全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·813·
人参皂苷 Rb1对术后疲劳综合征老年大鼠海马神经营养因子的影响
张昌静 1,庄成乐 1,陈伟哲 1,刘 舒 1,毛翔宇 1,章晓东 1,陈必成 2,余 震 1, 3*
1. 温州医科大学附属第一医院 胃肠外科,浙江 温州 325000
2. 温州医科大学附属第一医院 外科学实验室,浙江 温州 325000
3. 同济大学附属第十人民医院 胃肠外科,上海 200072
摘 要:目的 研究术后疲劳综合征(POFS)老年大鼠海马神经营养因子(NTF)水平动态变化及人参皂苷 Rb1 的抗疲劳
机制。方法 将 96 只老年雄性 SD 大鼠,随机分为假手术组、模型组和人参皂苷 Rb1 干预组,每组再按时间点分为术后 6 h
及术后 1、3、7 d 组。术后对应时间点进行旷场试验,并通过 Real-time PCR 检测大鼠海马神经生长因子(NGF)、脑源性神
经营养因子(BDNF)的 mRNA 表达;放射免疫法检测 NGF 和 BDNF 蛋白表达;电镜观察海马 CA1 区超微结构变化。
结果 模型组与假手术组比较,旷场试验中大鼠穿越格子数减少(P<0.01),休息时间延长(P<0.01);NGF 和 BDNF mRNA
表达降低(P<0.05、0.01),其相应的蛋白表达也降低(P<0.05)。人参皂苷 Rb1 组与模型组比较,旷场试验中大鼠穿越格
子数增多(P<0.05),NGF 和 BDNF mRNA 表达升高(P<0.05、0.01),其相应的蛋白表达也升高(P<0.01)。电镜结果显
示,模型组与假手术组比较,大鼠海马神经元超微结构受损,人参皂苷 Rb1 组得到相应改善。结论 POFS 老年大鼠海马 NTF
表达降低,神经元存在一定程度损伤,人参皂苷 Rb1对 POFS 老年大鼠有一定改善作用。
关键词:人参皂苷 Rb1;术后疲劳综合征;老年大鼠;神经生长因子;脑源性神经营养因子
中图分类号:R285.5 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2014)06 - 0813 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.06.014
Effect of ginsenoside Rb1 on neurotrophic factors in elderly rats
with postoperative fatigue syndrome
ZHANG Chang-jing1, ZHUANG Cheng-le1, CHEN Wei-zhe1, LIU Shu1, MAO Xiang-yu1, ZHANG Xiao-dong1,
CHEN Bi-cheng2, YU Zhen1, 3
1. Department of Gastrointestinal Surgery, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
2. Laboratory of Surgery, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
3. Department of Gastrointestinal Surgery, Tenth People’s Hospital of Tongji University, Shanghai 200072, China
Abstract: Objective To investigate the dynamical variation of the hippocampal neurotrophic factors (NTF) in elderly rats with
postoperative fatigue syndrome (POFS) and the antifatigue mechanism of ginsengside Rb1. Methods Ninety-six elderly male SD rats
were randomly divided into Sham, POFS model, and ginsengoside Rb1 intervention groups, and each group was divided into subgroups by
postoperative 6 h, 1, 3, and 7 d. The hippocampus was removed at each time point after open field test (OFT) to detect the mRNA
expression levels of nerve growth factors (NGF) and brain-derived neurotrophic factors (BDNF) by Real-time PCR; The content of protein
was detected by radioimmunoassay; The ultrastructural changes in hippocampus CA1 area were observed by electron microscopy. Results
Compared with the Sham group, the number through lattice in OFT of rats in the POFS model group declined (P < 0.01), while resting
time increased (P < 0.01); The expression level of NGF and BDNF mRNA in the POFS model group declined (P < 0.05, 0.01), the
expression level of corresponding protein declined (P < 0.05). Compared with the POFS model group, the number through lattice in OFT
of rats in the Rb1 group increased (P < 0.05), the expression level of NGF and BDNF mRNA of rats in Rb1 group increased (P < 0.05,
0.01), and the expression level of corresponding protein also increased ( P < 0.01). Electron microscopy results showed that compared
with the Sham group, the ultrastructures of the hippocampal neurons of rats were significantly damaged in the POFS model group, which
收稿日期:2013-09-07
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81171857);浙江自然科学基金资助项目(LY12H1004);浙江卫生厅营养学支撑学科项目(11-ZC24,
201231118,2013ZDA014);温州市科技局项目(H2005B032)
作者简介:张昌静(1988—),男,研究生,研究方向为胃肠外科临床营养。Tel: 18858735220 E-mail: zhangchangjing000@163.com
*通信作者 余 震 Tel: (0577)88069806 E-mail: yuzhen0577@gmail.com
·814· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月
were relatively impromed in the Rb1 group. Conclusion The expression level of NTF inelderly rats with POFS declines, the hippocampal
neurons are damaged to a certain extent and the application of ginsenoside Rb1 may have the improvement to POFS in elderly rats.
