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Study on excretion of pseudo-ginsenoside GQ

伪人参皂苷GQ的排泄试验研究



全 文 :invitro.Method:80% ethanolextractsofS.parasiticaparasitizingonNerniumindicum,Morusalba,Opsmanthusfragrans,andSapin
dusmulorosiwerepurifiedbypolyamidescolumnchromatography,andtheeluatesof30%,50%,70% and90% ethanolweremixedas
flavonoidsextracts.HumanacutemyeloidleukemiacellineHL60wasusedtoevaluatethecytotoxicityinducedbyflavonoidsextractsof
S.parasiticaLwithMTTassay.ApoptosiswasdetectedbyAO/EBfluorescencestainingandDNAfragmentationanalysis,apoptosisrates
andcelcycledistributionweredetectedbyflowcytometryanalysis.Result:ExtractofS.parasiticaparasitizingonN.indicum(NIS
PEX)wasthemostsensitivetoHL60celsofthe4diferenthosttrees,theIC50valuebeing060mg·L
-1;andextractofS.parasitica
parasitizingonMalbatookthesecondplace,theIC50value,being249mg·L
-1;extractofS.parasiticaparasitizingonO.fragrans
hadnoefectivenessashighas50mg·L-1concentration.NISPEXinducedHL60celapoptosisandinhibitedthecelproliferationin
doseandtimedependentmanner.CelcycleswerearestedatG0G1phaseaftertreatedwithNISPEX.Conclusion:Anticancerefectsof
S.parasiticacorelatedwiththehosttrees.FlavonoidsextractsofSparasiticaparasitizingonN.indicumexhibitedcomparativelybeter
anticanceractivityinvitroamongthehosttreesstudied.NISPEXisfoundtobeagoodcandidateforanticancer.
[Keywords] Scurulaparasitica;Nerniumindicum;flavonoids;cardiacglycoside;HL60;celproliferation;celapoptosis
[责任编辑 古云侠]
[收稿日期] 20070520
[通讯作者] 李平亚,Tel:(0431)85619803,Email:lipy@jlu.
edu.cn
伪人参皂苷 GQ的排泄试验研究
赵春芳1,刘金平2,赵 岩2,李平亚2
(1.吉林大学 药学院 药物分析,吉林 长春 130021;
2.吉林大学 再生医学科学研究所,吉林 长春 130021)
[摘要] 目的:研究大鼠舌下静脉给药伪人参皂苷 GQ后,其在胆汁、粪和尿中的排泄情况。方法:采用高效
液相蒸发光散射色谱(HPLCELSD)法测定大鼠胆汁、粪和尿中伪人参皂苷GQ,DiamonsilC18色谱柱(46mm×250
mm,5μm),以甲醇水(24∶7)为流动相,流速10mL·min-1,检测温度为50℃,灵敏度为10,以氮气为载气,压力
为303975Pa。结果:HPLCELSD测定方法的标准曲线线性关系、样品回收率和日内、日间精密度均符合要求。伪
人参皂苷GQ大鼠舌下静脉给药后,主要以胆汁排泄为主,占总药量的 4160%;其次为粪排泄,占总药量的
997%;尿液中仅检出少量伪人参皂苷GQ。结论:大鼠胆汁、粪和尿中主要以伪人参皂苷GQ原形药物排泄。
[关键词] 伪人参皂苷GQ;蒸发光散射检测法;药物排泄
[中图分类号]R285.5 [文献标识码]A [文章编号]10015302(2008)04043204
  西洋参PanaxquinquefoliumL.为五加科人参属
植物,具有补气养阴,清热生津之功效。实验结果表
明,西洋参含有很多的生物活性物质[1],人参皂苷
被公认为西洋参和人参的主要活性成分,其中奥柯
梯隆型(ocotilol)人参皂苷是区分西洋参与人参的
重要标志之一,是更具生物活性的一类人参皂苷,人
参中不具有该类成分。课题组在对西洋参果实及其
茎叶中人参皂苷的分离、纯化、合成以及生物活性进
行了较深入研究[24]的基础上,通过结构修饰方法,
将人参皂苷 Rg3转化为具有奥柯梯隆型的新化合
物———伪人参皂苷 GQ(PGQ)[5](已获得了发明专
利)。经过体内、外对其生物活性研究结果表明:
PGQ具有很强的抗心肌缺血作用,几乎无不良反
应[3,6]。本研究建立了用 HPLCELSD法测定胆汁、
粪和尿排泄物中的 PGQ的方法,对 SD大鼠舌下静
脉给药后的胆汁、粪和尿排泄情况进行了研究。
