全 文 ：HPLC法测定血瘀证患者口服川芎丹参煎剂后阿魏酸血药浓度
孙世仁1 ,黄　熙1, 2* ,任　平 1 ,张　莉 1
( 1. 第四军医大学西京医院 中药临床药理研究室 ,陕西 西安　 710032;　 2. 北京大学 中医药现代研究中心 ,北京　 100083)
摘　要: 目的　对以往建立的人血清中阿魏酸浓度测定的 HPLC法加以改进 ,并测定了血瘀证患者口服川芎丹参
煎剂后阿魏酸的血药浓度。方法　以香豆素为内标 ,甲醇 -水 -醋酸 ( 40∶ 59. 7∶ 0. 3)为流动相 , Diamonsil( TM )色谱
柱 ( 150 mm× 4. 6 mm, 5μm ) ,流速 1. 0 m L /min,以二极管阵列检测器测定 322 nm波长下的数据 ,以沸水浴法加甲
醇处理血清样品。 结果　阿魏酸和内标分离完全 ,阿魏酸在 32. 18～ 965. 38 ng /mL范围内线性关系良好 ( r=
0. 998 1) ,日内和日间 RSD < 10% ,平均回收率为 ( 99. 3± 5. 4)% ,最低检测限为 1. 6 ng /m L,最低检测浓度为 15. 7
ng /mL。 结论　此法简单、快速、灵敏而准确 ,适用于人血清中阿魏酸血药浓度的测定。
关键词: 川芎丹参煎剂 ;阿魏酸 ;高效液相色谱法 ;血药浓度
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 03 0223 03
Quantitative analysis of ferulic acid in serum after oral administraiton of
decoction of both Ligusticum chuanxiong and Salviave miltiorrhizae root
in patients with blood stasis by HPLC
SUN Shi-ren
1 , HU ANG Xi
1, 2 , REN Ping
1 , ZHANG Li
1
( 1. Depar tment of TCM Clinica l Pha rmaco log y , Xijing Hospital of Four th Milita ry Medica l Univ ersity, X i an, Shanxi
710032, China; 2. Modern Resea rch Cent re fo r TCM , Beijing Univ ersity, Beijing 100083, China )
Abstract: Object　 To improve the HPLC method fo r determination o f ferulic acid ( FA) and to quanti-
tate serum FA concentra tion in pa tients w ith blood stasis a fter oral administ ration o f decoction of Ligus-
t icum chuanx iong Hort. and Salv iave mil tiorrhizae Bunge root. Methods　 The serum sample w as t reated
w ith a boi ling wa ter bath. The coumarin was used as internal standa rd compound. The mixed so lv ent con-
sisted of methanol , wa ter and acetic acid ( 40∶ 59. 7∶ 0. 3) w as used as elut riant. The f low rate wa s 1. 0
m L /min. The Diamonsi l TM column ( 150 mm× 4. 6 mm , 5μm) was used. FA w as detected at UV -322
nm and the peak of FA in serum was recognized by photodiode-array detector. Results　 FA and internal
standa rd compound were separated completely under the condi tion described as above. FA show ed a good
linea ri ty in the range o f 32. 18～ 965. 38 ng /mL ( r= 0. 998 1) . The RSD was less then 10% , and the mini-
mum detection amount w as 1. 6 ng /mL and the minimum detection concentrations in serum was 15. 7 ng /
m L. Conclusion　 Improved HPLC method is simple, sensitiv e, rapid and accurate. It can be applied to
detect FA concentration in human serum.
Key words: decoction of Ligusticum chuanx iong Hort. and Salviave m iltiorrhizae Bunge roo t; ferulic
acid; HPLC; blood drug concentration
　　“证治药动学”假说 [1 ]认为 ,复方进入体内其成
分可以定性定量 ,国内外实验 [ 2～ 7]对此提供了佐证。
但测定中药复方在人体内的化学成分以尿液测定为
多 [2～ 5 ] ,血药浓度测定较少。为进一步从临床论证这
一假说的普遍性 ,我们在对本室建立的血样预处理
方法—— 水浴法 [8 ]的基础上 ,以 HPLC法测定血瘀
证患者一次口服川芎丹参煎剂后体内阿魏酸的血药
浓度。
1　材料与试药
1. 1　仪器:美国 Waters高效液相色谱系统 , 7725
手动进样器 , 600泵 , 996二级管阵列检测器 , M32
数据处理系统。
1. 2　药品与试剂: 阿魏酸对照品 (中国药品生物制
品检定所 ,批号: 773-9405) ,香豆精对照品 (中国药
品生物制品检定所 ,批号: 880615) ;试剂均为分析
纯 ,水为自制双蒸水 ;川芎购自四川都江堰市医药公
·223·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 3期
收稿日期: 2001-08-06基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( No. 30070912) ;高等学校骨干教师计划资助 ;北京大学 985课题资助作者简介:孙世仁 ( 1971-)男 ,甘肃静宁人 ,第四军医大学中西医结合临床硕士生 ,研究方向为中药复方药动学。
* 联系人　第四军医大学西京医院中医科　 E-mai l: tcmwsh@ fmmu. edu. cn
司 ,经西北大学植物解剖学研究室胡正海教授鉴定
为伞形科植物川芎 Ligust icum chuanx iong Hort.
