全 文 ：·924· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
影响了种子和壳中有效成分的合成和转运，种子和
壳中连翘酯苷、连翘苷和芦丁的量急剧下降；而叶仍
能正常生长，叶中有效成分变化较小。
3．2连翘分青翘和老翘(黄翘)，青翘和老翘因采收
时间和加工方法不同而成。秋季果实初熟尚带绿色
时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘”；果实熟
透时采收，晒干，除去杂质，习称“老翘”。连翘产区
“采青”时间过长，采收期混乱，造成连翘品质差异较
大，质量不稳定，严重影响了连翘及以连翘为原料的
制剂的进一步开发和利用。本实验研究表明，8月下
旬至9月上旬，果实的干物质趋于稳定，种子和壳中
连翘酯苷的量接近，且种子和壳中连翘酯苷、连翘苷
和芦丁的量较稳定，波动小，此时采收青翘质量较稳
定，有利于青翘的质量控制，且不会影响连翘的总产
量。壳中连翘酯苷、连翘苷、芦丁的量经9～10月质
量分数快速下降后，10月20日左右有效成分的量
趋于稳定并达最低，果实黄化并开裂，种子脱落，此
时采收老翘品质较好，且有助于老翘的质量控制。
3．3青翘为连翘的整个果实，包含种子和壳，老翘
为种子脱落后的果壳，研究表明，青翘中连翘酯苷的
量约是老翘的20倍，连翘苷的量是老翘的4倍，芦
丁的量是老翘的3倍；且青翘中连翘酯苷、连翘苷和
芦丁的相对质量分数连翘酯苷>连翘苷>芦丁，而
老翘中连翘酯苷>芦丁>连翘苷，青翘和老翘有效
成分问的比例差异较大。药材中不同有效成分之间
的量及其比例是药材药效好坏的决定因子，因此青
翘和老翘应该进行区别使用，传统中医一般以老翘
人药。文献报道，就抗菌效价而言青翘优于老翘，关
于青翘与老翘的药效差异，有待于进一步研究。
3．4叶中有效成分的种类与种子和壳相似；叶中连
翘酯苷的量低于种子和壳，连翘苷和芦丁的量高于
种子和壳，且在整个生长过程中，变化较小。叶是否
可替代果实入药，有待进一步研究。
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黄芩愈伤组织培养及黄芩苷合成调控的研究
王梦亮1，任振兴2，黄登宁2，刘滇生1
(1．山西大学现代化学研究所，山西太原030006}2．山西大学生命科学与技术学院，山西太原030006)
摘 要：目的 研究黄芩愈伤组织培养和黄芩苷台成调控的规律。方法 采用植物细胞培养技术诱导愈伤组织；
HPLC法测定黄芩苷的量。结果黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的优势培养条件为：在基本培养基MS中氨源
浓度为60mmol／L(NH‘+；N03为1：1)，KH2P04浓度0．5～1．5mmol／L，附加80g／L蔗糖．0．3mg／LIAA，2
mg／L6BA和200mg／L蛋白胨，温度：(25士1)℃．暗培养。培养40d后收获愈伤组织．生物量达28．7g／L，黄芩
苷为167．4mg／g，明显高于野生黄芩的最高量。结论黄芩愈伤组织的生长和黄芩苷的积累并不同步，而是先生长
后台成。蔗糖对黄芩苷的合成具有明显的调节作用，在蔗糖质量浓度小于3％时，能有效促进愈伤组织的生长，但对
黄芩苷的合成没有刺激作用；当蔗糖质量浓度在3％--8％时，愈伤组织表现出明显的生长和次生代谢功能，黄芩愈
伤组织的生长及黄芩苷合成明显增加；当蔗糖质量浓度在8％时．两者均达到最大值。
关键词：黄芩；黄芩苷；愈伤组织培养}HPLC
中图分类号：R282．6 文献标识码；A 文章编号：0253—2670(2006)06092405
RegulationofcalluscultureandbaicalinsynthesisinScutellariab ic lensis
WANGMeng—lian91，RENZhen—xin92，HUANGDeng—yu2，LIUDianshen91
(1．InstituteofModernChemistry+ShanxiUnivers ty，Taiyuan030006，China；2．InstituteofLifeScience
andTechnology，ShanxiUnivers ty，Taiyuan030006，China)
Abstract：ObjectiveTostudythruleofcalluscultureandbaicalinsynthesisinScutellariab ic len一
鉴量品智：笛蔷吾譬姿项目。。。，。。。。，
作者筒介。圭蕹亨u鬻I盘暑；毙黑焉产金：盘罾盎盖翌慧羔麓耋要掣所长’硕士生导师，从事中草药的研究开发、生物化工等的科研
万方数据
中草黄ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月·925·
sis．MethodsCalluswasinducedbyplantcellculturetechnologyandthecontentofbaicalinwasdeter—
