全 文 ：　　　　　表 2　L 9 (34)正交试验设计及结果
Table 2　D esign and result of L 9 (34) orthogonal test
试验号 A B C D
人参皂苷C2Kö(m g·mL - 1)
1 1 1 1 1 01405 5
2 1 2 2 2 01649 8
3 1 3 3 3 01864 3
4 2 1 2 3 01332 8
5 2 2 3 1 01619 0
6 2 3 1 2 01750 0
7 3 1 3 2 01376 3
8 3 2 1 3 01324 8
9 3 3 2 1 01654 8
k1 01639 9 01371 5 01493 4 01559 8
k2 01567 3 01531 2 01545 8 01592 0
k3 01451 9 01756 4 01619 9 01507 3
R 01188 0 01384 9 01126 5 01084 7
表 3　方差分析
Table 3　Var iance analysis
方差来源 方差平方和 自由度 均方 F 值 P 值
　A 01054 2 01027 4191
　B 01224 2 01112 20144 P < 0105
　C 01024 2 01012 2121
　D (误差) 01011 2 01005
　　F 0105 (2, 2) = 1910　F 0101 (2, 2) = 9910
适的酶制剂可以实现将含量较高的天然皂苷转化为
具有特殊活性的、价值更大的次级皂苷, 并使其含量
提高数百倍, 为新药 (原料)的开发奠定了基础。
312　工业酶制剂代替生物转化既可以减少许多繁
琐的制备工艺, 又可以消除多种副产物的生成, 便于
转化产物的分离与纯化, 这是由酶的专一性所决定
的。本实验利用工业酶制剂 Β2葡聚糖苷酶转化三七
叶皂苷可制备 01883 m gömL 的抗肿瘤活性产物人
参皂苷C2K, 为进一步研究其药理活性创造了条件。
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柱前衍生 HPLC 法测定鸦胆子油中的脂肪酸含量
丁　怡, 唐　星Ξ
(沈阳药科大学 药剂教研室, 辽宁 沈阳　110016)
摘　要: 目的　建立H PL C 法测定鸦胆子油中的脂肪酸的方法。方法　以 2, 4′2二溴苯乙酮为衍生化试剂, 182冠26
醚为相转移催化剂, 采用 K rom asil C8 (250 mm ×4 mm , 5 Λm )反相柱, 波长 254 nm , 以乙腈2水 (80∶20)为流动相等
度洗脱, 柱温室温, 体积流量为 113 mL öm in, 正十七烷酸为内标, 一次基线分离 5 种脂肪酸。结果　亚油酸的线性
·889· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
Ξ 收稿日期: 2003211222
基金项目: 辽宁省重大课题项目 (2002226005)
作者简介: 丁　怡 (1978—) , 女, 河北人, 沈阳药科大学 2001 级在读研究生, 主要从事静脉注射用微乳剂和缓控释制剂的研究。
T el: (024) 2384371123923　E2m ail: d ingyisue@ 21cn1com
范围为 01022～ 01330 Λg, 软脂酸的线性范围为 01014～ 01213 Λg, 油酸线性范围为 01028～ 01416 Λg, 硬脂酸的线
性范围为 01012～ 01177 Λg。平均回收率分别为 9912%、9712%、10118%、9718% , R SD 分别为 112%、115%、
014%、213%。结论　该方法重现性好, 定量准确, 可作为鸦胆子油中脂肪酸的定量方法。
关键词: 鸦胆子油; 脂肪酸; 柱前衍生化; 高效液相色谱
中图分类号: R 286102　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 09 0988 04
D eterm ina tion of fa tty ac ids in F ructus B ruceae o il by precolumn der iva tion HPLC
D IN G Y i, TAN G X ing
(D epartm ent of Pharm aceu tics, Shenyang Pharm aceu tical U niversity, Shenyang 110016, Ch ina)
Abstract: Object　A m ethod w as developed fo r the determ inat ion of fa t ty acid in F ructus B ruceae o il
by p reco lum n derivat ion H PL C1 M ethods　Fat ty acids w ere derivat ized w ith p 2b romophenacylb rom ide as