Key words: ginsenoside Rb1; postoperative fatigue syndrome; elderly rat; neurotrophic factors; brain-derived neurotrophic factors
术 后 疲 劳 综 合 征 ( postoperative fatigue
syndrome,POFS)严重影响患者术后康复及生活质
量,常见于腹部大手术后,尤多见于老年患者,其
病因尚未完全阐明[1]。神经营养因子(neurotrophic
factors,NTF)是一类对神经细胞损伤修复有重要
作用的蛋白质,包括神经生长因子(nerve growth
factors,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived
neurotrophic factors,BDNF)等。本课题组前期研
究发现,人参皂苷 Rb1 具有抗疲劳作用[2-3]。有研究
报道,在体外神经细胞培养中,人参皂苷 Rb1能通
过促进 NTF 表达来保护神经细胞[4]。而 POFS 老年
大鼠颅内 NTF 的变化及人参能否通过影响 NTF 的
表达来改善 POFS,目前未见报道。本研究采用前
期建立的 70%中段小肠切除 POFS 大鼠模型[5],通
过观察假手术大鼠、POFS 老年大鼠和人参皂苷 Rb1
干预大鼠的海马组织 NTF 表达差异,为 POFS 的发
病机制开辟新的思路,并为人参皂苷 Rb1的抗疲劳
机制提供理论和实验支持。
1 材料
1.1 动物
SPF 级老年雄性 SD 大鼠,购于北京维通利华
实验动物有限公司,许可证号 SCXK(京)
2006-0009,饲养于温州医学院外科学实验室屏障环
境中,给予标准饲料和饮用水,饲养至 22 月龄,
取 96 只,体质量 650~750 g 进入实验。本研究得
到温州医科大学伦理委员会批准,在整个实验中遵
守《实验动物管理条例》,做到减轻大鼠痛苦,增
加其舒适度。
1.2 药物与试剂
人参皂苷 Rb1(批号 12092821,质量分数≥
96.0%)购自上海同田生物技术有限公司;RT 试剂
盒(批号 211600)、SYBR Green 试剂盒(批号
216700)购自 TOYOBO 公司;Trizol(批号 47415)
购自Life Technology公司;DEPC水(批号1304G02)
购自 GENERAY Biotechnology 公司;NGF 放免药
盒(批号 HY-151)、BDNF 放免药盒(批号 HY-153),
均购自北京华英生物技术研究所。
1.3 仪器
旷场试验场地(自制);5804R 台式低温离心机
(美国 Eppendorf 公司);电动匀浆器(Kimble 公司);
数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂);
酶标仪(Thermo Scientific 公司);7500 PCR 仪(美
国Applied Biosys公司);超低温冰箱(Thermo Fisher
Scientific);电子天平(上海精密科学仪器有限公
司);r—911 全自动放免计数仪(中国科技大学实
业总公司)。
2 方法
2.1 动物分组与模型制备
用体质量测定法,术前 1 周筛选出体质量稳定
在 650~750 g 的 96 只 22 月龄大鼠进入实验。大鼠
按体质量完全随机分为假手术组、模型组和人参皂
苷 Rb1干预组,每组再按时间点分为术后 6 h 及术后
1、3、7 d 4 个小组,共 12 组,每小组 8 只。假手术
组大鼠开腹后仅翻动肠袢,模型组和人参皂苷 Rb1
组大鼠采用 70%中段小肠切除法制备 POFS 大鼠模
型[5]。术后单鼠单笼饲养于实验室屏障环境中。
2.2 给药[6]
假手术组和模型组大鼠分别于术前 3 d 开始到
取材当天,每天 ip 4 mL/kg 生理盐水 1 次。人参皂
苷 Rb1 组大鼠在相同条件下 ip 15 mg/kg 人参皂苷
Rb1(4 mL/kg),人参皂苷 Rb1 用生理盐水配制成
3.75 g/L 的溶液,现配现用。
2.3 疲劳评估
2.3.1 一般状态 观察大鼠腹部术后体质量及自
我清洁能力等。
2.3.2 旷场试验(Open field test,OFT)[7] 利用
150 cm×150 cm×60 cm 木质旷场箱,底部划分为
30 cm×30 cm 的方格,实验于 18︰00~20︰00 时
在安静、弱光源的房内进行。记录大鼠 3 min 内穿
