全 文 ：．1316· 中草喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
HPLC一“内标’’多控法测定四逆散中芍药苷、柚皮苷、
橙皮苷、甘草酸和新橙皮苷
i
王跃生-，饶毅1。，魏惠珍1，吴有根2，张洁2，方海红2，陈银芳2
(1．中药固体制剂制造技术国家工程研究中心，江西南昌 330006}2．江西中医学院，江西南昌330006)
摘 要：目的 以四逆散为研究载体，建立。内标”多控法中药复方质量评价模式，并对该评价模式进行方法学考
察。方法 选取芍药苷作为四逆散中各成分的参照“内标”，在不同的波长下测定各成分相对于内标成分的校正因
子，利用校正因子和芍药苷对四逆散中柚皮苷、橙皮苷、甘草酸和新橙皮苷进行测定。结果 芍药苷0．2812～
1．6870Pg(r=0．9996)、柚皮苷0．570O～3．4200pg(r一0．9994)、橙皮苷0．0502～0．3012Fg(r----0．9999)、新
橙皮苷0．523～3．1380pg(r一0．9999)、甘草酸铵0．331O～1．9860Fg(r=0．9998)与峰面积呈良好线性关系。结
论 建立四逆散中柚皮苷、橙皮苷、甘草酸和新橙皮苷相对于芍药苷的校正因子，比较外标法与。内标”多控法测定
的结果，表明“内标”多控法对中药复方多成分质量控制是可行的、实用的。
关键词：四逆散；芍药苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；甘草酸铵；“内标”多控法I高效液相色谱
中图分类号：R286．1 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2008)09—1316—04
Determinationofpeoniflorin，naringin，aurantiamarin，neohesperidin，andmmonium
glycyrrhizinatenSiniPowderbyHPLC一“internalstandard”multi-controlmethod
WANGYue—shen91，RAO—Yi¨，WEIHu —zhenl，WUYou—gen2，ZHANGJie2，
FANGHai—hon92．CHENYin—fan92
(1．TheNationalPharmaceuticalEngineeringCenterforSolidPreparationinChineseHerbalMedicine，Nanchang330006，
ChinaI 2．JiangxiUn versityofTraditionalChineseMedicine，Nanchang330006，China)
Abstract：ObjectiveToes ablishanewqualityevaluationmethodf rChinesecompoundmedicine，
usingthe“internalstandard”inSinPowderr ferencesubstancedtOcalculatemulti—componentssimul．
taneously．MethodsR lativecorrectionfactors(RCF)ofnaringin，aurantiamarin，neohesperidin，ammo—
niumglycyrrhizinate，andacharacteristiccomponentp oniflorinasmarker，werecalcalatedin hechro·
matographicconditionsforthedeterminationofSiniPowderasaresearchmodel．Thecontentofpeoni—
florinwasdeterminedbyexternalstandardmethod，andthoseofnaringin，aurantiamarin，neohesperidin，
andammoniumglycyrrhizinnatewerecalculatedbyRCFcomparedwithpeoniflorin．Theaccuracyofthe
newmethodwasevaluatedbycomparingthecalculatedcontentswiththedeterminedco tents．Results
Thelinearresponserangesofpeoniflorin，naringin，aurantiamarin，neohesperidin，andammoniumgly—
cyrrhizinatewere0．2812—1．6870／．tg(r=0．9996)，0．5700--3．4200pg(，．一0．9994)，0．0502—
0．3012弘g(，．一0．999)，0．0502—0．3012 pg(，．=0．9999)，0．5230—3·1380pg(，．=0．999)，
0．3310——1．9860弘g(广=0．9998)．ConclusionForthefirsttime，“internalstandard”multi—control