1 材料
1.1 药物
伪人参皂苷GQ(PGQ)由吉林大学再生医学科
学研究所新药研究室提供,纯度>99%。
1.2 动物
Wistar大鼠,体重180~250g,雌雄兼用,吉林
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大学基础医学院试验动物中心提供,合格证号:医动
字第105110号。实验前大鼠禁食12h,自由饮水。
1.3 仪器
LC-1OATVP高效液相色谱仪(日本岛津公
司);SEDEX75蒸发光散射检测器(法国);N2000
色谱数据工作站(浙江大学智能信息工程研究所);
XW-80A涡旋混合器(上海精科实业有限公司)。
800型台式电动离心机(浙江省金坛市江南仪器
厂)。大鼠代谢笼(苏州试验动物笼器厂)。DY89
-I型电动玻璃匀浆机(宁波新芝科器研究所)。
KQ-50B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公
司)。StrataC18-固相萃取柱(法国迪马公司)。
1.4 试剂
甲醇(色谱纯)。人参皂苷 Rb1内标物(自制,
纯度>99%)。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的配制
精密称取PGQ对照品适量,置于10mL量瓶中,
加甲醇溶解并制成10mg·mL-1的PGQ甲醇溶液。
精密称取内标物Rb1适量,置于10mL量瓶中,加甲
醇溶解并制成10mg·mL-1的Rb1甲醇溶液。
2.2 生物样品处理方法
2.2.1 大鼠胆汁样品 乙醚麻醉大鼠,打开腹腔,
以聚乙烯管做胆总管插管,引流胆汁,术后置于37
℃恒温箱内,待稳定后,PGQ按12mg·kg-1体重舌
下静脉给药,于药后不同时间0~1,1~2,2~3,3~
5,5~7,7~9,9~12,12~24h分段收集胆汁,记录
胆汁体积。
  取胆汁样品200μL,加入甲醇800μL,加入内
标物Rb1适量,涡漩混合5min后,4000r·min
-1
离心10min,取上清液加水30mL,混匀,上 Strata
C18固相萃取柱,依次用水20mL,20%甲醇20mL
洗柱、甲醇3mL洗脱,收集甲醇液,40℃水浴下氮
气吹干,残渣加入色谱甲醇200μL涡旋溶解,待分
析。
2.2.2 大鼠尿、粪样收集 5只健康SD雄性大鼠,
置代谢笼中,按PGQ12mg·mL-1舌下静脉给药,分
别收集0~4,4~8,8~12,12~24,24~48h的尿液
和粪便。记录各时段尿样体积,称粪样质量。
取尿样 01mL,加甲醇 04mL,加入内标物
Rb1适量,涡漩混合5min后,4000r·min
-1离心10
min,分取上清液加水15mL,同2.2.1项下操作。
取称重后的粪样,按1∶10比例加水匀浆;分取
20mL,加入内标物 Rb1适量,涡漩混合5min后,
4000r·min-1离心10min,分取上清液加水6mL,
混匀,同2.2.1项下操作。
2.3 色谱条件
DiamonsilC18色谱柱(46mm×250mm,5
μm),以甲醇水(24∶7)为流动相,流速 10mL·
min-1,检测温度为50℃,灵敏度为10,以氮气为载
气,压力为303975Pa,柱温20℃,进样量20μL。
2.4 专属性试验
取空白生物样品按处理和测定方法操作,其色
谱图见图 1。由图可知,在选定色谱条件下,PGQ
(保留时间约 14min)与内标 Rb1(保留时间约 10
min)、内源性物质分离良好。见图1~3。
图1 大鼠胆汁HPLC图
a.对照品;b.给药后胆汁样品;c.空白胆汁
图2 大鼠尿样HPLC图
a.对照品;d.给药后尿样;c.空白尿样
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图3 大鼠粪样HPLC图
a.对照品;b.给药后粪样;c.空白粪样
2.5 线性关系考察
分别取空白生物样品,分别加入PGQ与Rb1甲
醇溶液适量,配制成一系列标准溶液,进样检测,绘
制色谱图。以PGQ峰面积的对数与 Rb1峰面积的
对数比值为横坐标,以 PGQ浓度的对数为纵坐标,
进行线性回归,得回归方程。结果见表1。
表1 PGQ生物样品线性关系考察
生物
样品
系列标准溶液
/μg·mL-1
回归方程 r
胆汁 25,10,25,50,75 Y=52356X-36928 0994
尿  25,5,10,15,20 Y=60755X-51762 0995
粪  25,5,10,15,20 Y=47907X-39334 0999
  结果表明,胆汁中PGQ在25~75μg·mL-1
呈良好的线性关系。尿样与粪样中PGQ在25~20
μg·mL-1呈良好的线性关系。
2.6 精密度和回收率试验
取空白的生物样品,加入 PGQ与 Rb1对照品,
制成高、中、低3个不同剂量的对照品溶液,每个浓
度5份,分别照其样品处理方法项下操作,分别进行
回收率和精密度试验。结果表明方法的回收率、日
内精密度和日间精密度均符合要求。结果见表2。
2.7 药物排泄结果
大鼠生物样品中PGQ按“标准曲线法”定量,大
鼠舌下静脉给 PGQ后不同时间胆汁、尿、粪中药物
浓度及排泄试验结果分别见表3~5。
表2 PGQ生物样品精密度和回收率
样品
剂量
/μg·mL-1
日内精密度(n=5)
珋x±s RSD/%
日间精密度(n=3)
珋x±s RSD%
回收率(n=5)
珋x±s RSD/%
胆汁 35 296±024 802 290±012 381 8444±677 802
  25 2258±262 1160 2436±312 1281 9032±1047 1160
  75 7192±466 647 7503±410 507 9589±621 647