的根茎 ;丹参购自西安市医药公司 ;健康人空白混合
血清由本院血库提供。
1. 3　受试对象:血瘀证患者 (来自陕西省合阳县 ) 10
名 ,均符合 1986年广州第二届全国活血化瘀研究学
术会议修订的血瘀证诊断标准 ,其中 8男 2女 ,年龄
42～ 69岁 ,体重 50～ 78 kg ,患者试验前 2周停服任
何其他药物 ,服药前 14 h未饮含酒精饮料 ,未吸烟 ,
受试期间少量饮水。试验方案经西京医院医学伦理
委员会批准通过 ,试验前均签署知情同意书。
2　方法
2. 1　色谱条件: 流动相: 甲醇-水-冰醋酸 ( 40∶
59. 7∶ 0. 3) ;北京迪马公司 Diamonsil ( TM )色谱柱
( 150 mm× 4. 6 mm, 5μm) , C18保护柱 (大连依利特
科学仪器有限公司 ) ;流速: 1. 0 mL /min,检测波长:
322 nm。
2. 2　对照品溶液配制: 精密称取阿魏酸对照品
5. 02 mg ,置于 50 mL容量瓶中 ,加入甲醇至刻度 ,
配成母液浓度为 100. 4μg /mL,再用甲醇稀释 20倍
后终浓度为 5. 02μg /mL。同法配制内标香豆精溶
液 ,浓度为 23. 92μg /mL。
2. 3　川芎丹参汤的制备:采用煎煮法 ,取川芎、丹参
各 1 000 g ,常水洗 2遍 ,用 12 L浸泡 30 min,用不
锈钢刀将川芎切成 0. 5 cm× 0. 5 cm× 0. 5 cm ,放回
不锈钢锅中同丹参一起煮沸 30 min, 5层纱布过滤 ,
药渣用沸水覆过药面 ,再煮 30 min,最后在文火上
浓缩成 2 g /mL(含川芎和丹参各为 1 g /mL)。
2. 4　样品制备: 受试者空腹 14 h后 ,按 2 g /kg剂
量服用川芎丹参汤 ,分别于服药前和服药后 5, 10,
15, 30, 60, 90, 120, 180 min从肘静脉取血 3 mL,离
心血清 ,冰冻至- 20℃冰箱保存待测。
2. 5　血样预处理: 用微量加样器吸取 1. 0 mL血
清 ,置于 5 mL带刻度的玻璃尖底离心试管中 ,以微
量进样器准确加入香豆精内标液 50μL,电动混匀
器充分混匀 15 s,在水沸腾时将试管放入水浴锅 ,至
温度达 95℃以上时保持 10 min,取出冷却 ,用微型
电动搅拌器充分搅拌 , 3 500 r /min离心 15 min,取
上清液 100μL,置于 1 mL塑料离心管 ,加等量甲醇
后置- 4℃冰箱沉淀 24 h,取出以 9 000 r /min离心
10 min,取上清液 50μL进样。
2. 6　标准曲线制备: 取空白血清 1. 0 mL于 5 mL
带刻度的玻璃离心试管中并编号 ,加入不同浓度的
阿魏酸对照品及相同体积的香豆精内标溶液 ( 50
μL) ,并用甲醇补充总体积一致为 1 248μL,使阿魏
酸浓 度 分别 为 32. 18, 64. 36, 128. 72, 257. 44,
482. 82, 965. 38 ng /mL,充分混匀后 ,按 2. 5项下
“血样预处理”方法进行 ,并测定。以二级管阵列检测
器测定 ,选取 322 nm时阿魏酸和内标的峰面积 ,以
阿魏酸和内标的峰面积比与其浓度作线性回归 ,得
到此色谱条件下阿魏酸的标准曲线。 以信噪比为 3
时计算最低检测限和最低检测浓度。
2. 7　样品血药浓度测定:取已制备的血清样品室温
下融化后按“预处理”方法处理后测定 ,由标准曲线
计算出阿魏酸的血药浓度。
3　结果
1-阿魏酸　 2-香豆精
A-空白血清 B-空白血清+ 对照品 C-口服川芎丹参煎剂后的血清
图 1　阿魏酸和香豆精 HPLC图
3. 1　色谱分离:在上述色谱条件下 ,血样中的阿魏
酸和内标分离完全 ,空白血清无干扰 ,其保留时间均
