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Effect of Puerarin and Daidzein on proliferating vascular smooth muscle cells

葛根素与大豆苷元对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用



全 文 :葛根素与大豆苷元对
血管平滑肌细胞增殖的抑制作用
韩 静t o王 伟t 3 o王绿娅u o刘 舒u o康铁朵u
kt q北京中医药大学 东直门医院 中心实验室 o北京 tsssu| ~
u q北京市安贞医院 o北京 tsssu|l
≈摘要  目的 }研究葛根素与大豆苷元对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用 o并探讨其机制 ∀方法 }分离培养人
脐动脉平滑肌细胞 o不同浓度葛根素 !大豆苷元与细胞共孵育 o使用 ×× 法检测细胞活性 o同时用 •·2°≤• 法检测
≥∏µ√¬√¬±o…¦¯2¬¯ o…¤¬oŠ¤³§« °• ‘„的表达 ∀结果 }葛根素与大豆苷元都可降低细胞增殖活性 o升高 …¤¬rŠ¤³§«r …¦¯2
¬¯rŠ¤³§«的比值 ∀与葛根素组相比 o相同浓度的大豆苷元组细胞活性较低 o…¤¬rŠ¤³§«r …¦¯2¬¯rŠ¤³§«比值较高 ∀结
论 }与葛根素相比 o大豆苷元抑制血管平滑肌细胞增殖的作用更强 ∀
≈关键词  葛根素 ~大豆苷元 ~…¤¬~…¦¯2¬¯ ~血管平滑肌细胞 ~增殖
≈中图分类号  • u{x qx ≈文献标识码  „ ≈文章编号  tsst2xvsukusswlsx2swvz2sw
植物中广泛存在的黄酮具有抑制蛋白酪氨酸激
酶 !抑制拓扑异构酶 !抑制 ≤⁄Žk¦¼¦¯¬± §¨ ³¨ ±§¨±·®¬2
±¤¶¨l的作用 o可作用于多个靶点抑制多种细胞增生 ∀
葛根素与大豆苷元都属于异黄酮类药物 o化学结构
相似 o一个是苷 o一个是相对应的苷元部分 ∀有报道
表明葛根素可抑制血管平滑肌细胞k∂≥≤l增殖 o并
可诱导其凋亡 ~大豆苷元可抑制大鼠主动脉平滑肌
细胞的增生及 ⁄‘„的合成 ∀细胞凋亡受众多基因调
控 o…¦¯2¬¯ o…¤¬是其中经典调控凋亡的基因 ∀
研究葛根素与大豆苷元对 …¦¯2¬¯ o …¤¬调控作用
并探讨其机理 o对于寻找更有效的预防动脉硬化 !°×2
≤„k经皮腔内冠状动脉成形术l术后再狭窄 !高血压
等血管增生性疾病具有重要意义 ∀
1 材料和方法
1 q1 脐带 由北京安贞医院妇产科提供 ∀
1 q2 主要仪器 ≤’u培养箱 o超净工作台 o倒置相差
显微镜 o°µ²ª¨ ±¨ °≤• 仪 o…¬²¶·¨³凝胶成像系统等 ∀
1 q3 药物和试剂 胎牛血清 !⁄∞ 培养基 !×µ¬½²¯
由 ŠŒ…≤’公司提供 o2∏∂ 酶转录试剂盒由 …Œ公
司提供 ∀葛根素及大豆苷元纯度大于 |{ h o由中国
药品生物制品检定所提供 ∀ פ´ ³¯∏¶酶由鼎国公司
提供 ∀ °µ¬°¨ µx qs 软件设计引物 o上海生物工程公
≈收稿日期  ussv2tu2st
≈基金项目  北京市科委重点实验室项目k|xv{xszss2wl
≈通讯作者  3 王伟 o ר¯ }kstslywu{ywzu o ƒ¤¬}kstslywu{ywzu o