methodiSadoptedinHPLCdetermination{orfivere{erencesubstancesinSiniPowder．Theassaydemon—
strateshatthemethodiSfeasibleandavalableforthequalitycontrolofSiniPowderanditiStObeanew
qualityevaluationpatternforChinesecompoundmedicines．
Keywords：SiniPowder；peoniflorin；naringin；aurantiamarin；neohesperidin；ammoniumglycyrrhi—
zinate；“internalsta dard”multi—contr01methodI HPLC
四逆散为《伤寒论》中的经典名方，由柴胡、白
芍、枳壳、甘草4味中药组成，方中各组成药味有效
部位及有效成分研究较多且药理作用相对明确。对
照品是控制药品质量的关键，然而中药复方有的对
照品价格非常昂贵，有的不稳定，使质量控制难以实
施；即使对照品价格适宜且比较稳定，现行国家标准
也是采用各个成分逐一检测来控制中药复方质量，
这给生产检验带来诸多不便。
收稿日期：2008．04—25
基拿项目：国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAl08803)
作者简介：王跃生(1960一)，山东青岛人．教授，硕士研究生导师，研究方向为中药复方质量标准控制．
Tel：(0791)7119658E—mail：wylw915@163．corn
*通讯作者饶毅Tel：(0791)7119609’E—mail：raoyi99@126．com
万方数据
中革菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1317·
大量研究实验发现，在同一中药复方各成分间
存在着一定的比例关系，只要各成分的量符合该比
例关系，中药复方的质量能基本得到全面控制。为
此，笔者提出了“内标”多控法的中药复方质量评价
模式。其基本思想是：在复方中选定一两个分离度
好、性质稳定而且对照品较容易获得的成分，作为
“内标”成分(此成分不是外加的内标物质，而是复方
中本身含有的成分，因其作用与内标物质相类似，故
命此名)，取各个成分的对照品与“内标”成分的对照
品，测定相对响应值作为校正因子，在测定中，只需
要用选定的内标性对照品，其余成分的计算则用校
正因子折算。因此本实验以四逆散为例，采用“内
标”多控法中药复方质量评价模式对其中不同性质
和种类的成分芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸和新
橙皮苷同时进行测定，对“内标”多控法中药复方质
量评价模式可行性进行了探索和论证。
1仪器与试药
Waters2695～2996高效液相色谱系统，Em—
power工作站(Waters公司)；Agilentll00高效液
相系统(Agilent公司)；LC一10AT高效液相色谱系
统(岛津公司)。
芍药苷(批号110736—200526)、柚皮苷(批号
110722—200309)、橙皮苷(批号110721—200512)、甘
草酸铵(批号110731—200511)对照品由中国药品生
物制品检定所提供，新橙皮苷对照品由中药固体制
剂制造技术国家工程研究中心对照品室制备，经光
谱确定结构，HPLC面积归一化法计算质量分数为
99．34％。四逆散为自制样品，乙腈为色谱级，水为
Milli—Q超纯水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2．1方法原理：采用测定各对照品相对于内标性对
照品的“相对校正因子”方法，将测得的“相对校正因
子”载入到各品种项下，用内标性对照品结合校正因
子的方法进行质量控制。
f=(C。／Ai)／(e／A，)
式中，为校正因子，G、A．为内标性成分的质量浓度和峰面
积，C、A，为待测成分的质量浓度和面积
2．2 内标性成分的选择：白芍为四逆散君药，其有
效成分芍药苷对照品易获得，价格适中，并且易于检
测，与其他成分分离良好，故将其列为内标性成分。
2．3色谱条件和系统适用性试验：色谱柱为依利特
HyersilODS2、ThermoHypersil—KeystoneODS、
VP一0DS；流动相：乙腈(A)一1％冰醋酸(B)，梯度洗
脱，0～25rain，20％A；25～55rain，65％A；55min
以后，95％A；检测波长：250、280nm；柱温：30℃；
体积流量：1．0mL／min。理论塔板数以芍药苷计不
低于2000。色谱图见图1。
2．4对照品溶液的配制：分别取对照品适量，精密
称定，用甲醇溶解，配制成每毫升含芍药苷56．24
pg、柚皮苷114pg、橙皮苷10．04弘g、新橙皮苷
104．6pg、甘草酸铵66．2Pg(以含甘草酸91．23％
计)的混合对照品溶液。
2．5供试品溶液的制备[1]：取四逆散0．4g，精密称
定，置回流瓶中，精密加入25mL稀乙醇，称定质