derivat ive and 182crow n26 as cata lyst1 T he m ethod u sed C 8 K rom asil C8 (250 mm ×4 mm , 5 Λm ) co lum n
and isocra t ic aceton it rile2w ater eluen t and the in ternal standard w as hep tadecano ic acid1 T he detect ion
w avelengh th w as 254 nm 1 Co lum n temperatu re w as fixed at room temperatu re, and the flow rate w as 113
mL öm in1 Results　T he standard cu rves of lino leic, pa lm it ic, o leic, and steraric acid are linear w ith in the
range of 01022—01330, 01014—01213, 01028—01416, and 01012—01177 Λg, respect ively1 T he fou r fa t ty
acid recoveries are 9912% , 9712% , 10118% , 9718% , and the R SD are 112% , 115% , 014% , 213% ,
individu slly1 Conclusion 　F ive fa t ty acids are separa ted w ith in 30 m inu tes du ring a single run1 T he
p resen t m ethod is reliab le and rela t ively simp le fo r the determ inat ion of fa t ty acid in F ruetus B ruceae o il1
Key words: F ructus B ruceae o il; fa t ty acid; p reco lum n derivat ion; H PL C
　　鸦胆子为苦木科植物鸦胆子的干燥种仁, 具有
清热、解毒、杀虫、截疟作用, 主治热毒血痢、冷痢、疟
疾、痔疮、痈肿、阴痒、鸡眼[1 ]。鸦胆子种仁中含有
712% 脂肪油, 其中三酰甘油中油酸的量达 5812% ,
亚油酸为 2012% , 软脂酸为 810% , 硬脂酸为
511% [2 ]。近年来国内外研究发现鸦胆子油中油酸具
有抗肿瘤活性, 而且药理实验证明其中的油酸、亚油
酸具有抗肿瘤活性[3 ]。国内已上市的鸦胆子油乳注
射液临床试验证实具有良好的抗癌疗效。植物油中
的脂肪酸的含量测定一般采用气相色谱法[4, 5 ] , 但在
分析过程中柱温很高 (180 ℃) , 易使油酸、亚油酸的
双键断裂或产生双键的异构化现象。H PL C 法对人
体中游离脂肪酸及植物油中脂肪酸的测定国外已有
不少报道[6～ 9 ] , 多采用 C18分析, 时间长 (60 m in) 或
需要梯度洗脱。本实验采用柱前衍生化、C8 反相柱
等度洗脱进行分析, 4 种脂肪酸和内标达到基线分
离, 分析时间短, 重现性好。
1　仪器与材料
日本日立—7100 型高相液相色谱仪, TC2100
柱温箱。
　　油酸、亚油酸、软脂酸、硬脂酸、十七烷酸 (内标)
对照品, 2, 4′2二溴苯乙酮和 182冠26 醚均购于
Sigm a 公司, 鸦胆子油为本实验室制备, 甲醇、乙腈
为色谱纯, 其他试剂均为分析纯。
2　方法与结果
211　色谱条件: 色谱柱: K rom asil C 18柱 (250 mm ×
4 mm , 5 Λm ) ; 检测波长: 254 nm ; 流动相: 乙腈2水
(80∶20) ; 柱温: 室温; 体积流量: 113 mL öm in。
212　溶液的配制
21211　对照品溶液的配制: 准确称取油酸、亚油酸、
软脂酸、硬脂酸、十七烷酸 (内标) 对照品过量, 分别
加甲醇制成 0193, 0177, 01332, 01276, 0125 m gömL
的溶液, - 20 ℃保存。
21212　衍生化试剂溶液的配制: 称取一定量的 2,
4′2二溴苯乙酮和 182冠26 醚, 分别加乙腈配制成
10, 2164 m gömL 溶液。4～ 8 ℃避光保存。
21213　空白溶液的制备: 加入 2, 4′2二溴苯乙酮 60ΛL , 182冠26 醚溶液 60 ΛL 和乙腈 500 ΛL , 顶部充氮
气, 旋紧螺塞 (用聚四氟乙烯隔片) , 超声混合, 即得。
213　脂肪酸对照品的衍生化处理: 分别取油酸、亚
油酸对照品溶液 20 ΛL , 软脂酸、硬脂酸、十七烷酸
对照品溶液 30 ΛL , 置于具塞螺口反应瓶中, 以酚酞
为指示剂, 用 0105 mo löL 氢氧化钠2甲醇溶液将混
合液中和至终点, 氮气吹干。加入 2, 4′2二溴苯乙酮
50 ΛL、182冠26 醚溶液 50 ΛL、乙腈 600 ΛL , 顶部充
氮气, 旋紧螺塞 (用聚四氟乙烯隔片) , 涡旋 2 m in;
80 ℃水浴 40 m in, 取出放冷, 离心, 取上清液 10 ΛL
