全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 6 期 2011 年 6 月

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小儿感冒颗粒中绿原酸测定方法的改进
吴平平 1, 2，李桂龙 2，靳文仙 2，王成港 2，王春龙 2*
1. 天津医科大学，天津 300070
2. 天津药物研究院 释药技术与药代动力学国家重点实验室，天津 300193
摘 要：目的 对小儿感冒颗粒中绿原酸测定的 HPLC 等度洗脱法进行改进，为更好地控制小儿感冒颗粒质量提供一种简
便、快速、可靠的测定方法。方法 色谱柱为 Dikma C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为 0.1 mol/L 磷酸二氢钠（pH
3.40，A）-甲醇（B），梯度洗脱，体积流量 1.0 mL/min，检测波长 328 nm。结果 绿原酸在 2.02～25.25 μg/mL 呈良好线性
关系（r＝0.999 9），平均加样回收率为 99.83%，RSD 为 1.15%。结论 采用 HPLC 梯度洗脱法测定绿原酸专属性强，准确
度高，重现性好，简便、快速，能更加有效地控制小儿感冒颗粒产品的质量。
关键词：小儿感冒颗粒；绿原酸；HPLC；梯度洗脱；质量控制
中图分类号：R286.02 文献标志码：B 文章编号：0253 - 2670(2011)06 - 1135 - 03
Improvement in determination of chlorogenic acid in Xiao’er Ganmao Granula
WU Ping-ping1, 2, LI Gui-long2, JIN Wen-xian2, WANG Cheng-gang2, WANG Chun-long2
1. Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
2. State Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin
300193, China
Key words: Xiao’er Ganmao Granula; chlorogenic acid; HPLC; gradient elution; quality control

小儿感冒颗粒是临床上用于治疗小儿感冒的中
药复方制剂。《中国药典》2010 年版关于小儿感冒
颗粒的质量标准中，仅对颗粒剂常规检查项进行检
查及对靛蓝进行薄层色谱鉴别，无含量测定项。文
献报道的测定多以板蓝根及大青叶的共同有效成分
靛蓝及靛玉红[1-3]、连翘中的连翘苷[4-5]作为测定指
标，以绿原酸为测定指标鲜有报道。菊花为处方中
的君药[6]，其有效成分绿原酸具有抗菌、抗病毒等
作用[7]，测定绿原酸可以更好地控制小儿感冒颗粒
的质量。文献报道的 HPLC 等度洗脱法[8]测定绿原
酸，分离效果好，但进样 150 min 仍有吸收峰，测
定时间较长，若测定时间设置为 40 min，会影响后
续进样的测定结果。国内也有绿原酸梯度洗脱测定
方法的报道[9-12]，但用于小儿感冒颗粒中绿原酸测
定，其分离效果不佳或样品中极性较低成分未完全
洗脱。本实验对等度洗脱法[9]进行改进，为小儿感
冒颗粒的质量控制提供一种简便、快捷、准确、可
靠的方法。
1 仪器与材料
高效液相色谱仪：Lab Alliance Series Ⅲ泵、
Model 1201+检测器（美国 lab Alliance）；Lab Alliance
工作站；AG245 型电子天平（Mettler-Toledo 公司）。
绿原酸对照品（批号 110753-200413，中国药
品生物制品检定所）；小儿感冒颗粒（批号 080701、
080702、080703，承德新爱民制药有限公司）；甲醇
为优级纯，磷酸二氢钠为分析纯，水为重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
2.1.1 等度洗脱法 参考文献的色谱条件[8]，色谱
柱为 Dikma C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流
动相为 0.1 mol/L 磷酸二氢钠-甲醇（80∶20），体积
流量 1.0 mL/min，检测波长 328 nm，柱温 35 ℃，
进样量 20 μL。
2.1.2 梯度洗脱法 流动相为0.1 mol/L磷酸二氢钠
（pH 3.40，A）-甲醇（B），梯度洗脱程序： 0～20 min，
80% A；20～25 min，80%～20% A；25～35 min，

收稿日期：2010-12-14
作者简介：吴平平（1986—），女，海南省儋州市人，硕士研究生，主要从事药物制剂方面研究。Tel: 13902152901 E-mail: wumuping@126.com
*通讯作者 王春龙 Tel: (022)23003212 E-mail: dds-wcl@vip.sina.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 6 期 2011 年 6 月

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20% A；35～40 min，20%～80% A；其余色谱条件
同等度洗脱法。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，
精密称定，加 50%甲醇溶解并稀释制成 5 μg/mL 对
照品溶液，并于 10 ℃以下保存备用。
2.2.2 供试品溶液的制备 取小儿感冒颗粒细粉约
5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入 50%甲醇
50 mL，称定质量，超声处理 30 min，放冷，再称
定质量，用 50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，
精密量取续滤液 5 mL，置 25 mL 棕色量瓶中，加
50%甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.3 阴性对照液的制备 取缺菊花的处方药，按
制备工艺制备成阴性对照颗粒剂，按供试品溶液的
制备方法制备阴性对照液。
2.3 测定方法的选择
分别采用等度洗脱法和梯度洗脱法测定供试品
溶液，色谱图见图 1。采用等度洗脱法，绿原酸峰
与相邻杂质峰均能达到很好的分离（R 均大于 1.5），
但样品在进样约 150 min 时仍有较大的吸收峰，测
定时间较长。为了达到准确、简便、快速测定绿原
酸的目的，选择 HPLC 梯度洗脱法测定小儿感冒颗
粒中绿原酸。
2.4 梯度洗脱方法学考察





