全 文 ：中草药 h Ci ne s e Ta r di tio na la n d He r ba l D ru g s 2 0 0 0年第 3 1 卷第 1 2期 · 923 ·
鲤鱼精巢 DA N对 自由基的清除作用
广东药学院预防医学系 (广州 5 1 0 2 2) 4
中山医科大学药理学教研室
中山大学生命科学学院药学 系
周永红 ’
唐孝礼 颜光美
许 实波
摘 要 目的 :研究鲤鱼精巢 D NA 对 自由基 的清除作用 。 方法 :采用化学发光法测定鲤鱼精巢 A D N对 Cu Z +-
i V t C
一
H 20
:发光体系产生 的 · O H自由基 的清除作用 , 采用分光光度法检测鲤鱼精巢 D N A 对大鼠腹腔多形核白
细胞 (P M N S ) 呼吸爆发产生 O 矛 自由基的清除作用 ,采用 电子 自旋共振 (E S R )法测定鲤鱼精巢 D N A 对 D P P H 有机
自由基 的清除作用 。 结果 :鲤鱼精巢 D N A 使 C u , + 一 iV t C 一H ZO : 发光体系 的发光计数率降低 , 使 PM N S 呼吸爆发产
生 0 矛 自由基的数量减少 , 使 D P P H 的特征波峰逐渐降低直至消失 。 结论 :鲤鱼精巢 D N A 对 · O H 自由基 、 O 矛 自
由基 和有机 自由基均有显著 的消除作用 。
关键词 鲤鱼 精巢 脱氧核糖核酸 自由基
S c a v e n g i n g A c t i o n o f D N A f r o m C a r P S P e r m a r y o n F r e e R a d i c a l s
D e p a r t m
e n t o f p
r e v e n t iv e M e d i e i n e
,
G
u a n g d
o n g C
o l! e罗 o f P h a r m a e y ( G u a n g z h o u 5 1 0 2 2 4 ) Z h o u Y o n g h o n g
D e p a r t m e n t o f P h a r m a e o lo g y
,
S
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一s e n U n iv e r s i t y o f M
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D e p a r t m e n t o f P h a r m a e y
,
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,
S u n Y a t
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n iv e r s i t y X u Sh i b
o
A b s t r a c t T o in v e s t i g a t e w h e t h e r D N A f r o m e a r p s p e r m a r y s e a v e n g e s f r e e r a d i e a l s
.
C h e m i e a l l u m i
-
n o m e t r y
, s p e e t r o m e t r y a n d e l e e t r o n i e s p i n r e s o n a n e e ( E S R ) m e t h o d s w e r e u s e d t o m e a s u r e t h e s e a v e n g i n g
a e t i o n o f d e o x y r i b o n u e l e i e a e id ( D N A ) f r o m e a r p s p e r m a r y o n
·
O H r a d i e a l p r o d u e e d b y C u
Z + 一
V i t C
一
H
Z
O
:
e h e rn o l u m i n e s e e n t s y s t e m
,
O 子 r a d i e a l p r o d u e e d b y t h e b r e a t h i n g b u r s t o f p o l y m o r p h o n u e l e a r l e u k o e y t e s
( P M N s ) a n d D P P H r a d i e a l r e s p e e t i v e l y
.
D N A f r o m e a r p s p e r m a r y s e a v e n g e d
·
O H r a d i e a l p r o d u e e d b y
C u
Z+ 一
V i t C
一
H
Z
O
: e h e m o l u m i n e s e e n t s y s t e m
,
O于 r a d ie a l p r o d u e e d b y t h e b r e a t h i n g b u r s t o f P M N s a n d
D P P H r a d i e a l s
,
I t e o u ld b e e o n e l u d e d t h a t D N A f r o m e a r p s p e r m a r y s e a v e n g e s f r e e r a d i e a l s
.