∞2°¤¬¯}¼«ºº ƒ °¬q¦¨¬qª²√ q¦±
司合成 o引物序列如表 t所示 ∀
表 t 引物
基因 引物序列 长度
Š¤³§« 上游 „׊„≤≤„≤„Š xuy¥³
×≤≤„׊≤≤„×
下游 ××≤≤×≤×׊×
Š≤×≤×׊≤׊
…¦¯ p ¬¯ 上游 ×׊Š„≤„„׊ zyx¥³
Š„≤׊Š×׊„
下游 Š×„Š„Š×ŠŠ„
׊Š×≤„Š×Š
…¤¬ 上游 ŠŠ„≤≤≤ŠŠ×Š w{z¥³
≤≤×≤„ŠŠ„
下游 ≤„„„Š„׊Š×
≤„≤ŠŠ×≤׊≤
≥∏µ√¬√¬± 上游 ≤׊„Š≤׊≤„
ŠŠ××≤≤×ׄ×≤ vsw¥³
下游 ×≤׊≤≤„Š„≤
Š≤××≤≤ׄ×≤
1 q4 细胞培养及分组 原代培养采用组织贴块法 o
培养液为 us h 胎牛血清加 ⁄∞ 培养基 ∀取新生
儿脐动脉 o中间剪开 o放入 ⁄2‹¤±®¶液中冲洗 o剥净外
膜后用弯头吸管轻轻刮除内膜 o撕取内 urv层中膜组
织 o剪成约 t °°u的小组织块接种于培养瓶内 o将培
养瓶置于 vz ε ox h ≤’u培养箱内 o让平滑肌细胞贴
壁 w «后加培养液 t °o然后置于 vz ε ox h ≤’u 培
养箱内培养 uw «后补液至 x °o以后每隔 v ∗ x §换
液 o倒置显微镜下动态观察细胞生长情况 ∀待细胞
生长融合出现/峰与谷0结构后 o用含 s qtux h胰蛋白
酶和 s qst h ∞⁄ׄ 的混合消化液消化 !传代培养 ∀
第 v代细胞用抗 Α2¤¦·¬±肌动蛋白抗体免疫组化法进
#zvw#
第 u|卷第 x期
ussw年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ x
¤¼oussw
行鉴定 ∀实验用第 w ∗ x代细胞 ∀
1 q5 ××检测细胞活性 于 |y孔板k≤²¶·¤µ公司l内
接种每孔 x sss个细胞 o继续培养 o待长满到 ys h时
开始实验 ∀加入终浓度分别为 s qt ot ox o ux o tss
Λ°²¯#pt的葛根素及大豆苷元 o培养液为无血清的
⁄∞ 培养基 o平行 v孔 ∀刺激 uw «之后 o加入终浓
度分别为 s qt ot ox oux otss Λ°²¯#pt的葛根素及大豆
苷元继续培养 o培养液为 ts h 胎牛血清培养基 o刺激
uw «o加入 °…≥溶解的 ××kv2≈w ox2§¬°¨ ·«¼¯·«¬¤½²¯½¼¯  2
u ox2§¬³«¨ ±¼¯ ·¨·µ¤½²2§¬∏°¥µ¬²°¬§¨lk≥¬ª°¤公司lx ª#pt
us ˏow «后弃去培养基 o加入 uss ˏ⁄≥’ o摇匀 ts
°¬±o于 xzs ±° 测量吸光度 ∀空白对照吸光度设为
tss h o不同浓度葛根素及大豆苷元刺激细胞的吸光
度与之比较 o重复 v次 o取平均值作图 ∀
1 q6 ŠŒ…≤’ 一步法提取 • ‘„ 细胞培养同 1 q4 o根
据 ××实验结果确定各组浓度 ∀分 w 组 o对照组k加
入无血清培养基 o⁄∞l o低浓度组k加入无血清培
养基和 t Λ°²¯#pt葛根素及大豆苷元l o中浓度组k加
入无血清培养基和 x Λ°²¯#pt葛根素及大豆苷元l和
高浓度组k加入无血清培养基和 ux Λ°²¯#pt葛根素
及大豆苷元l o分别刺激 uw «o之后分别加入 ts h 胎