*-绿原酸
*-chlorogenic acid

图 1 等度洗脱（A）和梯度洗脱（B）供试品的 HPLC
色谱图
Fig. 1 HPLC chromatograms of sample used in isocratic
elution (A) and gradient elution (B)

2.4.1 专属性试验 将阴性对照液、对照品溶液、
供试品溶液分别进样测定，记录色谱图（图 2）。可
知样品中绿原酸与其他成分能完全分离（R＞1.5），
且阴性对照无干扰。
2.4.2 线性关系考察 称取绿原酸对照品约 5 mg，




*-绿原酸
*-chlorogenic acid

图 2 阴性对照（A）、对照品（B）、供试品（C）的 HPLC 色谱图
Fig. 2 HPLC chromatograms of negative sample (A), reference substance (B), and sample (C)

精密称定，置 50 mL 棕色量瓶中，加 50%甲醇溶解
定容，得对照品储备液。分别移取 0.2、0.6、1.0、
1.5、2.0、2.5 mL 储备液置 10 mL 量瓶中，加 50%
甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，依次进样测定，以
峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回
归，得回归方程 Y＝77 256 X＋4 607.3，r＝0.999 9，
表明绿原酸在 2.02～25.25 μg/mL 线性关系良好。
2.4.3 精密度试验 取批号 080701 的供试品溶液，
连续进样测定 6 次，记录峰面积，计算得绿原酸峰
面积的 RSD 为 0.81%。
2.4.4 稳定性试验 取批号 080701 的供试品溶液，
分别于 0、2、4、6、8 h 进样测定，记录峰面积，
计算得绿原酸峰面积的 RSD 为 1.14%。表明供试品
溶液在 8 h 内稳定。
2.4.5 重现性试验 取批号 080701 的样品 6 份，制
备供试品溶液，分别进样测定，记录峰面积，计算
得绿原酸质量分数的 RSD 为 1.00%。
2.4.6 加样回收率试验 取批号 080701 的小儿感
A *
*
B
0 40 80 120 160
* *
A B C
0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40
t / min
0 40 80 120 160
t / min
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冒颗粒适量，研细后，取 2.5 g 细粉 9 份，精密称定，
分别加入 0.75、1.10、1.30 mg 绿原酸对照品，制备
供试品溶液，分别进样测定，计算得绿原酸平均加
样回收率为 99.83%，RSD 为 1.15%。
2.5 2 种方法的样品测定结果
分别取 3 批样品制备供试品溶液，各采用等度
洗脱和梯度洗脱法进行测定，连续进样测定 3 批样
品，每批测定 3 次，结果见表 1。

表 1 样品测定结果（n＝3）
Table 1 Determination of samples (n = 3)
梯度法 等度法
批 号 绿原酸/
(mg·g−1)
测定时间/
min
绿原酸/
(mg·g−1)
测定时间/
min
080701 0.382 0.376
080702 0.380 0.373
080703 0.378
40
0.381
160

3 讨论
3.1 测定方法的选择
根据参考文献报道方法[8]，供试品溶液在进样
40 min 后（约 100、110、150 min）仍有较大吸收
峰，原因可能是小儿感冒颗粒为复方制剂，成分较
多，一些极性相对较低的成分在色谱柱上的吸附较
强难以被洗脱，若进样时间设置为 40 min，极性较
低成分会干扰连续进样的测定结果。参照《中国药
典》2010 年版菊花中绿原酸测定的梯度法，40 min
时供试品溶液非极性成分未被洗脱；采用梯度洗脱
程序[9-12]，分别以甲醇-0.4%磷酸溶液、甲醇- 0.5%
冰醋酸、乙腈-2%冰醋酸、甲醇-水-乙酸进行梯度洗
脱，小儿感冒颗粒中绿原酸不能完全分离或程序时
间（40 min）内洗脱不完全。本实验在等度洗脱的
基础上，通过改变洗脱过程中流动相各溶剂组成的
比例，使测定方法简便、快速，降低了成本，同时
又能准确测定绿原酸的含量。
3.2 提取工艺考察
考察超声与回流对菊花中绿原酸提取效率的影
响时，分别回流提取 2 h 和超声 30 min，测得绿原
酸的量分别为 0.400、0.388 mg/g，两种方法的提取
效率相当。但由于回流操作繁琐费时，误差较大，
因此选择超声提取，方法简便，且易于重复操作。
绿原酸为极性较强的有机酸，易溶于水和甲醇[7]，
分别考察纯水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲
醇作为溶剂对绿原酸提取效率的影响，结果测得绿
原酸的量分别为 0.384、0.383、0.388、0.250、0.283
mg/g。当甲醇比例大于 50%时，提取不完全；甲醇
比例小于 50%时，提取效果相当，但随着水相比例
的增加，提取液中水溶性成分增多而使得测定变得
麻烦，故选择 50%甲醇作为提取溶剂。
3.3 水相 pH 值的考察
配制0.1 mol/L磷酸二氢钠-磷酸调整pH值分别
为 3.30、3.35、3.40、3.45、3.50，考察不同 pH 值
条件下样品中绿原酸的分离情况。结果表明 pH 值
对绿原酸与相邻后峰的分离度无明显影响，都能达
到完全分离（R＞1.5）；对绿原酸与相邻前峰的分离
影响较大，R 值分别为 0.98、1.90、1.53、1.84、1.06，
可知水相 pH 值在 3.35～3.45 分离效果较好，因此
选择水相 pH 值为 3.40。
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