mindbyHPLC．ResultsTheoptimalcu turemediumonthegrowthofcallusandthesynthesisofhaicalin
inS．baicalensisis：MSculturemedium，60mol／L(NH4+：N03一=1；i)，0．5—1．5mmol／LKH2P04，
80g／Lsucrose，0．3mg／LIAA，2mg／L6-BA，and200mg／Lpeptone．Whenit SSculturedfor40d，
thetotalbiomassreached28．7g／LandthecontentofbMcalinwas167．4mg／g·whichwasmuchhigher
thanthatofwildS．baicalensis．ConclusionThegrowthofS．baicalensiscalluandtheaccumulationof
baiealinareotunderwaysimultaneously；thecallusgrowsfirstandthenits econdarymetabolicproducts
synthesize．Itisobviousfor ucrosetOregulatethebaicalinsy thesis．Whentheconcentrationofsucrose
islessthan3％，itcouldonlypromotethecallusgrowth；whenbetween3％and8％，itcouldgreatlyin
creasenotonlythecallusgrowthbutalsothebaicalinsy thesis，when8％，bothofthemarrivetothe
maximumcontent．
Keywords：Scutellariabaic lensisGeorgi；baicalin；callusculture；HPLC
黄芩为唇形科植物黄苓Scutellariab icalensis
Georgi的干燥根，性寒味苦、具有清热燥湿、泻火锵
毒的功效03，含数种黄酮苷，黄芩苷(baicalin)是其
主要有效成分。目前国内外对黄芩苷研究主要以抗
氧化‘“、抗HIV“43和消除自由基”为热点，带动了
受体、酶和活性成分的分离鉴定，以及生物技术在活
性成分的组织培养等方面的开发应用，因此受到人
们的普遍关注““J。
当前国内外对黄芩组织培养的研究主要集中在
快繁技术和利用毛状根培养系统提高次生代谢产物
的产量，如高山林等-93利用黄芩组织培养克隆化快
速繁殖技术，为保护黄芩的野生资源，发展人工资源
和探讨育种新途径奠定了基础。Nishikawa等“”将
发根农杆菌ATCC15834含有的Ri一质粒中的T
DNA片段整合到黄芩愈伤组织上，诱导出毛状根，
进行黄芩的毛状根培养，从而提高黄芩的次生代谢
产物的产量。本实验的目的就是通过植物细胞培养
的方法，对黄芩愈伤组织生长及其主要次级代谢产
物黄芩苷合成规律进行研究。
1材料与方法
1．1仪器：高教液相色谱仪(Waters，2487紫外检
测器，Breeze色谱工作站)，SPX250--GB光照培
养箱(上海医疗器械厂)，JY98—3超声波细胞粉碎
机(宁波新芝科器研究所)。
1．2试剂与药品：甲醇为色谱纯，中国医药(集团)
上海化学试剂公司，水(重蒸馏水)，黄芩苷对照品
(中国药品生物制品检定所)，其余试剂均为AR级。
黄芩种子由山西省陵川县农业综合开发局提
供，经山西大学药学系秦雪梅教授鉴定。
1．3黄芩愈伤组织的诱导培养
1．3．1黄芩试管苗的获得：取黄芩种子用自来水漂
洗干净后放人75％乙醇中消毒lmin，转入2％次氯
酸钠溶液中消毒10min，然后用无菌水冲洗5次，
接种在用MS培养基(附加0．2mg／L6-BA)上无菌
萌发，大约在两周后获得无菌苗。
1．3．2黄芩愈伤组织的诱导：取黄芩试管苗0．5
cm左右的茎接种于诱导培养基：MS+2．0mg／L6一
BA+0．20mg／I．IAA培养基中，其中含蔗糖3％，
pH5．8，(25±1)C暗培养。大约在培养两周后，在
茎与培养基接壤处出现灰白色的愈伤组织。6周后
将诱导出的愈伤组织进行继代培养，其培养条件同
诱导培养基。连续继代2～3次后，即可得到脱分化
完全的愈伤组织。
1．4黄芩愈伤组织在不同培养基上的增长量与黄
芩苷的测定
1．4．1黄芩愈伤组织生长增量：黄芩愈伤组织的生
长周期为40d左右，故在生长40d后收获愈伤组
织，称量愈伤组织记为生长鲜质量，再在60℃烘箱中
烘至恒重，记为愈伤组织的总生物量。再减去接种量
(每100mL培养基接种】g)就是愈伤组织增长量。
1．4．2黄芩愈伤组织中黄芩苷的测定“1：色谱条
件：ODS色谱柱(150mmx4．6mm，大连依利特科
学仪器有限公司)，流动相：水一甲醇一磷酸为47：
53：0．2)，检测波长：280nm，柱温：室温，进样量20
pL，体积流量：1mL／min．