牛血清培养基 o并在低浓度组加入 t Λ°²¯#pt葛根素
及大豆苷元 o中浓度组加入 x Λ°²¯#pt葛根素及大豆
苷元 o高浓度组在加入 ux Λ°²¯#pt葛根素及大豆苷
元 o刺激 uw «提取 • ‘„ ∀每 ux ¦°u细胞培养瓶加入 u
°×µ¬½²¯ 反复吹打 o吸到 t qx °⁄∞°≤处理过的离心
管内 o加入 uss ˏ氯仿振荡 ow ε tu sss µ#°¬±pt离心
t x °¬± o取上清液加入s qx °异丙醇沉淀 owβ ≤
tu sss µ#°¬±pt离心 tx °¬±o沉淀 ozx h 乙醇洗 t 次 o
然后进行鉴定 ∀ ≠ Α值比值 }ΑuysrΑu{s o 双甲电泳
鉴定 • ‘„纯度 ∀
1 q7 反转录聚合酶链反应 t ˏ• ‘„加 u ˏ’¯¬ª§×
混合 ozs ε x °¬±o冰上 o加入 x ≅ ¥∏©©¨µow °¬±o加入 t
ˏ核酸酶抑制剂和 u ˏ§‘×° ovz ε x °¬±o加入 t ˏ
2∏∂ owu ε t «ozs ε ts °¬±∀以 Š¤³§«为内对
照 o进行半定量反转录多重聚合酶链反应 ∀体系 }模
板 s qx ˏo§‘×° ts °°²¯ o Š¤³§«上下游各 x ³°²¯ o
≥∏µ√¬√¬±或 …¤¬ o…¦¯2 ¬¯上下游各ux³°²¯ oפ´ ³¯∏¶酶
u qx ˜ ots ≅ ¥∏©x ˏ加水至 xs ˏ∀首次循环先在
|x ε 变性 v °¬±o变性 !退火 !延伸分别为 |x ε oxs ¶~
x{ ε oxs ¶~zu ε ot °¬± ts ¶o共 ux个循环 ozu ε tss
°¬±∀聚合酶链反应产物用 t qx h 琼脂糖凝胶电泳鉴
定并扫描 ∀重复 u次 ∀
1 q8 统计学方法 应用 ≥°≥≥ts qs软件包 o样本率的
比较用 ςu检验 oΠ s qsx示差异有显著性意义 ∀
2 结果
2 q1 ×× 结果 从 ×× 结果可见大豆苷元在高浓
度胎牛血清的培养条件下 os qt ∗ tss Λ°²¯#pt均可
抑制平滑肌细胞生长 otss Λ°²¯ #pt抑制作用最明
显 o抑制率达 ys h ∀葛根素各浓度亦抑制 ∂≥≤ 增
生 o但与大豆苷元相比作用较弱 otss Λ°²¯ #pt甚至
出现促进 ∂≥≤增生的作用 o如图 t所示 ∀
图 t ××法检测不同浓度大豆苷元及葛根素刺激平滑
肌细胞 uw «后的细胞活性k设对照组为 tl
„ q葛根素 ~…q大豆苷元
2 q2 •·2°≤• 结果 随着葛根素 !大豆苷元浓度的升
高 …¤¬rŠ¤³§«r …¦¯2¬¯rŠ¤³§«比值逐渐升高 o相同浓度
时 o与葛根素组相比 o大豆苷元组 …¤¬rŠ¤³§«r …¦¯2¬¯r
Š¤³§«比值较高 o如图 u ∗ y 所示 ∀而 ≥∏µ√¬√¬±rŠ¤³§«
与药物浓度之间无明显依赖关系 ∀
图 u •·2°≤• 检测大豆组 …¤¬ °• ‘„的表达
大豆苷元单位为 Λ°²¯#pt
图 v •·2°≤• 检测葛根素组 …¤¬ °• ‘„的表达
葛根素单位为 Λ°²¯#pt
#{vw#
第 u|卷第 x期
ussw年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ x
¤¼oussw
图 w •·2°≤• 检测大豆苷元组 …¦¯2¬¯ °• ‘„的表达