K e y w o r d s e a r p s p e r m a r y d e o x y r i b o n u e le i e a e id f r e e r a d i e a l s
鲤鱼既是一种常见食用鱼 , 又是一种常用滋补
中药 ,性平 , 味甘 。归脾 、 肾经 。具有利水 、 消肿 、 下气 、
通乳之功效 。 常用于水肿胀满 、 脚气 、 黄疽 、 咳嗽 、 气
逆 、 乳汁不通 。 雄性鲤鱼在发情期 ,它的精巢约 占体
重的十分之一 , 精巢的主要成分是核蛋 白 , 由鱼精蛋
白和脱 氧核糖核酸 ( D N A )组成 。 鲤鱼精巢的药用价
值未见文献报道 ,为 了科学合理地利用鲤鱼精巢 ,我
们进行 了鲤鱼精巢 D N A 的分离提取及其药理作用
研究 , 发现鲤鱼精巢 D N A 的毒性极低 ,为实际无毒
级物质 ;小 鼠服用鲤鱼精巢 D N A 后 ,对动物体内 自
身 D N A 的损伤具有 明显 的保 护作 用川 ;鲤鱼精巢
D N A 对 果蝇 和小 鼠的生存 寿命有 显著 的延长 作
用川 。 本实验研究鲤鱼精巢 D N A 对 自由基 的清除
作用 。
1 实验材料
1
.
1 动物和样品 : S D 大鼠由广东省医学 实验动物
中心提供 。 鲤鱼精巢 D N A 由作者从鲤科鲤 伪沪ir -
n u 、 。 a
rP lo iL
n n ae u s 的精 巢 中提 取 得 到 , 纯度 为
9 6
.
52 %
,实验时用蒸馏水配成所需浓度的受试液 。
1
.
2 主要试剂和仪器 : V it E 购 自广州星群药业股
份有限公司 ;糖原 , S e r v a 公司 ; 台盼蓝 , S i g m a 公司 ;
二苯代 苦 味酞基 自由基 ( l , l 一 d i p h e n y l一 2一 p i e r y lh y -
d a z y l
,
D H H P )旧 本关东化学株式会社 ; 酵母多糖 ,
iS g m a 公 司 ; 其余均 为市售分析纯试剂 。 7 5 5 0 分光
光度计 , 惠普上海分析仪器有限公 司 ; T G L 一 5 型离
心机 , 上海安亭科学仪器厂 ; G L 20 C 高速冷冻离心
机 , 中国科学院武汉科学仪器厂 ; 生物超弱发光仪 ,
中国科学院生物物理研究所 ; J鹤一 F IE X G 电子 自旋
共振波谱仪 , 日本 岛津制作所 。
1
,
3 对 · O H 自由基的清除作用 : 采用化学发光法
测定鲤鱼精巢 D N A 对 C u Z + 一Vi t C 一H ZO Z 发光体系
产 生 的 · O H 自由基 的 清除 作 用叫 。 反 应 在 50
A d d
r e s s :
周永红 女
Z h o u Y o n g h o n g
,
D e p a r t m e n t o f P r e v e n t iv e M e d i e i n e
,
G u a n g d o n g C o l l e g e o f P h a
r
m a e y
,
G u a n g二
, 广东药学院预防医学系实验师 ,参加 国家 自然科 学基金 、 广东省自然科学基金等多项科研课题 ,
z h o u
已 发表论文 10 余篇 。
·
9 2 4
· 中草药 C hi ne s e Ta r di tio na la n d He r ba l Du rg s 2 0 0 0年第 3 1 卷第 1 2期
m mo l/ I
J磷酸盐缓冲液 ( p H7 . 4 )中进行 , 以 酵母 扩
增化学 发光强 度 , 反 应体 系 总体积 Z m L , 其 中含
V i t C 9 0 拼m m o l / L 、 C u SO 4 3 6 0 m m o l / L 、 酵母 5 0
m g /m L
,
H
2
0
2
15 m m ol L/ 及一定浓度 受试药或 等
体积溶媒 。 H ZO : 最后加人 ,立 即于生物超弱发光仪
上测定 30 m in 内反应体系发光强度 的变化 。 测定时
室温 2 3 . 6 C , 管温一 n . g C 。 结果统计 : 记录各管
第 3 0 分钟时的发光计数率 ,作组间 t 检验 。
1
.
