全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第11期2005年11月· 637·
与产地的不同，其有效成分也有较大的差异，
3．4 同名异物(种)的指纹图谱研究主要考察市场
品种的有效性，资源的可替代性，以及为药材的真伪
鉴别、化学分类学做些铺垫。对槲蕨科槲蕨属的槲
蕨、中华槲蕨、石莲姜槲蕨、川滇槲蕨、栎叶槲蕨、团
叶槲蕨、崖姜蕨属崖姜、骨碎补科骨碎补属的大叶骨
碎补8个药材骨碎补来源品种的测定显示8个种的
成分有相同性；从成分种类及含量也存在较大差异，
槲蕨中成分全面，活性成分含量，从分子水平证明
《中国药典》收载的品种是正确的。 ．
3．5相似度计算结果表明，4组相似度的参数均在
0，9以上，说明建立的指纹图谱相似度较好”j。
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柱前衍生化RP—HPLC法分析龟板中氨基酸
李惠芬，骆迭，张庆伟，朱丽丽，李蓥
(天津医科大学药学院中药分析国家重点实验室，天津300070)
摘要：目的采用柱前衍生RPHPLC法对龟板中13种氨基酸进行分析。方法用6mol／LHCI水解提取龟板
中总氨基酸，以异硫氰酸苯酯(PITC)为柱前衍生化试剂，采用外标法，梯度洗脱的方式分析。结果13种氨基酸在
40min内均可得到很好的分离，回收率(除甘氨酸外)为91．68蹦～106．26％，RsD为0．718“～4．386％。结论所
建立的方法分离效果好、灵敏、准确、简便，且采用普通的C，s色谱柱，可广泛用于台有多种氨基酸样品的分析。
关键词：龟板}氨基酸；异硫氰酸苯醅衍生；高效液相色谱
中田分类号：R286．02 文献标识码：B 文章编号t0253—2670(2005)11一i637—03
Determinationof minoacidinChinemysreevesiibypre—columnderivatizationRP—HPLC
1。IHui—fen，LUODa，ZHANGQing—wei，ZHULi—li，LIJun
(StateK yLaboratoryofChineseMateriaMedicaAn lysis，CollegeofPharmacy．TianiinMedicalUniversity,
Tianjin300070，China)
Abstract：0bjeetiveTodeterminethecontentof13aminoacidsinChinemysreevesiibypre-column
derivatizationRP—HPLC．MethodsToextractto alminoacidsbythemethodofhydrolysisin6mol／L
HClandusephenyli30thiocyanate(PITC)astheflerivatinggentwithexternalstandardmethodt analyze
thembygradientelution．ResoltsThirteenkindsDfaminoacidscanbeseparatedwellin40min。the
averagerecoverieswere91．68％一106．26％，andRSD0．718％一4．386％．ConclusionThemethodiS
sensitive，accurate，simple，andreliableforthdeterminationof mi oacidsinmanyothersampleseven
bycommonC1Bcolumn．
Keywords：Chinemysre ve ii(Gray)；aminocid；PITCderivatization；HPLC
’龟板是乌龟Chinemysreevesii(Gray)的干燥腹
甲，味甘成，性微寒，归肝、肾、心经，具有滋阴潜阳、
益肾强骨、养血、补心等功能。龟板中含有丰富的氨
基酸。以往分析氨基酸多采用氨基酸分析仪，价格昂
贵，用途单一。本法采用RP—HPLC梯度洗脱及
PITC、TAG柱前衍生技术‘“⋯，使用普通C。。分析
柱，采用外标法，对龟板中13种氨基酸成分进行了
分析，取得了满意的结果。
ll曩翼!茎l套潍(194技6术)笔曼薯裂罴裹罂星挈棼；jg棼譬，现为天津医科大学药学院仪器分析中心主任，国家中医药管理局中药分析作者简介：李惠芬 ，女，教授，研究方向为中药分析，现为天津医科大学药学院仪器分析中心主任，国家中医药管理局 药分析
重点实验室主任。TelT(022)23529243E—mail：lihuifen@tijmu．edu．en