尿  35 314±014 420 306±019 591 8981±377 420
  10 954±034 350 921±097 1053 9539±334 350
  20 1882±078 414 1871±040 211 9411±389 414
粪  35 313±021 641 316±047 1482 8947±573 641
  10 951±050 517 899±097 1074 9507±492 517
  20 1881±116 614 1893±014 071 9404±578 614
表3 大鼠舌下静脉给PGQ12mg·kg-1后不同时间
胆汁中药物质量浓度(珋x±s,n=6)
时间/h 质量浓度/μg·mL-1
0~1 64374±3965
1~2 25690±739
2~3 10501±795
3~5 18442±2218
5~7 2291±319
7~9 1592±190
9~12  931±138
12~24  321±340
表4 大鼠舌下静脉给PGQ12mg·kg-1后不同
时间的尿、粪样品药物质量浓度(珋x±s,n=5)
时间/h 尿/μg·mL-1 粪/μg·g-1
0~4 128±021 8264±991
4~8 - 12956±1516
8~12 - 8278±732
12~24 - 3262±441
3 讨论
药物的排泄为药物代谢动力学研究的重要组成
部分,本试验研究选择排泄途径中主要的肾脏排泄、
胆汁排泄以及粪排泄。首次对具有抗心肌缺血生物
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表5 大鼠舌下静脉给PGQ12mg·kg-1后的
排泄情况(珋x±s)
样品
累计排泄量
/μg
占总药量
/%
排泄速率
/μg·h-1
胆汁 118121±9997 4160±365 4922±417
尿样   209±027 0079±0011 052±0067
粪样  26467±2374 997±083 1103±099
活性的新化合物PGQ进行了药物体内排泄实验。
对大鼠舌下静脉PGQ后的胆汁、尿和粪排泄物
进行了研究,在不同时间内大鼠胆汁中 PGQ的含
量,胆汁中 PGQ的药物排泄量0~1h最高,3h内
随时间推移逐渐下降,但在3~5h浓度有所增加,
这可能是由于 PGQ在肠道不同部位有所吸收入血
所致,随后逐渐下降。在粪排泄物中 PGQ的含量在
4~8h最高,在24h以后未检出。尿液中,仅在0~
4h段检出少量。PGQ舌下静脉给药后主要以胆汁
排泄为主,占总药量的4160%;其次为粪排泄,占
总药量的997%。在胆汁、尿和粪排泄物均以原形
药物检出,未发现其他代谢产物。
  试验中生物样本的处理采用 StrataC18-固相
萃取柱大大减少了其他杂质成分对测定结果的影
响。建立了胆汁、尿和粪中 PGQ的高效液相蒸发
光散射测定方法用,方法简便,精密度回收率好,不
失为一种实用的药代动力学研究检测方法。
[参考文献]
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2007:423.
StudyonexcretionofpseudoginsenosideGQ
ZHAOChunfang1,LIUJinping2,ZHAOYan2,LIPingya2
(1.PharmaceuticalAcademyofJilinUniversity,Changchun130021,China;
2.InstituteofFrontierMedicalScienceofJilinUniversity,Changchun130021,China)
[Abstract] Objective:TodeterminethepseudoginsenosideGQ(PGQ)inratbile,fecesandurine,andtostudyontheex
cretionofpseudoginsenosideGQ.Method:Reversephasehighperformanceliquidchromatography(RPHPLC)methodwithane
vaporativelightscateringdetector(ELSD)wasperformedonDiamonsilTM C18column(46mm×250mm,5μm),andthemobile
phasewasconsistedofmethanolwater(24∶7)withflowrateof10mL·min-1.ELSDparametersweresetasfolows:nitrogengas
pressure30bar,drifttubetemperature50℃.Result:Themethodfulfiledalthestandardrequirementsofprecision,accuracyand
linearity.ThemainwayofexcretionofPGQinratadministratedthroughsublingualveinwasatthebile.Thebileexcretionratioof
PGQwas4160%,andfecesexcretionratiowas997%.OnlytraceamountofPGQwasexcretedinurine.Conclusion:Almostal
unchangedPGQwasexcretedinbile,fecesandurine.
[Keywords] pseudoginsenosideGQ;ELSD;excretion
[责任编辑 古云侠]
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