越格子数、直立次数、修饰时间及休息时间。
2.4 标本采集
2.4.1 海马组织取材 各组大鼠分别于术后 6 h 及
术后第 1、3、7 天,腹部 sc 2%戊巴比妥钠(3.5
mL/kg)进行麻醉,之后断头,迅速冰面上取海马,
置液氮中保存,24 h 后转移至−80 ℃超低温冰箱储
存待测。
2.4.2 电镜取材 活体心脏灌注,打开胸腔,于左
心室进针后止血钳夹持,剪开右心耳,于 2~4 min
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·815·
内注入约 300 mL 生理盐水置换循环血液;接着再
于 1~2 min 内注入 4%多聚甲醛溶液约 150 mL 进
行活体固定,所有灌注液 4 ℃预冷;之后断头打开
颅腔,于冰浴下完整剔取海马,2.5%戊二醛固定。
2.5 指标测定
2.5.1 Real-time PCR 取大鼠海马组织,Trizol 法
提取总 RNA 并进行逆转录,Real-time PCR 采用
SYBR Green 染料法。扩增条件:95 ℃、1 min;40
个循环(95 ℃、15 s,60 ℃、15 s,72 ℃、45 s),
总延伸结束后,产物进行电泳。引物序列(表 1)
由上海基康生物技术有限公司合成。
2.5.2 放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)
取左侧海马组织采用放射免疫分析法检测 NGF、
BDNF 蛋白水平。
2.5.3 电镜标本观察 按常规电镜样品制备程序
漂洗、脱水、浸透及环氧树脂包埋。半薄切片,光
表 1 Real-time PCR 引物
Table 1 Primers of Real-time PCR
基因 序列 (5’-3’) 产物长度 /
bp
18 S 正向:AGTCGCCGTGCCTACCAT 129
反向:CGGGTCGGGAGTGGGTAAT
NGF 正向:TGGAGCCGAAGGGGAGC 231
反向:GGTTCTGCCTGTACGCCGA
BDNF 正向:TCACAGCGGCAGATAAAAAGAC 213
反向:TAAGGGCCCGAACATACGAT
镜定位,超薄切片,透射电镜观察海马 CA1 区神经
元超微结构改变。
2.6 统计学处理
用 SPSS 14.0 统计软件进行统计分析,实验数
据用 ±x s 表示,多组间比较采用单因素方差分析
(One-way ANOVA),组间的两两比较,方差齐性用
LSD 检验,方差不齐用 Tamhane’s T2 检验。
3 结果
3.1 一般状况
模型组与假手术组比较,大鼠术后一般状态明
显变差,怂毛,自我清洁能力变差,嗜睡,进食减
少,大便黄软或腹泻,活动度下降,体质量不增。
人参皂苷 Rb1 组大鼠一般状态介于模型组和假手术
组之间。
3.2 旷场试验
模型组与假手术组比较,术后 1、3 d 大鼠穿越
格子数明显减少(P<0.01),术后 3 d 休息时间明显
延长(P<0.01),直立次数和修饰时间无统计学差异。
人参皂苷 Rb1组与模型组比较,术后 1、3 d 大鼠穿
越格子数增多(P<0.05),直立次数、修饰时间和休
息时间无统计学差异。结果见表 2。
3.3 Real-time PCR 结果
3.3.1 目的基因产物特异性鉴定 由表 1 可知 18
S、NGF、BDNF 基因的扩增片段碱基对数量分别
是 129、233、213 bp,对相应的目的基因产物进行
电泳特异性鉴定,结果见图 1。18 S 基因扩增片段
表 2 旷场试验结果 ( 8=± n , sx )
Table 2 Results of OFT ( 8=± n , sx )
组别 术后时间 穿越格子数 / 个 直立次数 / 次 修饰时间 / s 休息时间 / s
假手术 6 h 13.7± 4.8 3.5±1.6 7.3± 6.0 68.3±23.7
1 d 35.7±14.0 9.7±6.7 12.0± 7.8 46.0±29.0
3 d 44.3±10.2 11.0±4.7 10.3± 8.3 11.8± 4.0
7 d 43.7± 9.9 9.2±2.7 7.3± 9.5 13.0±13.4
模型 6 h 11.2± 4.9 3.3±1.6 5.8± 7.3 73.8±20.5
1 d 12.0± 4.9## 4.5±2.3 13.0±10.5 66.0±36.7
3 d 23.5± 9.0## 7.5±3.4 9.3± 8.8 45.8±18.7##