黄芩愈伤组织提取液的制备：称取0．3g黄芩
愈伤组织干粉，加50％乙醇80mL超声破碎20
min，定容至100mL，精密移取上清液1mL于10
mL量瓶中，用甲醇定容，微孔滤膜滤过后进样。
对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品适量，
用甲醇配成0．12mg／mL溶液，作为对照品溶液。
标准曲线制备：取0．12mg／mI。对照品溶液，按
万方数据
·926· 中草菊ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
一定的比例用甲醇稀释成120、60、48、38．4、30．7、
18．4、11．0、2．6,ug／mL的溶液，各取20pL 注入色
谱仪，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，相应的峰
面积为纵坐标得回归方程：Y一78776X一47513，
r一0．9994，线性范围为2．6～120,ug／mL。
测定：按外标法以峰面积计算供试品溶液中黄
芩苷的量。
2结果
2．1不同碳源对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累
的影响：考察了蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和甘露醇4种
碳源对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的影响。结
果见表l。可以看出，无论对于黄芩愈伤组织生长还
是黄芩苷的量，蔗糖都是一种最佳的碳源。
表1不同碳源对黄芩愈伤组织生长和黄苓苷■的
影响(碳谅质量浓度3％)
TableEffectsofdifferentcarbonsourcesoncallus
growthandbalcalln(concentration
ofcarbonsourcewas3％)
2．2不同蔗糖质量浓度对黄芩愈伤组织生长和黄
芩苷积累的影响：在含2％～10％蔗糖、6-BA2．0
mg／L、IAA0．2mg／L的MS培养基中接人愈伤组
织，培养40d后，测定愈伤组织生长增量和黄芩苷
的量，结果见图1。可以看出，随着培养基中蔗糖质
量浓度的增加，愈伤组织生长量明显增加，但高到一
定质量浓度(100g／L)后，黄芩愈伤组织生长和黄芩
苷的积累都受到抑制。另外还发现，愈伤组织团的含
水量明显地随着蔗糖的升高而减小(从96．5％减少
到84．4％)，这可能是培养基中渗透压增高所致。就
黄芩苷的合成情况而言，在2％蔗糖培养基中并不
合成黄芩苷，在3％蔗糖中开始合成，而8％蔗糖合
成黄芩苷的量几乎是3％蔗糖的5倍。增加蔗糖的
质量浓度有利于黄芩苷的合成，且在一定范围内不
影响愈伤组织生长。
此外，为了进一步探索黄芩苷生成的规律，对蔗
糖为3％的黄芩愈伤组织分别在培养10、15、20、25、
30、35、40、50d进行了黄芩苷测定，结果见图2。可
以看出，黄芩苷是从培养20d后开始合成，25～35
d为快速合成期，即黄芩愈伤组织的生长和黄芩苷
的积累并不同步，而是先生长后合成。
o
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粗
如
0
1一愈伤组织生长增量2一黄芩苷的量(下同)
ledlu8growthyield2-baicalinco．tent(samebelow)
图1 不同质量浓度蔗糖对愈伤组织生长和
黄芩苷量的影响
FI寥．1 Effectsofvariousconcentrationsofsucroses
oncallusgrowthandbaiealinco tent
L
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繇
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周2黄芩苷台成规律的试验结果
Fig．2Synthesisregulationofbaicalin
2．3有机添加物对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积
累的影响：一般认为，加入一些有机添加物对愈伤组
织的早期生长有利。为了考察有机添加物对黄芩愈
伤组织生长和黄芩苷量的影响，添加了牛肉膏、蛋白
胨和酵母粉3种有机物，添加量为200mg／L，其结
果见表2。可以看出，牛肉膏和蛋白胨均能促进黄芩
愈伤组织的生长，但对黄芩苷的积累没有太大的影
响，而酵母粉对愈伤组织生长和黄芩苷的积累都有
抑制作用，可能是因为其中含有某些抑制成分所致。
表2有机添加物对黄芩血伤组织生长和黄芩苷■的影响
Table2 Effectsofvariousrganicadditions
oncallusgrowthandbaicalin
万方数据
中草蒋ChineseTradiUonala dHerbalDrugs第37卷第6期2006年6,el