大豆苷元单位为 Λ°²¯#pt
图 x •·2°≤• 检测葛根素组 …¦¯2¬¯ °• ‘„的表达
葛根素单位为 Λ°²¯#pt
图 y 大豆苷元及葛根素对
…¤¬rŠ¤³§«r …¦¯2¬¯rŠ¤³§«表达的比较
„ q大豆苷元 ~…q葛根素
3 讨论
大量证据表明血管平滑肌细胞增殖在动脉粥样
硬化 !冠状动脉狭窄 !高血压等疾病的病理过程中扮
演着十分重要的角色≈t  o尤其是在血管内皮受损伤
后 o平滑肌细胞从中膜迁移至内膜 o在内膜中大量增
殖 o并分泌大量基质 o在血管再狭窄过程中起关键作
用≈u  ∀平滑肌细胞增殖与凋亡失控有关 o因此寻找
一种可以有效抑制平滑肌细胞增殖或促进平滑肌细
胞凋亡的药物成为当前研究的热点 ∀
细胞的凋亡是受程序化控制的 o促进凋亡的基
因与抗凋亡基因形成复杂的网络 o其中 …¦¯2u家族起
十分重要的作用 ∀ …¦¯2u家族中有 w个抑制凋亡的基
因k…¦¯2u o…¦¯2¬¯ o…¦¯2 • o≤l和两类促进凋亡的基因
k…¤¬和 …‹v结构域家族l ∀与 …¦¯2u蛋白整合于健康
细胞膜内不同 o…¦¯2¬¯ 的羟基疏水末端结合于受细胞
毒性信号刺激细胞的线粒体膜和内质网膜维持其完
整性 o可作为细胞对刺激反应性的标志 ~细胞毒性信
号同时可以引起单体 …¤¬寡聚化 o并结合于线粒体膜
上 o释放细胞色素 ≤ 激活 ≤¤¶³¤¶¨| 和 ≤¤¶³¤¶¨v≈v  ∀
…¦¯2¬¯ 和 …¤¬二者的比值在一定程度上可反应细胞凋
亡的趋势 ∀
葛根素是从野生葛根中提取得到的类异黄酮类
化合物 o化学结构为 w oz2二羟基2Β葡萄糖苷异黄酮 ∀
研究发现葛根素可以促进兔主动脉平滑肌细胞凋
亡 os qt Λ°²¯#pt葛根素的凋亡率为 tz h ∀作者选择
人脐动脉平滑肌与葛根素共孵育 o研究发现葛根素
可以抑制人脐动脉平滑肌细胞的增殖 o在 s qt ∗ ux
Λ°²¯#pt有剂量依赖关系 o最高抑制率为 us h o同本
室此前的研究结果相同≈w  ∀有报道葛根素ks qst ∗ ts
Λ°²¯#ptl可显著降低 ‹u’u诱导的平滑肌细胞凋亡
百分率 o并减少凋亡细胞 ⁄‘„断裂 o同时也减少其引
起的平滑肌细胞坏死 o这或许与葛根素的抗氧化作
用有关 ∀
大豆苷元化学结构为 w oz2二羟基异黄酮 o与葛
根素相比 o只少一个碳碳链相连的葡萄糖 ∀研究发
现它对各种肿瘤细胞系都有抑制作用 o如大豆苷元
可抑制 ≥º¬¶¶v×v细胞增殖 o阻止它通过 Št 期 o并抑
制酪蛋白激酶 o而酪蛋白激酶可以激活 „°促进有
丝分裂≈x  ~可阻滞 ‹2ys细胞于 Št 期≈y  ~可以阻碍
人及鼠黑色素瘤细胞系 • wxt oŽtzvxu的生长≈z  ∀
大豆苷元抑制多种肿瘤生长的作用机制涉及增强抗
氧化活性 o抑制血管生成 o抑制拓扑异构酶 µ !诱导
肿瘤细胞凋亡等≈{ o|  ∀除此之外 o• ¬¨­∏± °¤±等报
道 ots Λ°²¯#pt的大豆苷元可抑制 ≥‹• ≥°大鼠主动
脉平滑肌细胞的增生及 ⁄‘„的合成≈ts  ∀
作者的研究发现大豆苷元亦可抑制人脐动脉平
滑肌细胞的增殖 o在 s qt ∗ tss Λ°²¯#pt有剂量依赖
关系 otss Λ°²¯#pt的抑制率可达 ys h ∀作者进一步
做了 • ×2°≤• 实验 o当药物浓度从 t Λ°²¯#pt增至 ux