4 对 O 牙 自由基 的清除作用 : 采用分光光度法检
测 鲤 鱼 精 巢 D N A 对 大 鼠 腹 腔 多 形 核 白 细 胞
(P M N
S )呼吸爆发产生 。 于 自由基的清除作用川 。 取
体重 2 50 ~ 30 0 9 的健康 s D 大 鼠 ,雄性 , i p l %糖原
生理 盐 水 20 m L , 4 h 后 吸取 大 鼠腹 腔 液 , 以 10
m m o l / I
了
P B S ( p H 7
.
4
,含肝素 Z o U /m L )洗涤 2 次 ,
每次 以 8 0 0 X g 离心 5 m i n ,用 P B S 将沉淀配成 10 7
C F U /m L 的 P M N s 悬 浮 液 。 以 台盼 蓝 染 色 检 查
P M N S 成 活率 > 9 5% , 采用 10 m m o l / L P B S , p H
7
.
4
, 反 应 体 系 总体 积 1 m L , 内含 PM N s 5 x 1 0 6
C F U
, 经胺 2 m m ol / L 及一定浓度 的受试 药 , 37 C
水浴 5 m i n 。 加调理化酵母 多糖 0 . 1 m L , 3 7 C水浴
3 0 m i n
,冰水浴终止反应 , 8 0 0 只 g 离心 5 m i n 。 取上
清 液 0 . 5 m L , 加 1 0 m m o l / I J P B S 、 1 7 . 2 6 m m o l / I J
对氨基苯磺酸 、 7 m m ol / L 茶胺各 。 . s m I J , 摇匀 , 室
温静置 20 m in , 以试剂空 白管调零 , 测波长 53 0 n m
处的吸光度值 ( A 5 30 n初 , 0 子 自由基的量 由亚硝 酸钠
标准曲线计算求得 。
1
.
5 对有机 自由基的清除作用 : D P P H 是一种稳定
的有机 自由基 ,常用于天然抗氧化剂的筛选 。 D P P H
用无水酒精溶解 , 反应体系总体积为 1 m L , 其中含
30 拜m m ol / L D P P H 及一定浓度受试药 或等体积溶
媒 , 25 C 反应 30 m in 后 ,用测定管吸取 10 拌L 反应
液于 JE S 一 F E IX G 电子 自旋共振波谱仪测 D P P H 的
E S R 波谱巨6〕 。
2 结果
2
.
1 对 · O H 自由基 的清除作用 :结果 ( 图 l) 表明 ,
鲤鱼精巢 D N A 对 C u Z+ 一 V it C 一 H ZO Z 发光体系产生
的 · O H 自由基有显著的清除作用 。 D N A 1 . 2 , 0 . 3
m g /m L 对 · O H 自由基 的清 除 率分 别 为 81 . 8%
( P < 0
.
0 0 1 )
,
7 2
.
7% ( P < 0
.
0 0 1 ) ; 0
.
2 5 m g /m L
iV t E对 C u Z + 一V it C 一 H ZO Z 发光体系产生的 · O H 自
由基的清除率为 26 . 4% ( P < 0 . 0 5 ) 。
2
.
2 对 O牙 自由基的清除作用 : 结果 (表 l) 表明 ,鲤
3 ` 0 7 2 0 10尽0 14 4 0 1 9 0 0
辞彭屯
3 6 0 7 2 0 10 . 0 1 4 4 0 1 9 0 0 0 3 ` 0 , 2 0 1 0吕 0 1 4 4 0 1公0 0
时间 t (’)
A
一空白对照 ; B 一鲤鱼精巢 D N A 1 . 2 m g /m L ; C一鲤鱼精巢 D N A 0 . 3 m g /m L ; D一 V i t E o · 2 5 m g / m L
图 1 鲤鱼精巢 D N A 对 C u Z+ 一 vi t C 一H 2 0 : 发光体 系产生的 · O H 自由基的清除作 用 (n ~ 3)
鱼精巢 D N A 对大 鼠 ( P M N S )呼吸爆发产生 O子 自 (尸 < 0 . 0 1 ) , 2 2 . 6 3 % ( p < 0 . 0 5 ) 。 5 0 拼g /m L V i t E
由基有显著的清除作用 。 2 5 0 , 2 5 , 2 . 5 拜g /m L D N A 的清除率为 4 3 . 7 5% ( P < 0 . 0 1 ) 。
的清 除 率 分 别 为 53 . 45 % ( P < 0 . 0 0 1 ) , 3 5 . 5 6% 2 . 3 对有机 自由基 的精除作用 : 结果 ( 图 2) 表明 ,
表 1 对 P M N s 呼吸爆发产生 0 牙 自由基的清除作 用 x( 士 , , n ~ 6)
组别 浓度
(拜g /m L
A 53
o n m
O 矛
( n m o l )
4 6
.