2．4生长调节物质对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷
积累的影响：见表3。可以看出，单独加入NAA，2，
4一D，IAA，6-BA和KT时，黄芩愈伤组织的生物量
以IAA最大，单独加KT和2，4一D，几乎不生长，而
黄芩苷的量则以NAA最高。不同的生长调节物质
组合加入时，IAA和6-BA组合最好，生物量和黄芩
苷的量都最高，NAA和6-BA的组合次之，而2，4一
D和6-BA组合，其愈伤组织严重褐化。
当固定IAA的质量浓度为0．2mg／L时，生物
量随6-BA质量浓度的增大而明显增加，当6BA高
于3mg／L时，其生长趋势又明显减弱。黄芩苷的量
则在6-BA为2rag／1。时，比6-BA为3mg／L时大
将近40％，达到最大值(30．2rag／g)(图3)。
表3几种生长调节物质对黄苓愈伤组织生长和
黄芩苷产量的影响
Table3 Effectsofvariousgrowth—regulators
oncallusgrowthandbaicalin
节物质 (g-L1) (g·L一1)(mg·g一1)
6BA 148 2．12 6 50
NAA 68 3．30 11．6
2，4-D 褐化0 0
IAA 103 4 63 5 91
KT 不生&0 0
6BA+IAA256 8 73 30．2
6-BA+NAA215 7．35 220
6-BA+2，4D 严重褐化0 0
生长调节物质单独加时的质量浓度为0．2mg／L，组合
加时，6-BA为2mg／L，其余均为0．2mg／1．
Growthregulatorwaseparatelyaddedby0．2mg／L，
whencombined，6BAwas2mg／Landotherswere0．2
mg／L
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6 RA的质量浓度／(gL“)
圈3不同质量浓度的6-BA愈伤组织生长和黄芩苷
量的影响
Fig．3Effectsofvariousconcentrationsof6-BA
oncallusgrowthandbaicalin
当固定6-BA的质量浓度为2mg／I。时，生物量
在不加IAA时很低，随IAA的质量浓度的增大而
明显增加，IAA在0．3～0．5mg／L时达到最大值，
当大于1．0mg／L时，愈伤组织生长又受到明显抑
制。黄芩苷的量在为0．3mg／L时达到最大值(35．7
mg／g)，随着IAA质量浓度的增加出现减小的趋势
(图4)。
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一
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锢
图4不同质量浓度的IAA对斑伤组织生长和黄芩苷
■的影响
Fig．4EffectsofvariousconcentrationsofIAA
oncallusgrowthandbaicalin
2．5 氮源对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的影
响：植物愈伤组织培养通常采用一定量的硝酸盐和
铵盐作为混合无机氮源，单独以铵盐或者硝酸盐为
氮源，都对愈伤组织的生长和次级代谢物的生成不
利，黄芩愈伤组织生长对NH。+和NO。的需求是有
差别的，氮源对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的
影响结果见表4(总氮浓度为50mmol／L)。结果表
明：NH；+：NO。为1：l时，生物量和黄芩苷的量
均达到最高。
表4 NH。+和NO，一浓度比例对愈伤组织生长和黄芩苷
积累的影响
Table4 Effectsofvariousnitrogensourceconcentrations
OUcallusgrowthandbaicalinaccumulation
另外，NH。+：NO。为1：1时，培养基中总氮
浓度变化的影响结果表明，总氮为60mmol／L时，
愈伤组织生长较好(11．32g／t，)，黄芩苷的量最高
(37．64rag／g)；总氮达120mmol／L时，愈伤组织生
万方数据
-928· 中单嚆cMne辩TraditionalandHerbalDrugs第37卷第6期2006年6月
长受抑，黄芩苷的量也显著减低(5．76mg／g)。因
此，适宜的氮源浓度为60mmol／L(其中NH。+：
NO。为1：1)
2．6磷酸盐对黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的
影响：见图5。可以看出，当KH。PO。在小于0．5
mmol／L时，生物量随着KH。PO。浓度的增加而明
显增大，在0．5～2．5mmo|／L时增加幅度不大。黄
芩苷的量在1．5mmol／I，时达到最大值(26．73mg／
g)。因此，KH。PO。的浓度不宜过高，以0．5～1．5
