中图分类号 ：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—47Ox(2OO4)O3-0201-04
Study on Transformation of Insecticidal Bacillus thuringiensis
crylAc Gene in Pepper
YUAN Jing ，SHU Qing—Yao。，LIU Zhong—Lai 。
(1．M olecular Biology Laboratory，Central China Normal University，W uhan 430079，China；
2．Institute of Nuclear Agricultural Sciences，Z^ ~iang University，Hangzhou 310029，China)
Abstract：The insecticidal Bacillus thuringiensis(Bt)crylAc gene was used to transform the
cotyledon explants of pepper via Agrobacterium transformation．Through stringent selection of
kanamycin，analysis of the expression of GUS in the plants by histochemical method，molecular
biological assays with PCR and Southern dot hybridization，it is confirmed that the crylAc gene
was integrated into the genome of pepper．
Key words：Pepper；Bt insecticidal gene；Agrobacterium-mediated method；Transgenic plant
辣椒(Capsium n )是农业生产上的大宗
蔬菜之一，“六五”、“七五”、“八五”期间，我国把辣
(甜)椒抗病新品种的选育作为重点攻关项目[13。危
害辣椒地上部分的主要害虫有烟青虫，又名烟夜蛾，
属于鳞翅目，农民称之蛀孔虫，主要以幼虫蛀食花、
蕾、果，造成大量落果或烂果 ，使辣椒产量下降[2]。苏
云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis Berliner)杀虫
晶体蛋 白基因(Bt基因)中的一种 cryIAc能编码
133 kD的晶体蛋白质，杀虫范围即为鳞翅 目[3]。因
此，将 crylAc基因导入辣椒，获得转基因植物选育
辣椒新品种，在生产上有着其积极的生态意义和经
济意义。
由于辣椒的品种特异性 ，其高效植株再生体系
长期未能很好地建立，故在利用基因工程技术改良
辣椒品种性状方面，国内外一直少有研究[4]。近年
来，由于辣椒组培方面研究的不断深入[s1]，辣椒基
因工程的研究正 日渐增多，有些已经取得了阶段性
的进展~8-10]。但在辣椒基因工程研究中，抗虫基因的
导入至今只有一例有关 CPTI基因的报道[1 。笔者
报道了利用农杆菌介导遗传转化方法，将密码子经
过改良的抗虫 Bt基因 cryIAc(该改 良过的基因编
码 67．5 kD杀虫晶体蛋白质，杀虫效果不变[1。])导
入辣椒，获得转基因植株。
1 材料与方法
1．1 供试材料的培养及培养基
选用普遍栽培的汴椒一号和洛椒四号为转化受
体材料。辣椒种子经数小时浸洗后用0．05 升汞消毒
收稿 日期：2003—09—06，修回日期 ：2003—12一O5。
作者简介：袁静(1978一)，女 ，硕士，生化与分子生物学专业，从事植物分子生物学研究工作。
★ 通讯作者(E—mail：zhonglailiu@yahoo．com．cn)。
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202 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
6 min，漂洗后接种于1／2 MS液体培养基中26℃振荡
浸种5 d。种子露白时接种到1／2 MS琼脂培养基上，
26℃光照下培养。取1O～14 d苗龄的无菌苗子叶约
1 cm长切段作为组织培养和遗传转化的受体材料。
培养基成分：① AB培养基MES 4 g／L+NH4Cl
1 g／L+MgSO4·7H2O 1．25 g／L+KCl 0．15 g／L+
CaC12 0．01 g／L+FeSO4 2．5 mg／L+K2HPO4 3 g／L
+NaH2PO ·H2O 1．15 g／L+葡萄糖 5 g／L+蔗糖
15 g／L，pH5．6；②分化培养基 Ms+IAA 1．0 mg／L
+BA 5．0 mg／L+蔗糖 30 g，pH5．8t ；③伸长培养