注入高效液相色谱仪。
214　鸦胆子油的衍生化处理: 精密称取鸦胆子油
80 m g, 置 25 mL 量瓶中, 加丙酮溶解稀释至刻度,
·989·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
精密吸取 100 ΛL 置刻度试管, 加 300 ΛL 内标, 氮气
吹干。加 015 mo löL 氢氧化钾2甲醇溶液 014 mL , 60
℃恒温水浴皂化 30 m in, 待油珠完全溶解, 氮气吹
干[4, 5 ]。加水 1 mL 溶解, 滴加 6 mo löL 盐酸至酚酞
褪色, 用 6 mL 乙醚分 3 次萃取, 每次涡旋 2 m in。乙
醚全部转移至 10 mL 量瓶中, 加乙醚至刻度。精密
吸取上述乙醚液 015 mL 置 115 mL 反应瓶中, 按
213 项下衍生化处理。
215　标准曲线的绘制: 分别吸取对照品溶液油酸、
亚油酸各 1 mL , 软脂酸、硬脂酸各 115 mL 置 10 mL
量瓶中, 加乙腈稀释至刻度。分别吸取该溶液 10、
30、80、100、130、150 ΛL 置 6 个 115 mL 反应瓶中,
再分别加入 30 ΛL 内标溶液, 衍生化处理。以各脂肪
酸的峰面积与内标峰面积之比 Y 对相应的进样量
X 进行线性回归, 得回归方程。亚油酸: Y = 01123 5
X - 01045 5, r= 01999 6, 线性范围: 01022～ 01330Λg; 软脂酸: Y = 01088 7 X + 01000 9, r= 01999 7,
线性范围: 01014～ 01213 Λg; 油酸: Y = 01090 7 X -
01009 0, r= 01999 5, 线性范围: 01027～ 01416 Λg;
硬脂酸: Y = 01298 7 X - 01001 0, r= 01999 9, 线性
范围: 01011～ 01160 Λg。
216　专一性考察: 取鸦胆子油、脂肪酸对照品的衍
生化产物及空白溶液, 进样, 记录色谱图, 见图 1。可
见在空白中亚油酸、软脂酸、油酸、硬脂酸、十七烷酸
处均无干扰, 并且在鸦胆子油色谱中内标无干扰。
12亚油酸　22软脂酸　32油酸
42十七烷酸 (内标物)　52硬脂酸
12lino leic acid　22palm itic acid　32o leic acid
42hep tadecano ic acid ( in ternal standard)
52stearic acid
图 1　空白溶液 (A)、脂肪酸对照品衍生物 (B)和
鸦胆子油衍生化物 (C)的 GC 图谱
F ig1 1　GC chromatogram s of blank solution (A) ,
fa tty ac id der ivatives (B) , and F ructus
B ruceae o il der ivatives (C)
217　稳定性试验: 取衍生化处理的鸦胆子油的供试
品溶液于 8 h 内不同时间进样, 记录色谱图, 计算得
亚油酸、软脂酸、油酸、十七烷酸、硬脂酸峰面积的
R SD 值分别为 019%、115%、110%、018%、118%
(n= 4) , 表明供试品溶液在 8 h 内稳定。
218　精密度试验: 取鸦胆子油衍生化溶液, 连续进
样 5 次, 记录峰面积, 以内标对比法计算鸦胆子油中
亚油酸、软脂酸、油酸、硬脂酸的质量分数, 计算得
R SD 值分别为 119%、119%、114%、112%。
219　绝对回收率试验: 分别取油酸、亚油酸对照品
溶液 200 ΛL , 软脂酸、硬脂酸、十七烷酸对照品溶液
300 ΛL 置于刻度试管中, 衍生化处理, 进样 10 ΛL ,
记录峰面积A 1; 另取鸦胆子油衍生化溶液 10 ΛL , 记
录峰面积A 2, 求得绝对回收率A 2öA 1。油酸、亚油
酸、软脂酸、硬脂酸、十七烷酸的回收率分别为
10216%、9812%、9814%、9916%、10010% , R SD 分
别为 019%、113%、018%、117%、115%。
2110　方法回收率试验: 精密称取已知含量 7 份鸦
胆子油各 40 m g, 置 25 mL 量瓶中, 加丙酮溶解并稀
释至刻度。分别精密吸取 100 ΛL 置 7 个 10 mL 刻
度试管中, 分别精密加入 300 ΛL 十七烷酸对照品溶
液及 40 m g 鸦胆子油中相应量的油酸、亚油酸、软
脂酸、硬脂酸对照品溶液, N 2 吹干, 衍生化处理, 用
内标对照法计算油酸、亚油酸、软脂酸、硬脂酸的量。
结果回收率分别为 10014%、10212%、9914%、
10415% , R SD 分别为 110%、119%、017%、214%
(n= 7)。
2111　鸦胆子油的测定: 采用内标法对比法测定 3
批鸦胆子油样品中亚油酸、软脂酸、油酸、硬脂酸的
含量, 结果见表 1。
表 1　鸦胆子油中脂肪酸的测定结果 (n= 3)
Table 1　D eterm ination of fa tty ac ids in F ructus
B ruceae o il (n= 3)
批号 亚油酸ö% 软脂酸ö% 油酸ö% 硬脂酸ö%