万方数据
·1638· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第11期2005年11月
1仪器与材料
美国Waters515双泵型高效液相色谱仪，配有
2847双通道紫外检测器，Millennium”色谱管理系
统(美国Waters公司)；RE一52AA旋转蒸发仪(上
海亚荣生化仪器厂)；Brand移液器(25～250pL，
100～1000HL)；MS2漩涡混合仪；微量进样器
(HamiltonCo．)。13种氨基酸对照品(天津天安药
业股份有限公司，质量分数均大于99％)；异硫氰酸
苯酯(PITC)(Fluka)；龟板(天津中药饮片厂，经天
津中医学院第一附属医院尚英和药师鉴定)；乙腈、
正己烷为色谱纯(自制)，重蒸水，其他试剂均为分
析纯。
2方法与结果
2．1试剂的配制：取0．3mLPITC置于25mL棕
色瓶中，乙腈稀释并加至刻度，浓度为0．1mol／L，
摇匀，作为衍生化试剂口“]，需每日更换。三乙胺一乙
腈(139t 861)作为干燥试剂。
2．2溶液的制备
2．2．1混合氨基酸对照品溶液的制备：精密称定一
定量各种氨基酸对照品置于100mL量瓶中，用0．1
mol／LHCl稀释至刻度，作为对照品储备液，冷藏备
用，可使用3日。各氨基酸质量浓度见表1。
裹1 13种氨基酸的质量及各自质量浓度
Table1 Weightandeachconcentration
of13kindsofaminoacids
氧基酸
Nt／ 质量浓度／
氨基酸
质量／ 质量浓度／
n,g(mg-ml一一1)mg(rag·mL1)
门冬氨酸20．7 0．207 颉氨醴 1 8．6 0．i86
各氨酸 6t5 0．6】5 蛋氨酸 58．6 0 586
丝氨酸 35．2 0．325 异亮氨酸16．7 0 167
甘氨酸 170．7 1．707 亮氨酸 50．0 0．500
组氨酸 10．9 0109苯丙氨酸14．9 0149
精氨酸 55．3 0．553 赖氮酸 51．0 0．510
苏氨酸 i68 0．169
2．2．2混合氨基酸对照稀释液的制备：精密吸取1
mL对照品溶液，置10mL量瓶中，用0．1mol／L
HCl稀释至刻度，每日更换。
2．2．3龟板供试品溶液的制备：准确称取2g100
目龟板粉末，置150mL平底烧瓶中，加入20mL6
mol／I．HCl，于100℃水解6h，趁热滤过置50mL
量瓶中，残渣用重蒸水反复冲洗，加重蒸水至刻度，
作为供试品储备液，冷藏保存，可使用3日。
2．2．4龟板供试品稀释液的制备：准确吸取龟板供
试液lmL置50mL圆底烧瓶中，70℃减压蒸干。
加入1mL重蒸水，相同条件下减压蒸干，如此反复
3次。蒸干后样品用0．1mol／LHCl转移至10mL
量瓶，定容，摇匀。0．45pm滤膜滤过，作为供试品溶
液，每日更换。
2．3柱前衍生化步骤：精密移取200pI。对照品或
供试品的稀释溶液，分置于I．5ml。离心管中，依次
精密吸取100pL干燥试剂和200止衍生化试剂，
以600r／min蜗旋振荡5min，静置1h使其充分反
应。再于离心管中精密移人200pL正己烷，以600
r／rain蜗旋振荡5min，放置10min，吸取下层溶液
作为两者待测溶液。
2．4 色谱条件：色谱柱：PhenomenexC18(250
mm×4．6mm，5“m)；流动相A：0．1mol／L醋酸
钠溶液(pH6．5)一乙腈(94：6)，流动相B：乙腈一水
(80：20)；检测波长：254nm；柱温：40℃；体积流
量：1mI。／min。梯度洗脱，0～8min，0％B；8～
12．9min，4％B；12．9～13min，13％B；13～18
min，14％B；18～33min，16％B；33～36min，
36％B；36～39min，0％B。
2．5标准曲线的制作：精密吸取对照品液0．2、0．4、
0．6、0．8、1．0、1．2、1．4、1．6mL，分别置于10mL量
瓶中，用0．1mol／LHCl稀释至刻度，柱前衍生化后
进样5L，记录色谱图。以每种氨基酸质量浓度为
横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归分析。结果
13种氨基酸标准曲线均为线性曲线，相关系数在
0．9975～0．9996，在各自的线性范围内氨基酸峰
面积与其质量浓度呈良好线性关系。结果见表2。
裹2 13种氨基酸的线性方程
Table2 Linearequationot13kindsofaminoacids
氡基酸 回归方程 线性范N1／(mg·mL叫)r值