基 MS+IAA 1．0 mg／L+BA 3．0 mg／L+GA3
1．0 mg／L+蔗糖30 g，pH5．8Is]；④ 生根培养基1／2
MS+IAA 1．0 mg／L+蔗糖 30 g，pH5．8L5J。
选择培养基即各种培养基另加有羧苄青霉素
(Car)500 mg／L和卡那霉素(Km)50 mg／L。
1．2 双元载体和农杆菌菌株
本研究采用的双元载体为 pKUC质粒(该质粒
由舒庆尧教授惠赠)。pKUC的T—DNA区内分别含
有来自玉米的启动子 Ubiquitin驱动的 crylAc，以
及 由启动 子 CaMV35S驱 动 的抗 潮 霉 素 (Hy—
gromycin)的 hpt基因和抗卡那霉素的 npt J基因
以及gus基因[1引。载体的T—DNA区的结构见图 1。
LB NOS．Pro N OS．Ter Ubi．Pro N OS．Ter 35S．Pro N OS．Ter 35S．Pro NOS-TerRB
nptI I H I crylAc l H I hpt
图 1 用于辣椒转化的双元载体 pKUC的T—DNA区
Fig．1 T—DNA region of binary vector pKUC for transformation in pepper
采用 的根癌农 杆菌(Agrobacterium tumefa—
ciens)菌株为EHA105和 LBA4404。用氯化钙法将
双元载体 DNA直接导入农杆菌中[1 。
1．3 农杆菌介导的转化
挑取农杆菌单菌落，在 YEP培养液中生长过
夜。取细胞悬浮液在AB培养液中培养至OD 。达到
0．5左右。离心后菌体用 1／2 MS液体培养基清洗一
次并重悬，稀释到OD o为0．3-．-0．5。准备好的菌液
用于转化 。
其中EHA105菌株的培养基加入 Km抗生素，
LBA4404菌株的培养基加入 Km和 Str抗生素。
于超净工作台上，将准备好用于转化的农杆菌
液倒入无菌小培养皿中。取预培养 2 d的辣椒子叶
切段放入菌液中浸泡 5～7 min，冲洗 1次，吸干，进
行下一步培养。
1．4 转化植物的筛选和鉴定
1．4．1 Km对外植体筛选浓度确定 取未经转化
的预培养后外植体，分别接种于附加 Km浓度为 25
mg／L、50 mg／L的芽诱导培养基上培养。观察到
Km在浓度为 25 mg／L时外植体可以产生抗性芽，
而当浓度升到 50 mg／L时外植体产生抗性芽的频
率降为 2 。因此可以确定 Km的浓度在 50 mg／L
时为较适的 Km筛选浓度。
1．4．2 Km对转化外植体的抗性筛选 将经农杆
菌介导转化后的外植体切段吸干，放入分化培养基
暗条件下共培养 2 d，再转入选择分化培养基(即另
含 Km 50 mg／L和 Car 500 mg／L，下同)上进行芽
诱导选择培养。待长出丛生芽后转入选择伸长培养
基上促苗伸长，切下 1．5～2 cm高的小苗插入选择
生根培养基中生根。取产生不定根的植株的叶片经
过组织化学及分子鉴定后，将转化辣椒植株经过炼
苗后移入土壤继续培养，获得自然生长的转化植株。
1．4．3 GUS活性检测 取经转化后具 Km抗性的
再生小苗的叶片进行 GUS活性检测，采用 X—Gluc
(5一溴一4一氯一3一吲哚一葡糖苷酸酯)染色方法[1 。
1．4．4 crylAc的 PCR分析 随机选取转化后具
Km抗性 的的小苗，采 用 CTAB微量分离 DNA
法L15]提取植物总DNA，然后进行 PCR扩增 。crylAc
基因的特异引物序列为：
primerl 5’CA CAG TTT CTG CTC AGC
GAG TT 3’
primer2 5’TG AGC AAC GAT ACG TTG
TTG TG 3’
扩增产物为 0．931 kb片段。扩增反应条件为：
94℃ 5 min 1个循 环 ，94℃ 30 S，55。C 1 min，72℃
1．5 min，30个循环 ，最后 72℃ 10 min。PCR反应中
以质粒 pKUC设为阳性对照，以未转化植株设为阴
性对照。
1．4．5 Southern点杂交分析 随机选取具 Km抗
性 的辣椒小苗 4O棵，按 CTAB微 量分 离 DNA
法L15]提取其叶片的总 DNA。用核酸蛋白检测仪测
定浓度，再经适当稀释，使各总 DNA浓度大致相
同。总DNA变性后，各取 1 L，点样于尼龙膜上。同
时点样质粒 pKUC的DNA作为阳性对照，点样未
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第a期 衷 酵等：苏云金打菌抗虫基田r~．vlA。转化辣椒的研究
转化小 叶片的总 DNA作为阴性对照。用盛外灯
照射法固定各点样 DNA，然后甩十 Southern点杂
交。
以 crylAc基因的 PCR特异扩增产物为模板，
采用随机引物方法制备地高辛标 探针 顸杂交、杂
空和洗膜 ，均拄 R cmhe公司的地岛辛 DNA标记盈
检测试剂盘提供的方法进行．最后在含有 NBr和
BCIP的染色液中显色
2 结果与分析