量，在水浴上回流2h，冷却，用稀乙醇补足质量，滤
过，作为供试品溶液。临用前过0．45／zm滤膜。
2．6阴性对照溶液的制备：按处方比例分别配制缺
白芍、枳壳、甘草的阴性样品，按供试品溶液的制备
方法制备各阴性对照溶液。
2．7校正因子的测定及线性范围：精密吸取混合对
照品溶液5、8、10、15、20、25、30弘L，注入色谱仪，记
录各色谱峰峰面积，计算各成分校正因子，见表1。
以进样量(X)对峰面积积分值(y)进行回归处理，回
归方程、线性范围见表2。
裹l 四逆散中各成分的校正因子
TableRCFfordifferentcomponentsinSlnlPowder
进样量／pL，(柚皮苷)，(橙皮苷)，(新橙皮苷)，(甘草酸铵)
2．8校正因子耐用性考察
2．8．1 不同色谱仪器对校正因子的影响：选用
ThermoHypersil—KeystoneODS(250mm×4．6
mm，5pm)色谱柱，分别在LC-IOAT、Waters2695--
2996和Agilentll00高效液相色谱仪上测定，计算
厂值，结果见表3。不同仪器对校正因子的影响均不
显著，校正因子值是相对稳定的数值。
万方数据
·1318· 中草菊 ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月
t／min
—h1111111111’’111111n1111’11’—1—’T1’111111。n
0 4 8 12 16 20
t／rain
2 4 B
． I
0 4 8 12 16 20
2
’3 D
4
．I‘ 』．1．。 h 一
0 4 8 12 16 20
t／min
0 4 8 12 16 20
tlmin
dmin
0 4 8 12 16 20
t／rnin
0 4 8 12 16 20
t／min
1一芍药苷2一柚皮苷3一橙皮苷4一新橙皮苷5一甘草酸铵
1-peoniflorin2-naringin3-aurantiamarin4-neohesperidin5-ammoniumglyeyrrhizinate
围1对照品在250nm(A)、280nm(B)，样品在250rim(C)、280nm(D)，缺白芍样品(250rim)(E)，
缺枳壳样品(280nm)(F)，缺甘草样品(250rim)(G)的HPLC图谱
Fig．1HPLCChromatogramsofreferenceubstancet250nm(A)，280nm(B)，sampleat250nm(C)。
280nm(D)，negatives mplwithoutRadixPaeoniaeAlbaat250nm(E)，withoutFructusCitri
AurantiiAmaraeat280nm(F)，andwithoutRadixGlycyrrhizaeat250nm(G)
裹2 四逆散各成分的线性方程及线性范围
Table2 Linearityequationsandlinearrange
ofcomponentsinSlnlPowder
裹3不同液相色谱仪对校正因子的影响
Table3 Influenceofdifferentliquidchromatographic
instrumentsonRCF
色谱仪 ，(柚皮苷)，(橙皮苷)，(新橙皮苷)-r(甘草酸铵)
Waters色谱仪11．9625
LC一10AT色谱仪12．2197
Agilent色谱仪12．5473
平均值 12．2432
13．8601
14．0799
14．3421
14．0940
11．97l
12．1683
12．0364
12．0588
I．9980
2．1100
2．0345
2．0475
RSD／％ 2．39 1．71 0．83 2．79
2．8．2不同色谱柱对校正因子的影响：HPLC测定
时会用到不同品牌或不同批号的同类型色谱柱，用
同一台液相色谱仪，分别用3种不同品牌的色谱柱
测定5种混合对照品，考察不同色谱柱对校正因子
的影响，结果见表4。不同色谱柱对校正因子的影响
均不显著，校正因子值是相对稳定的数值。
表4不同色谱柱对校正因子的影响
Table4 Effectofdifferentchromatographic
columnsoRCF
色谱柱 ，(柚皮苷)，(橙皮苷)，(新橙皮苷)厂(甘草酸铵)
Hyp依ers利特il0。s2
11．5416 14．2645 11．9432 1．9980
ThermoHypersil一11．9625 13．4601 12．3221 1．9470
KeystoneODS
VP—ODS12．6894 14．4761 11．8631 2．1000
均值 12．0645 14．0669 12．0428 2．0150
RSD／％ 4．81 3-81 2．04 3．87
2．8．3不同柱温对校正因子的影响：用同台高效液
相色谱仪，分别在20、25、30℃的柱温下，考察各成
万方数据
中草焉ChineseTraditionalandHerbalDrugs第39卷第9期2008年9月·1319·
表5不同柱温对校正因子的影响
Table5 Influenceofchangingincolumn
temperatureonRCF