4士 7 . 3
2 1
.
6士 5 . 5 . ` .
2 9
.
9士 6 . 6二
35
.
9士 8 . 1 姗
2 6
.
1士 8 . 8 “
清除率
(肠 )
5
ǎ卜自八尸合连尸几内h丹」
.…勺Où卜9曰Q尸乃,门0ùJ件25025.0
空 白对照
鲤鱼精巢 D N A
V i t E
0
`
0 6 4士 0 . 0 1 2
0
.
0 3 1士 0 . 0 0 9 番 . `
0
.
0 4 2士 0 . 0 1 1 奋 .
0
.
0 5 0士 0 . 0 ] 3
0
.
0 3 7士 0 . 0 14 长 且
与空 白对照组 比较 : ’ 尸 < 。 . 05 “ 尸 < 。 . 01 ’ ` ’ 尸 < 0 . 0 01
鲤鱼精巢 D N A 对 D P P H 自由基 有显著 的清除作
用 , 随着 D N A 浓度的增大 , D P P H 的 E S R 特征波峰
逐渐变低 , 当 D N A 的浓 度 已达 到 2 50 拌g /m l , 时 ,
D P P H 的 E S R 特征波峰全部消失 ,表明此时 D P P H
自由 基 已 被 全 部 清除 ; 20 拜g /m I J iV t E 也 可 将
D P P H 自由基全部清除 。
3 讨论
自由基是带有不配对 电子的原子或分子 , 自由
基在体 内的过量积累 , 可以破坏细胞正常代谢功能 ,
引起类脂质的过氧化反应 , 促使 D N A 、 R N A 突变 ,
导致蛋 白质交联 ,从而引起许多与年龄相关的疾病 ,
如 白内障 、 动脉硬化 、 肿瘤 、 糖尿病 、 胃肠道慢性 炎
中草药 Ch in e s e Tr ad it in o a lan d H r eb a l Dr u g s2 0 0 0 年第 3 1卷第 2 1期 . 2 9 5 -
A
一空 白对照 ;B 一鲤鱼精巢 DN A2 . 5陀 /mL (尸 <0 . 0 1 ) ;
C
一鲤鱼梢巢 DN A2 5拜 g /mL ( P <0 . 0 0 1 ) ; D一鲤鱼精巢 N DA
2 50 “ g /mL ( P( o· 0 0 1 ) ; E一 i Vt E2 0 尸 g / mL ( P <0 . 0 0 1 )
圈 2 鲤鱼精集 N A D清除 P P DH 自由基
的 E SR 圈谱 ( n = 3 )
症 、 皮肤老化 、 软骨病变 、 神经功能失调等 的产生和
加速衰老进程 , 一 g〕 。
自由基的测定方法有分光光度法 、 高效液相色
谱 ( H P L C )法 、 化学发光法 、 电子 自旋共振 ( E S R )波
谱法等 。 我们采用化学发光 法检测鲤鱼精巢 D N A
对 C u Z气 V it C 一 H ZO Z 发光体系产生 的 · O H 自由基
的清除作用 , 分光光度法检测鲤鱼精巢 D N A 大鼠
( P M N S ) 呼吸爆发产生 的 O子 自由基 的清除作用 ,
采用 E S R 波谱法检测鲤鱼 精巢 D N A 对 D P P H 有
机 自由基的清除作用 ,结 果表明鲤鱼精巢 D N A 对
这 3 种 自由基均有显著的清除作用 。 因此 ,鲤鱼精巢
D N A 对机体 内 自由基的清除作用是其抗 衰老作用
的重要机制之一 。
参 考 文 献
l 唐孝礼 , 许实波 ,周 永红 . 中山大学学报 ( 自然科 学版 ) , 1 9 98 , 37
(增刊 ) : 7 4 ; 3 7 ( 4 ) : 1 2 5
2 唐孝礼 , 周永红 ,颜光美 ,等 . 中国老年学杂志 , 1 9 9 , 1 9 (2 ) : 10 1
3 陈 勤 主编 . 抗衰老研究实验方 法 . 北 京 : 中 国医药科技出版
社 , 1 9 9 6 : 5 0 1
4 辛洪波 , 张宝恒 . 药学学报 , 1 9 9 3 , 2 8 ( 3 ) : 1 6 1
5 许士凯主编 . 抗衰老药物学 . 北京 : 中国医药科技 出版社 , 1 9 9 4 :
2 0 1
6 D e a n R T
,
F u S
,
S t o e k e r R
, e t a l
.