20021023 1912 811 5713 514
20021024 1910 813 5715 512
20021025 1817 815 5718 515
3　讨论
311　在衍生化试剂与反应底物物质的量比为 6∶1
时 (衍生化试剂远远过量) , 考察反应时间 25、45、60
m in 的各种脂肪酸的峰面积变化。结果显示 25 m in
以后的峰面积没有变化, 说明 25 m in 即可反应完
全, 但是为保证反应完全, 实验操作时控制反应时间
为 30 m in。
312　脂肪酸是长链烃类, 在 200～ 400 nm 没有最
大吸收, 无法直接用紫外检测器进行检测, 所以采用
柱前衍生化的方法, 使脂肪酸带上一个强发色团, 在
·099· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
200～ 400 nm 有最大吸收。Α2溴苯酮和 2, 4′2二溴苯
乙酮为常用衍生化试剂, 将脂肪酸衍生化成苯乙酮
酯, 由于采用 182冠26 醚为相转移催化剂, 使酯化反
应活能降低, 衍生化反应速度快, 酯化率高。
313　国外报道的有关脂肪酸的含量测定的色谱条
件多为C18柱, 或采用梯度洗脱, 但是由于脂肪酸的
极性过小, 在 C18柱的保留时间很长, 分离时间长达
80 m in。本实验曾尝试过C 18柱, 结果油酸与软脂酸
无法达到基线分离。使用 C8 反相柱, 以乙腈2水
(80∶20) 为流动相等度洗脱, 油酸与软脂酸可以达
到基线分离, 而且分析时间在 35 m in 之内。
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银耳多糖中糖醛酸含量的测定
姜瑞芝1, 陈英红1, 杨勇杰2, 高其品3Ξ
(11 吉林省中医中药研究院, 吉林 长春　130021; 21 吉林大学生命科学院,
吉林 长春　130023; 31 吉林省药品检验所, 吉林 长春　130021)
摘　要: 目的　建立一种操作简单、快速、准确地测定银耳多糖中糖醛酸的方法。方法　考察中性糖在咔唑法和间
羟基联苯法中对糖醛酸测定的干扰, 考察加入氨基磺酸对中性糖的抑制作用。并对银耳多糖中糖醛酸进行测定。结
果　中性糖在咔唑法和间羟基联苯法中均有不同程度的干扰。对糖醛酸中酸性杂多糖配制质量浓度超出一定范围
时, 两种方法测得糖醛酸的结果会与实际值有较大误差。结论　测定银耳多糖采用间羟基联苯法, 同时待测样品质
量浓度配制在 0125～ 0150 m gömL 时, 所测结果更接近于实际值。
关键词: 银耳多糖; 糖醛酸; 咔唑法; 间羟基联苯法
中图分类号: R 286102　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 0253 2670 (2004) 09 0991 03
D eterm ina tion of uron ic ac ids in polysacchar ide from T rem ella f ucif orm is
J IAN G R u i2zh i1, CH EN Y ing2hong1, YAN G Yong2jie2, GAO Q i2p in3
(11 A cadem y of T radit ional Ch ineseM edicine and M ateria M edica of J ilin P rovince, Changchun 130021, Ch ina; 21 Co llege of
L ife Science, J ilin U niversity, Changchun 130023, Ch ina; 31 J ilin Inst itu te fo r D rug Contro l, Changchun 130021, Ch ina)
Key words: T rem ella po lysaccharide (T P ) ; u ron ic acids; carbazo le m ethod; m eta2hydroxydiphenyl
m ethod
　　天然药物提取的多糖以酸性杂多糖的形式存在
较多, 通常对其中糖醛酸的测定方法有咔唑法[1 ]和
间羟基联苯法[2 ]。但在实际工作中发现, 采用以上两
种经典方法测定酸性杂多糖中糖醛酸的含量时, 中
性糖对测定结果有很大的干扰, 使得酸性杂多糖的
组份分析结果无法解释。文献报道[3 ] , 氨基磺酸可抑
制中性糖的干扰。为建立一种准确、快速测定酸性杂
多糖中糖醛酸的方法, 本实验选用了糖醛酸含量低
·199·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 9 期 2004 年 9 月
Ξ 收稿日期: 2003212210
基金项目: 国家重点科技项目 (962901206268)
作者简介: 姜瑞芝 (1959—) , 女, 长春人, 研究员, 主要从事多糖研究及新药开发。T el: (0431) 6816839
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