2 I 转基因植株的GUS检测
GUS活性检测结果 见田 2 罔 2：A培养皿内
的太部分转化小茁叶片晰现局部的监绿色．以叶基
和叶尖表现最为叫显 另外也有部分叶片变成描色
而住图 2：B培养皿内木转化的l弼性对照叶片则为
漩绿色，整个叶片颤色鞍为均一。
A B
A L⋯ of tlI⋯ ⋯ l pl~ t5f B Lea~e5 0f the unt⋯ rm plants
罔 2 GUS存轱基因檀株中的衰诂
Fig 2 The e*pre~ion of GUS-⋯ ⋯ en·c phat5
2．2 转基因植株的分子检测
PCR特异扩增厦应缔果见图 3 被随机检测的
l2档l}冉生小凿中有 9棵均扩增出0 931 kb蚰带带 ，
而未经转化的阴性对照无扩增带 图3中的 M 泳道
},DNA／Hind n+EeoR I Ma㈣ker
Lane M m NA九lind l十Ec口R I MarkerBl Lan +CK
PCR prc~fluct C0 93 kb) the plmsmld conlmning crylA~
ge“ I 1．,ne — CK．N0ntran6如rmed plant 0f pepper‘
Lane 1 12 PCR product, Of transgenic plants h0m
pel,l
围 3 蟑椒基因组 DNA的 PCR扩增结暴
Fig 3 PCR analyais ia p~ppel响 E1 nIc~lants
Southem 杂交分析待果表明．被检测的 40
棵具 Km抗性小苗巾共有 27橼为杂交阳性‘图 -【j。
CKI为质粒pKUC的阳性对照，CK2为术转化辣椒
小苗总 DNA的阴性对照，A、B⋯C D四行共 4O处
点佯为被检测的转化棘搬总DNA．其中的 13 t ：
A z、A 6、Aln、B2、B5、B9、C3、C4、C6 C8 D3．D7．
CK1·DNA ofthe ptasmid⋯ amI E~y／Ac gene}CK2
Noutra~ [om cd plan k 0f pepperl AI—D10 Genomie
DNA of⋯ 0gemc pinata from pepper
围 4 蟑 转基嗣株基田姐 nN^ Southern点杂立分析
Fig 4 uthern dot blottin~a~ lysis f0 genomtc
DNA of tr~ senle pcppcr pI．nt~
濯啊镊
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K A B C D
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204 武 汉 植 物 学 研 究 第 22卷
DIO为杂交阴性，另外 27个点均为杂交阳性。证明
被检测的 4O棵辣椒小苗中有 27棵的基因组被整合
入了crylAc基因。从图 4还可以看出，点杂交信号
有明显的强弱差别，可能是整合入基因组的基因拷
贝数不 同所致 。
随机选取 3个经 PCR法鉴定的转基因辣椒植
株，分别提取其基因组 DNA，做大量 PCR特异扩
增，用试剂盒回收特异扩增的 DNA带，最后将 3份
混合溶于双蒸水。将回收产物送至公司作 DNA测
序。测序结果显示，转基因植株总DNA的特异PCR
扩增条带 DNA序列包含于 crylAc的基因序列之
中，且与所属部分序列完全相同。
3 讨论
本实验在辣椒外植体的体外再生培养方面，使
芽诱导频率最高达到 83．3 ，芽仲长培养基可以较
好解决辣椒组织培养中芽茎不伸长的瓶颈问题，生
根培养基诱导生根率为 78 。基本上建立了高效辣
椒植株再生体系，为更多外源目的基因的导入进行
辣椒遗传性状的改良奠定了基础。
在诱导辣椒外植体芽伸长的问题上，本实验根
据国内外研究的经验采用了赤霉素 GA 。试验结果
证明 1 mg／L浓度的 GA 对芽伸长的促进效果明
显，但在后期必须降低浓度，否则外植体将产生较多
畸形芽，几乎无叶而茎非常细长，影响了幼苗的质
量。一些报道中指 出若在芽分化培养基上添加
GA ，则会抑制芽分化，产生大量愈伤组织[5 引，本
试验发现的现象与之相符。GAs后期产生的副作用
可能是因为 GA 在外植体中产生积累，从而使互生
芽发育不正常。
本实验在利用根癌农杆菌介导法进行辣椒遗传
转化的过程中，对农杆菌转化条件进行了较为系统
的比较研究，结果显示采用预培养 2 d的子叶外植
体，用农杆菌侵染 5～7 min，可获得最高的转化效
率。这为建立一种转化效率高、稳定性好、通用性较
强的辣椒农杆菌转化技术体系打下了基础。
在对转基因植株叶片进行 GUS活性检测时，
由于植物体内的过氧化物酶能促进颜色反应，使颜
色加深 ，另外可能由于叶绿素的脱色处理不完全，这
两个原因使得本试验中有的染色结果为褐色，而不
是标准的蓝色。
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