与对照品一致 ,分别为 8. 8 min和 12. 3 min (见图
1) ,并通过二维、三维色谱图对其吸收峰定性。
3. 2　标准曲线及线性范围:阿魏酸的线性回归方程
为 Y= 0. 039 30+ 0. 006 363X , r= 0. 998 1,表明阿
魏酸在 32. 18～ 965. 38 ng /mL范围内具有良好的
线性关系。 同时检测阿魏酸的最低检测限为 1. 6
ng ,血清中阿魏酸的最低检测浓度为 15. 7 ng /mL。
3. 3　精密度和回收率:以空白血清中加入高、中、低
不同浓度的阿魏酸对照品作为已知样品 ,按上述方
法处理血清样品 ,选择一天内不同时间以及不同天
内检测 ,得其测定值 ,计算其日内、日间精密度及回
收率 ,见表 1。结果可见 ,精密度及回收率基本符合
表 1　精密度和回收率试验
阿魏酸浓度
( ng /mL)
精密度 (% )
日内 RSD 日间 RSD
回收率 (% )
数值 RSD
32. 18 5. 3 9. 2 107. 3 8. 3
257. 44 4. 8 5. 7 96. 2 8. 1
965. 39 6. 5 5. 1 95. 7 9. 0
·224· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 3期
要求 ,RSD < 10% ,表明本法可靠 ,结果令人满意。
3. 4　样品测定:按样品制备方法和预处理方法分别
测定各时点的血药浓度 ,其药时曲线见图 2。
图 2　血瘀证患者口服川芎丹参
　　煎剂后阿魏酸药-时曲线
4　讨论
4. 1　血样中药物的提取方法一般使用液-液萃取、
固相提取 ,或加入有机溶剂去除蛋白等方法 ,我室建
立了沸水浴去血清蛋白质后用 HPLC直接测定血
样中药物浓度方法 ,效果较好 [8 ] ,但也存在去除蛋白
不彻底从而减短分析柱使用寿命的不足 [ 9]。为此 ,我
们对原水浴法进行了改进 ,将离心所得上清液再加
甲醇放置沉淀 ,较原法相比 ,去除蛋白更充分 ,在不
影响检测结果的基础上有助于延长分析柱的使用
寿命。
4. 2　从阿魏酸的血药浓度-时间曲线可看出:血瘀
证患者一次口服川芎丹参煎剂后阿魏酸在胃肠道吸
收迅速 ,达峰时间短 ,这为中药汤剂吸收快 ,能迅速
发挥疗效提供了直接的临床量化依据。该曲线还显
示 , 180 min阿魏酸平均血药浓度高于 120 min,提
示川芎复方中的阿魏酸在体内存在重吸收现象 ,且
该现象在口服阿魏酸钠单体时并未出现 [ 10] ,这可能
预示着机体存在尚不为人知的多成分方剂的特殊处
置机制 ,探明这一机制对阐明方剂作用原理有着重
要的意义。
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乌龙减肥茶的质量标准研究
王　勇 ,吴春敏
(福建省药品检验所 ,福建 福州　 350001)
摘　要: 目的　制定乌龙减肥茶质量标准。 方法　对荷叶、茶叶进行了薄层色谱鉴别 ,用 HPLC法测定制剂中咖啡
因含量。 结果　平均回收率为 99. 3% , RSD= 0. 3% (n= 5) ,标准曲线的 r= 0. 999 9,精密度试验得 RSD= 0. 12%
(n= 9) ,重现性试验 R SD= 1. 01% ( n= 5)。 结论　方法稳定可靠 ,可作为该产品的质量控制方法。
关键词: 乌龙减肥茶 ;荷叶 ;茶叶 ; TLC;咖啡因 ; HPLC
中图分类号: R286. 02　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 03 0225 03
·225·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2002年第 33卷第 3期
收稿日期: 2001-06-01