7 d 34.3± 4.1 10.0±3.3 4.5± 5.3 27.3± 8.4
人参皂苷 Rb1 6 h 14.3± 3.8 4.2±2.4 9.8± 8.7 69.2±29.9
1 d 29.0±13.2* 4.7±2.7 14.3±12.8 49.0± 8.9
3 d 35.8± 7.8* 8.5±2.8 13.2±13.9 30.0±15.8
7 d 37.5± 6.7 10.0±6.0 5.8± 6.7 24.8±16.5
与假手术组同时期比较:##P<0.01;与模型组同时期比较:*P<0.05
##P < 0.01 vs Sham group at the same time; *P < 0.05 vs POFS model group at the same time
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图 1 18 S、NGF、BDNF Real-time PCR 产物电泳图
Fig. 1 Electrophoregram of Real-time PCR products
of 18 S, NGF, and BDNF
条带位于 100~200 bp,且接近 100 bp 处,NGF 和
BDNF 基因扩增片段的条带均位于 200~300 bp,且
NGF 扩增片段的条带相对于 BDNF 条带更靠近 300
bp 处。同时 18 S、NGF、BDNF 基因扩增片段均无
明显杂带。由此可知,产物即为各自目的基因目的
产物,且纯度高。
3.3.2 NGF 和 BDNF 相对表达量 模型组相对于
同时期假手术组 NGF mRNA 相对表达量显著降低
(P<0.05、0.01),人参皂苷 Rb1 组相对于模型组
NGF mRNA 相对表达量显著升高(P<0.01)。术后
1 d 模型组相对于同时期假手术组 BDNF mRNA 相
对表达量显著降低(P<0.01),人参皂苷 Rb1组术后
6 h、1 d 相对于同时期模型组 BDNF mRNA 相对表
达量显著升高(P<0.05、0.01)。结果见表 3。
表 3 Real-time PCR 结果
Table 3 Results of Real-time PCR
组别 术后时间 NGF (2−△△Ct) BDNF (2−△△Ct)
假手术 6 h 0.98±0.18 1.08±0.11
1 d 1.08±0.30 1.12±0.19
3 d 1.14±0.25 1.03±0.45
7 d 1.01±0.25 0.98±0.31
模型 6 h 0.74±0.13# 0.80±0.32
1 d 0.52±0.22## 0.52±0.22##
3 d 0.71±0.11## 0.97±0.33
7 d 0.59±0.18## 0.97±0.39
人参皂苷 Rb1 6 h 1.40±0.27** 6.26±3.57*
1 d 2.72±1.16** 9.63±4.81**
3 d 1.61±0.45** 1.30±0.40
7 d 2.25±0.88** 1.35±0.49
与假手术组同时期比较:#P<0.05 ##P<0.01
与模型组同时期比较:*P<0.05 **P<0.01,下表同
#P < 0.05 ##P < 0.01 vs Sham group at the same time
*P < 0.05 **P < 0.01 vs POFS model group at the same time, same as below
3.4 RIA 结果
模型组术后 3 d相对于假手术组NGF蛋白表达
量降低(P<0.05),人参皂苷 Rb1 组术后 6 h、1 d
相对于模型组 NGF 蛋白表达量升高(P<0.01)。模
型组术后 6 h 相对于假手术组 BDNF 蛋白表达量降
低(P<0.01),人参皂苷 Rb1 组术后 6 h、1 d 相对
于模型组 BDNF 蛋白表达量升高(P<0.01)。结果
见表 4。
表 4 RIA 结果
Table 4 Results of RIA
组别 术后时间
NGF /
(pg·mg−1)
BDNF /
(ng·mg−1)
假手术 6 h 14.3±1.5 0.239±0.015
1 d 17.8±3.1 0.265±0.034
3 d 15.7±0.8 0.261±0.023
7 d 12.3±1.6 0.203±0.022
模型 6 h 13.1±1.6 0.197±0.016##
1 d 16.2±0.6 0.231±0.021