Λ°²¯#pt时 o大豆苷元组 …¤¬rŠ¤³§«r…¦¯2¬¯rŠ¤³§«的
比例从 t qs增至 t qy o而葛根素组从 s qy增至 t qs ∀
这或许从基因角度解释了大豆苷元与葛根素抑
制平滑肌细胞增殖的原因 o作用的差别也可能是大
豆苷元更偏脂溶性 o易于通过细胞膜发挥作用 ∀
≈参考文献 
≈t  Œ¶±¨ µ  oŽ¨¤µ±¨ ¼  q„³²³·²¶¬¶¬± «∏°¤±¤·«¨µ²2¶¦¯ µ¨²¶¬¶¤±§µ¨¶·¨±²2
¶¬¶q Χιρχυλατιον , t||x o|tktl }uzsv q
≈u  …²¦«¤·²± °  oŠ¤¥¥¬¤±¬ƒ o• §¨¤µ§  o ετ αλq„³²³·²¶¬¶³¤µ·¬¦¬³¤·¨¶
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第 u|卷第 x期
ussw年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ x
¤¼oussw
¬± ¦¨¯¯¤µ¬·¼ µ¨ª∏¯¤·¬²± §∏µ¬±ªµ¤·¤²µ·¬¦¬±¬·¬¤¯ ·«¬¦®¬±ªq Αµ ϑ Πατηολo
t||x otwykul }tsx| q
≈v  ≤²µ¼ ≥ o„§¤°¶ q׫¨ ¥¦¯2u ©¤°¬¯¼ }µ¨ª∏¯¤·²µ¶²©·«¨ ¦¨¯¯∏¯¤µ¯¬©¨ ²µ
§¨¤·«¶º¬·¦«q Νατυρε ρεϖoussu oukwl }ywz q
≈w  王 伟 o张 涛 o赵明镜 q五种中药黄酮对血管平滑肌细胞凋亡
的交互作用 q北京中医药大学学报 ousss ouvkwl }t{ q
≈x  Ž¼²¬¦«¬µ² ‹¬ª¤¶«¬o ‹¬µ²¶«¬’ª¤º¤µ¤q ⁄¤¬§½¨¬± ¬±«¬¥¬·¶¬±¶∏¯¬±2²µ¬±2
¶∏¯¬±2¯¬®¨ ªµ²º·«©¤¦·²µ2t2 °¨ §¬¤·¨§¶¬ª±¤¯¬±ª¬± ¦¨¯¯ ¦¼¦¯¨³µ²ªµ¨¶¶¬²± ²©
¶º¬¶¶v×v ¦¨¯¯¶q Βιοχηιµ Βιοπηψσ Αχτα ,t||w otuutktl }u| q
≈y  ≠²±ª®∏¬¬±ªo®¤½∏¼¤¶∏‘¤®¤¼¤o•∏¬‹¤±q⁄¬©©¨µ¨±·¬¤·¬²± ²©³µ²°¼¨ ²¯2
¦¼·¬¦¯¨ ∏®¨ °¬¤¦¨¯¯¶‹2ys¬±§∏¦¨§¥¼§¤¬§½¨¬± ιν ϖιτρο ¤±§ϖιϖο . Αντι2
χανχερ Ρεσ ,t||v otvvk{l }tsw| q
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≈{  毛峻琴 o宓鹤鸣 q大豆苷元异黄酮的研究进展 q中草药 ousss o
vtkul }ytu q
≈|  常志文 o刘 琦 q缺血再灌注心肌细胞凋亡及药物干预 q中国新
药杂志 ousss o|ktl }u{ q
≈ts  ≥∏≥ o ≠ «¨ ×  o¨¬‹ ≠ o ετ αλ. ׫¨ ³²·¨±·¬¤¯ ²©¶²¼¥¨¤±©²²§¶¤¶
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χερ Ρεσεαρχη , usss oykyl }uvs q