mmoi／L较为适宜。
宇
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KH2Pq的浓度／(ramolL1)
图5不同浓度的KHzPO一对墩伤组织生长和黄芩苷
■的影响
Fig．5EffectsofvariousconcentrationsofKH2P04
oncallusgrowthandbnicalin
3讨论
黄芩愈伤组织的生长和黄芩苷的积累并不同
步，而是先生长后合成。蔗糖对黄芩苷的合成具有明
显的调节作用，在小于3％时，能有效促进愈伤组织
的生长，但对黄芩苷的合成没有刺激作用，当蔗糖在
3％～8％时愈伤组织表现出明显的生长和次生代谢
功能，黄芩愈伤组织的生长及黄芩苷合成明显增加，
到8％时二者均达到最大值。黄芩是一种两年生的
中药，其黄芩苷的大量合成在次年进行，这可能与体
内光积累和蔗糖浓度有关，实验结果与天然状态下
黄芩苷的积累情况相似。另外，黄芩愈伤组织生长和
黄芩苷积累还受多种因子的调控作用，本研究结果
表明，黄芩愈伤组织生长和黄芩苷积累的优势培养
条件：在基本培养基MS中氮源浓度为60mmol／L
(NH。+：NOa为1：1)，KH2PO。浓度0．5～1．5
mmol／L时，附加80g／L蔗糖，0．3mg／LIAA、2
mg／L6-BA和200mg／L蛋白胨(25士1)℃，暗培
养。愈伤组织培养40d，生物量达28．7g／1，，黄芩苷
量167．4mg／g，明显高于野生黄芩的量。
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铁皮石斛根尖诱导丛生芽研究
詹忠根
(浙江经贸职业技术学院。浙江杭州310018)
摘要：目的探索铁皮石斛根尖再生丛生芽的适宜条件及类原球茎的起源。方法切取0．3～0．5cm的根尖为
外植体，以B5为基本培养基，附加不同种类和质量浓度的植物生长调节剂进行培养。结果诱导根尖形成了愈伤
组织、类原球茎或直接转化成芽且获得再生植株。通过细胞学观察认为铁皮石斛的类原球茎是单细胞起源的体细
胞胚。结论为铁皮石斛组织快繁建立新的体系。
关键词：铁皮石斛；禽伤组织；类原球茎；体细胞胚发生
箨薯晶羿：誓訾杂％l品1一)，男，浙江江山人，硕十研究生，主要从事组织培养研究
Tel：(0571)85919482Email：zhz99321@tonitom．
万方数据
黄芩愈伤组织培养及黄芩苷合成调控的研究
作者： 王梦亮， 任振兴， 黄登宇， 刘滇生， WANG Meng-liang， REN Zhen-xing， HUANG
Deng-yu， LIU Dian-sheng
作者单位： 王梦亮,刘滇生,WANG Meng-liang,LIU Dian-sheng(山西大学现代化学研究所,山西,太原
,030006)， 任振兴,黄登宇,REN Zhen-xing,HUANG Deng-yu(山西大学生命科学与技术学院
,山西,太原,030006)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2006,37(6)
被引用次数： 5次
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论文]-天然产物研究与开发2007,19(2)
3. 吴晓玲.胡海英.王俊.杨明 黄芩愈伤组织诱导条件的优化[期刊论文]-宁夏农林科技2005(1)
4. 孙磊.张启翔 薄层细胞培养在观赏植物再生和遗传转化上的应用[期刊论文]-安徽农业科学2007,35(22)
5. 王火焰.王运华.周建民 细胞培养技术在植物营养研究领域中的应用[期刊论文]-植物营养与肥料学报2001,7(3)
6. 王蕊.张东向.张磊.WANG Rui.ZHANG Dong-xiang.ZHANG Lei 黄芩的组织培养及遗传转化研究[期刊论文]-高师
理科学刊2007,27(6)
7. 张荣涛 长春花愈伤组织细胞突变的研究[学位论文]2004
8. 盛长忠.王淑芳.王宁宁.王勇 红豆杉愈伤组织培养中褐变现象的初探[期刊论文]-南开大学学报(自然科学版)
2001,34(4)
引证文献(5条)
1.任振兴.耿韶华.王梦亮.刘滇生 黄芩愈伤组织中多酚氧化酶活性与黄芩苷合成的关系研究[期刊论文]-中草药
2009(11)
2.刘娟.徐蓓蕾.张跃华 黄芩愈伤组织与丛芽诱导[期刊论文]-佳木斯大学学报(自然科学版) 2008(6)
3.任振兴.王梦亮.刘滇生 黄芩生长与黄芩苷积累规律研究[期刊论文]-山西大学学报（自然科学版） 2009(3)
4.孟庆华.张拴.赵莉平 两种金属离子对黄芩愈伤组织培养及其次生代谢物积累的影响[期刊论文]-陕西中医学院学
报 2007(5)
5.李银.王凤林.李书慧.吴立军 黄瑞香愈伤组织培养及其二次代谢产物的研究[期刊论文]-北京中医药大学学报
2008(3)
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