3 d 14.0±0.9# 0.237±0.040
7 d 11.8±2.9 0.189±0.021
人参皂苷 Rb1 6 h 17.4±1.5** 0.250±0.030**
1 d 17.1±1.6 0.284±0.047**
3 d 19.3±2.2** 0.294±0.032**
7 d 12.6±2.1 0.203±0.033
3.5 电镜结果
各组海马 CA1 区神经元超微结构变化见图 2。
各组神经元细胞质内散在分布老年大鼠特有的脂
褐素。模型组和假手术组对比,细胞形态不规则,
体积普遍减小;细胞核固缩,核仁固缩,核膜双层
结构不明显;细胞质颜色深,内质网扩张,游离核
糖体密集,线粒体肿胀,部分嵴断裂或融合消失,
双层膜结构不完整,术后 3 d 最为明显。人参皂苷
Rb1 组相对于模型组上述表现有所改善,术后 3 d
改善最明显。
4 讨论
POFS 分为外周疲劳和中枢疲劳,中枢疲劳临
床上主要表现为精神障碍,其发病机制是多元性
的。NTF 是一类由神经支配的组织和星形胶质细胞
产生,并是神经细胞维持正常形态和功能所必须的
蛋白质,其中,NGF 和 BDNF 主要分布于海马组织
和大脑皮质,对维持神经元的形态和功能及神经系
统的损伤与修复起重要作用[8]。海马与人体的学习
100 bp
200 bp
300 bp
Marker 18 S NGF BDNF
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 6 期 2014 年 3 月 ·817·
假手术 模型 人参皂苷 Rb1
-核膜 -线粒体
-nuclear membrane -mitochondria
图 2 各组大鼠海马 CA1 区神经元超微结构
Fig. 2 Ultrastructures of neurons in CA1 area of hippocampus
记忆、情绪调节密切相关。手术创伤应激导致血和
脑皮质醇升高,高浓度皮质醇降低海马神经元的兴
奋性,引起海马 CA1 区 NGF、BDNF 蛋白表达下
降[9]。NTF 参与维持神经细胞形态和功能,修复受
损神经细胞。电镜结果显示,手术创伤应激可引起
海马组织神经细胞发生形态学改变。神经系统功能
的正常发挥依赖于正常的神经细胞,没有了正常的
神经细胞,老年大鼠便出现疲倦、嗜睡、进食减少、
活动度下降等类似中枢疲劳的特征。因此,通过检
测海马 NGF、BDNF 的量及电镜观察 CA1 区形态
学变化能较好地反映中枢疲劳状况。
本研究显示,模型组大鼠较假手术组大鼠术后
一般状态差,旷场试验中活动能力下降,休息时间
延长,术后各个时间点 NGF mRNA 表达均显著降
低,NGF 对应蛋白表达也相应下降,术后 1 d 内,
海马 BDNF mRNA 表达下降,对应的蛋白质表达也
相应下降。通过电镜观察海马 CA1 区细胞形态,发
现在 POFS 老年大鼠模型上存在海马神经元结构改
变,与 NTF 有对应的关系。推测,电镜下海马超微
结构的改变可能与 NTF 的减少有关,可能机制如
下:手术创伤应激降低 NGF、BDNF 等神经营养因
子转录及翻译水平;缺少了神经营养因子的保护,
神经细胞形态破坏,功能紊乱,受损的细胞不能修
复;最终导致老年大鼠 POFS 的出现。
人参为五加科多年生草本植物,其主要通过拮
抗兴奋性氨基酸毒性,维持细胞内钙离子稳定;增
强抗氧化酶活性,清除氧自由基;抗细胞凋亡,修
复受损神经元等机制发挥神经保护作用。有研究报
道其活性成分人参皂苷 Rb1 在脑缺血时具有抑制局
部炎症来保护神经细胞的作用[10]。本研究显示,在
围手术期给予人参皂苷 Rb1 干预,可以明显改善大
鼠的一般状况及行为学表现,且使模型大鼠 NGF
和 BDNF 的 mRNA 表达增加,其相应蛋白表达也
增加。电镜结果显示人参皂苷 Rb1组神经元超微结
构亦得到相应改善。以上结果均提示应用人参皂苷
Rb1 可明显改善中枢疲劳,其具体机制可能是通过
促进海马区 NTF 的表达,来维持神经细胞正常形态
和功能,促进损伤修复,避免其凋亡,最终促进神
经组织再生和功能恢复。
综上所述,手术创伤应激抑制 NTF 的表达,造
成大鼠海马神经元损伤修复障碍,大鼠出现活动减
少、学习记忆能力下降、情绪低落等中枢疲劳的表
现。人参皂苷 Rb1 可通过上调 NTF mRNA 的转录,
增强 NTF 翻译,促进神经损伤的修复,改善大鼠活
动、学习记忆能力和精神情绪,减轻中枢疲劳。
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