Εφφεχτ οφ Πυεραριν ανδ ∆αιδζειν ον προλιφερατινγ ϖασχυλαρ σµ οοτη µ υσχλε χελλσ
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(t . ∆ονγζηιµεν Ηοσπιταλ , Υνιϖερσιτψ οφ Τραδιτιοναλ Χηινεσε Μεδιχινε , Βειϕινγ tsssu| , Χηινα ;
u . Αρτεριοσχλεροσισ ∆επαρτµεντ , Ανζηεν Ηοσπιταλ, Βειϕινγ tsssu| , Χηινα)
[ Αβστραχτ] Οβϕεχτιϖε : ײ ²¥¶¨µ√¨·«¨ §¬©©¨µ¨±·¨©©¨¦·¶²©°∏¨µ¤µ¬±¤±§⁄¤¬§½¨¬± ²±·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²©³µ²¯¬©¨µ¤·¬±ª√¤¶¦∏¯¤µ¶°²²·«°∏¶2
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³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±¬¶¶·µ²±ª¨µ·«¤±·«¤·²©³∏¨µ¤µ¬±q
[ Κεψ ωορδσ] ³∏¨µ¤µ¬±~§¤¬§½¨¬±~…¤¬~…¦¯2¬¯ ~√¤¶¦∏¯¤µ¶°²²·« °∏¶¦¯¨¦¨¯¯ ~³µ²¯¬©¨µ¤·¬²±
≈责任编辑 方文贤 
益肾活血方对家兔血瘀模型纤溶系统作用的实验研究
詹小萍t o楼建国t o金晓莹t o孙 梅t o金晨宇t o
徐锡鸿u o秦光明t o许燕祺v o鲍 军t
kt q浙江大学 医学院 附属二院 o浙江 杭州 vtsss| ~u q浙江中医研究院 o浙江 杭州 vsstyv ~
v q浙江省兰溪市人民医院 o浙江 兰溪 vuttss l
≈摘要  目的 }探讨益肾活血药对家兔血瘀模型纤溶系统的作用 ∀方法 }兔 vs只 o随机分为健康组 !模型组 !
益肾活血方大剂量组和小剂量组 !血栓宁组 o各组相应处理后分别取静脉血检测组织型纤溶酶原激活剂k·2°„l !纤
溶酶原激活剂抑制物k°„Œl !纤维蛋白原kƒ¥ªl ! ∆2二聚体 k⁄⁄l ∀每组随机取一只内脏作病理检查 ∀结果 }·2°„ o
°„Œoƒ¥ªo⁄⁄o健康组与模型组比 Π s qst o大 !小剂量组 !血栓宁组与模型组比 Π s qsx o大 !小剂量组与血栓宁组比
Π s qsx o大剂量组与小剂量组比 Ё s qsx ∀病理改变模型组较重 o血栓宁组次之 o大 !小剂量组较轻 o健康组无异
常变化 ∀结论 }造模成功 o大 !小剂量组及血栓宁组对血瘀模型纤溶系统均有作用 ~大 !小剂量组强于血栓宁组 ∀病
理改变符合血液检测变化 ∀
≈收稿日期  ussw2st2tx
≈基金项目  浙江省中医管理局立项课题k|ysvyl
≈通讯作者  3詹小萍 oר¯ }ksxztl{zz{vzzw
#sww#
第 u|卷第 x期
ussw年 x月
中 国 中 药 杂 志
Χηινα ϑουρναλ οφ Χηινεσε Ματερια Μεδιχα
∂²¯ qu| oŒ¶¶∏¨ x
¤¼oussw