Bi o e h e m J
,
1 9 9 7
,
3 2 4 ( P t l )
:
1
7 K im K B
,
L e e B M
.
C a n e e r L e t t
, 1 9 9 7 , 1 1 3 ( l
一 2 )
:
2 0 5
8 S t o h s S J
.
J B
a s i e C li n P h y
s
i o l P h a r m a e o l
,
1 9 9 5
, 6 ( 3
一 4 )
:
2 0 5
9 K n ig h t J A
.
A n n C l i n l a b s e i
,
1 9 9 7
,
2 7 ( 1 )
:
1 1
( 2 0 0 0
一
0 2
一
2 0 收稿 )
梦醒安神片的药理研究
吉林省中医中药研究院中药研究所药理室 (长春 13 0 0 2 1) 金春花 ’ 王英军 姜 秀莲
摘 要 采用小鼠激怒打斗 、 “ 失望 ”行为及平衡运动 , 去水吗啡攀爬行动 、 大鼠定型活 动 、 苯丙胺引起小 鼠 自发活
动增强及小鼠脑中多巴胺含量的变化等实验 , 观察梦醒安神片的 主要药效学作用 , 实验结果表明梦醒安神片明显
减少小 鼠激怒打斗次数 , 使小鼠“ 失望 ” 不动时 间延长 , 显著抑制动物的攀爬行动 , 使动物定型活动次数减少 , 明显
减少苯丙胺引起的亢进小鼠的自主活动次数 , 明显减少小鼠脑中多 巴胺的含量 。 表明梦醒安神片有明显安定作用 ,
对多巴胺系统亢进功能有明显抑制作用 。
关健词 梦醒安神片 安定作用 多巴胺系统亢进功能
梦醒安神片为一中药复方 , 由黄连 、 胆南星 、 丹
参等组成 。 根据中医理论 ,用清火豁痰 , 理气安神法
治疗狂病 ,西医诊断为反应性精神病 、 精神分裂症等
躁动型 。在临床试用 ,颇受患者欢迎 , 为验证其药效 ,
我们进行 了梦醒安神片的主要药效学研究 。
1 实验材料
1
.
1 药物 : 梦醒安神片药粉由吉林市中药厂提供 ,
批号 9 4 0 6 0 6 , .3 6 9 生药 1/ g 粉 , 每克含盐酸小聚碱
不低于 20 m g ,临用时取 8 , 4 , 2 9 药粉均溶至 20 m L
蒸 馏 水 中 , 配 成 40 % 、 20 % 、 10 % 的浓 度 , 以 0 . 2
m L l/ 0 9 的剂量给小 鼠 19 。 檬石滚痰丸由天津达仁
堂制药厂提供 ,批号 : 91 0 8 03 。 苯丙胺由国家麻醉品
实验室生产 , 去水吗啡 由沈阳第一制药厂生产 。
1
.
2 动物 : 健 康昆明种小 鼠 , 体重 18 一 2 9 , 健康
W i
s t a r 大鼠 ,体重 1 8 0一 2 0 0 9 ,雌雄各半 , 由吉林省
中医中药研究 院动物室提供 。
2 实验方法与结果
2
.
1 梦醒安神片对小 鼠激怒打斗 、 “ 失望 ” 行为及平
A d d r e s
s :
J i
n C h u n h u a
,
In
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u t e o f C h i n e s e M
a t e r l a M e d i e a
,
J i l i
n A e a d e m y o f T C M
,
C h a n g e h u n