色谱柱温度 ，(柚皮苷)，(橙皮苷)，(新橙皮苷)，(甘草酸铵)
分的校正因子，结果见表5。柱温对校正因子的影响
均不显著，校正因子值是相对稳定的数值。
2．9精密度试验：精密吸取供试品溶液20弘L，连
续进样6次，记录峰面积，计算各成分峰面积的
RSD，结果芍药苷0．82％、柚皮苷0．40％、橙皮苷
1．91％、新橙皮苷1．32％、甘草酸1．18％。
2．10稳定性试验：取同一供试品溶液，室温放置，
分别于O、4、8、12、24h进样20弘L，记录各成分的峰
面积，计算RSD值，结果芍药苷1．11％、柚皮苷
0．94％、橙皮苷1．15％、新橙皮苷1．21％、甘草酸
1．02％。结果表明各成分在24h内基本稳定。
2．11重现性试验：取四逆散约0．4g，共6份，精密
称定，按供试品溶液的制备方法处理，测定，计算各
成分的平均质量分数，结果芍药苷5．4362mg／g、
柚皮苷20．1018mg／g、橙皮苷0．5358mg／g、新橙
皮苷11．7432mg／g、甘草酸11．4648mg／g，RSD
分别为1．86％、0．99％、2．24％、1．13％、1．65％。
2．12加样回收率试验：取四逆散粉末(过4号筛)9
份，每份约0．2g，精密称定，分别加入相当于样品中
各成分质量80％、100o／／、120％的对照品，制备供试
品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果芍药苷、柚
皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、甘草酸的平均回收率分别
为99．7oA、100．2％、99．4％、98．9％、99．8％，RSD
分别为2．40％、2．62％、2．31％、2．81％、1．56％。
2．13四逆散中各成分的测定：分别精密吸取对照
品混合溶液、供试品溶液各20弘L注入高效液相色
谱仪，采用外标法计算各成分平均质量分数。再分别
精密吸取内标对照品溶液、供试品溶液各20pL注
入高效液相色谱仪，进样测定，计算芍药苷的质量分
数，采用校正因子法折算其他各成分的质量分数，结
果见表6。
3讨论
本实验通过以四逆散为载体，对“内标”多控法
衷6外标法与。内标”多控法测定的结果比较(痒一3)
Table6 Comparisonofdeterminationbyexternal
referencemethodwiththatby“internal
standard”multi—controI白一3)
中药复方质量评价模式的可行性和方法的耐用性进
行了探讨。结果表明“内标”多控法中药复方质量评
价模式推算的测定结果与用相应对照品实测所得结
果没有显著性差异，说明该中药复方质量评价模式
的合理可行。
有文献报道采用校正因子法测定同一类化合物
几种成分[2’3]，由于所测物质的性质相似，其所用的
校正因子法可靠性值得研究；还有文献报道用替代
对照品法测定复方中的某种成分的量[4]，因外加替
代物质，又引入了新的误差，对检测结果有一定的影
响。本实验采用“内标”多控法，结合校正因子，在同
一色谱条件下，以芍药苷为“内标性”成分，同时测定
四逆散中不同类别和性质的成分，回收率高，准确
度高。
甘草酸在250rim，柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷在
280nm左右有最大紫外吸收，芍药苷在232nlTl处
有最大紫外吸收，以芍药苷为内标时，为了准确测定
各成分的校正因子，选择了250nm及280nm作为
检测波长。
采用本法可不提供定量用柚皮苷、橙皮苷、新橙
皮苷、甘草酸铵对照品，只需鉴别和定位用的对照品
即可，采用经济实惠且易获得的芍药苷对照品进行
定量分析，就可以对四逆散中5种成分进行定量，为
中药复方全面质量控制提供了一种新方法、新思路。
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万方数据
HPLC-内标多控法测定四逆散中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷、
甘草酸和新橙皮苷
作者： 王跃生， 饶毅， 魏惠珍， 吴有根， 张洁， 方海红， 陈银芳， WANG Yue-sheng， RAO-
Yi， WEI Hui-zhen， WU You-gen， ZHANG Jie， FANG Hai-hong， CHEN Yin-fang
作者单位： 王跃生,饶毅,魏惠珍,WANG Yue-sheng,RAO-Yi,WEI Hui-zhen(中药固体制剂制造技术国家工
程研究中心,江西,南昌,330006)， 吴有根,张洁,方海红,陈银芳,WU You-gen,ZHANG
Jie,FANG Hai-hong,CHEN Yin-fang(江西中医学院,江西,南昌,330006)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2008,39(9)
被引用次数： 12次
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