2．6精密度试验：精密吸取对照品稀释液200pL，
柱前衍生化后进样5止(”一6)。13种氨基酸峰面
积的RSD在0．09％～1．52％。
2．7重现性试验；平行制备5份供试品稀释液，柱
前衍生化后进样5止，测定计算。13种氨基酸峰面
积的RSD在0．03％～1．20％。
万方数据
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2．8稳定性试验：取供试品稀释液200pL，置于
1．5mL离心管内，柱前衍生化后分别于0、2、4、6、
8、24h进样5FL，13种氨基酸峰面积RSD在
0．07％～1．78％，表明龟板氨基酸供试品释稀液在
24h内稳定性良好。
2．9回收率试验：采用加样回收法。精密吸取已知
质量浓度的供试品稀释液100止5份，分别加入对
照品稀释液100pL，柱前衍生化后进样5pL，测定，
计算回收率。结果见表3。
2．10龟板样品中氨基酸的测定：吸取供试品稀释
液5止进样，每批取3份，按外标法测定并计算13
种氨基酸的质量分数，结果见表4。
表3氨基酸回收率恤一5)
Table3 Resultsofrecoverytest抽一5)
氨基醴 平均回收率／“RSD／“氨基酸 平均回收幸／％RSD／蹦
门冬氨酸 106．26 0．718 瓿氨酸 1oo．39 i．238
各氨酸 96．07 1 450蛋氨酸 96．75 2．530
丝氨艘 95．32 2 462 异亮氨酸 9981 3 832
甘氨酸 63．38 3．117亮氨酸 9451 2．935
组氨睦 10025 4．386苯丙氨酸 IOl99 4 207
精氮酸 9l68 1．868粕氨酸 100．81 2．352
苏氨酸 ioi．77 3．496
裹4龟板中13种氨基馥的测定结果“一3)
Table4 Determinationof13kindsofaminoacidsinC．reevesii抽一3)
3讨论
3．1龟板水解时间的选择：龟板水解时间以往报道
有6、24h等，本实验为确切了解水解时间，分别进
行了6、9、12h的水鹪时间03实验。结果表明这3种
条件下13种氨基酸的峰面积无明显的差异，故选用
6h，既达到了龟板中氨基酸全部水解的目的，又节
省了能源与时间。
3．2梯度洗脱程序的优化选择：最先选用的梯度洗
脱程序为0～11rain，0％B；11～13．9rain，6％
B；13．9～14rain，10％B；14～29rain，15oAB；
29～33rain，34％B；33～38min，0％B。发现峰形
不是很理想，特别是在14～18min出峰集中，且赖
氨酸峰与衍生化试剂和杂质峰有部分重合，无法进
行定量分析。经摸索梯度洗脱程序，最终确定本实验
所述程序。该条件下，龟板中13种氨基酸色谱峰达
基线分离，保留时间也适当。
3．3正己烷的作用：初期以为在衍生化过程中所加
的正已烷作用为萃取试剂，但实验中发现正己烷处
于上层，并不是原先认为的下层。推断正己烷并不起
萃取作用，而是除杂作用。另外正己烷的加入量与最
后进样的苯氨基酸代甲醇一氨基酸(PTC—AA)的浓
度无关，因此加入PTC—AA的量只与取样量、干燥
试剂的量和衍生化试剂的量有关，为后续定量分析
提供了依据。
3．4 甘氨酸回收率偏低原因分析：初步分析可能由
于龟板中甘氨酸较多，导致色谱柱或检测器超载，使
甘氨酸回收率较低。实验中改进时曾尝试进样10
“L，峰形明显混乱，改回5“L后，峰形回归正常，进
一步确证进样10止明显超载。由此可推断，色谱柱
超载可能是导致甘氨酸回收率偏低的主要原因。
3．5衍生化试剂加入量的选择：在1mL混合氨基
酸对照品稀释液加入i00、150、200、250止衍生化
试剂，结果表明13种氨基酸蜂面积随衍生化试剂的
加人量增加而略增，但200pI。与250pL无明显变
化，故选用200”L衍生化试剂。
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柱前衍生化RP-HPLC法分析龟板中氨基酸
作者： 李惠芬， 骆达， 张庆伟， 朱丽丽， 李鋆， LI Hui-fen， LUO Da， ZHANG Qing-wei，
ZHU Li-li， LI Jun
作者单位： 天津医科大学药学院,中药分析国家重点实验室,天津,300070
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(11)
被引用次数： 9次

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