全 文 ：300 中国肿瘤 2002年第 11卷第 5期
徐 萌 ,罗荣城 ,李金瀚 (第一军医大学附属南方医院 ,广东 广州 510515)
摘 要:[ 目的] 研究凋亡分子Caspase参与非小细胞肺癌耐药产生的机制及其与凋亡发生的关系。[ 方法] 采用 RT_PCR检测肺癌敏感细胞株GLC_82和阿霉素耐药株GLC_82/ADR中多药耐药相关蛋白(MRP)基因表达 , 0.3μg/ml阿霉素处理细胞后 ,细胞
Caspase_3和 Caspase_8活性改变及凋亡变化。[ 结果] GLC_82/ADR耐药细胞株表达 MRP基因 ,而 GLC_82敏感细胞株不表达 , GLC_82细胞株第 24h组与对照组比较 , Caspase_3和Caspase_8活性明显上升 5.88倍和 12.63倍, 而在 GLC_82/ADR细胞 , 第 24h组与对照组比较 , Caspase_3和Caspase_8活性水平分别只上升 1.54倍和 2.73倍 ,GLC_82/ADR细胞凋亡率明显低于GLC_82细胞。[结论] 非小细胞肺癌耐药形成与 MRP基因表达参与、Caspase_3和 Caspase_8活性水平降低造成细胞抗凋亡有关。关键词:半胱天冬酶;肺肿瘤;多药耐药;蛋白;凋亡
中图分类号:R734.2 文献标识码:B 文章编号:1004-0242(2002)05-0300-03
多药耐药(multidrug resistance , MDR)产生是提高非小细
胞肺癌(NSCLC)化疗疗效主要障碍 , MDR形成机理复杂 , 其
本质是肿瘤细胞自身一系列生物学改变 , 干扰了药物作用的
多个环节 , 使药物不能在细胞内累积达到一定的杀伤作用浓
度 。近年来研究表明 ,MDR形成与肿瘤细胞抵抗化疗药物诱
导凋亡有关 ,表现为广泛的凋亡抗性 [1 ] 。Caspase家族是直接
导致细胞解体的蛋白酶系统 , 在凋亡调控机制中处于核心地
位 , 其中最重要的是 Caspase_3和 Caspase_8 [2 ] 。本研究通过检
测 NSCLC细胞株中耐药基因MRP的表达 , Caspase活性水平
变化和细胞凋亡改变 , 探讨 Caspase与肺癌耐药的关系 , 进一
步阐明肺癌耐药发生的参与机制 。
1 材料与方法
1.1 细胞株与细胞培养
人 NSCLC敏感株 GLC_82和阿霉素耐药株 GLC_82/ADR
细胞在体外用含 10%小牛血清的 RPMI_1640完全培养液 , 置
37℃、 5%CO 2饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养 , 传代后接
种于 35ml培养瓶中 , 每瓶细胞数 5×10 5/ml , 待细胞处于对
数生长期时 ,加入不同处理因素后进行检测 。GLC_82/ADR细
胞株阿霉素抗药指数为 5.43。
1.2 RT_PCR检测 NSCLC细胞株MRP基因表达
标本总 RNA 制备采用 Tripure 提取试剂盒 。RNA 合成
cDNA:5×缓冲液 、 10nmol/L dNTPs 、RNasin 、 1mM OligdT和
RNA样品 , M_MLV逆转录酶 200u , 总体积 20μl , 置 PCR仪中
37℃60min进行逆转录反应 , 70℃15min灭活逆转录酶;PCR
扩增反应:10×缓冲液 10nmol/L、10nmol/L dNTPs 、5pmol/μl
引物 、Taq酶 、DEPC水和 cDNA , 总体积 50μl , 置 PCR仪进行
PCR扩增 , 扩增程序如下:94℃变性 60sec , 58℃退火 45sec ,
72℃延伸 45sec ,扩增 30个循环后 , 72℃延伸 10min;电泳结果
分析:2.0%琼脂糖凝胶电泳 、EB染色及照相 。MRP基因 5′引
物 : GGACCTGGACTTCGTTCTCA , 3′引 物 : CGTCCA-
GACTTCTTCATCCG , 内参照 β2M基因 5′引物:ACCCCCACT-
GAAAAAGATGA , 3′引物:ATCTTCAAACCTCCATGATG 。
1.3 Caspase_3和 Caspase_8活性检测
GLC_82 和 GLC_82/ADR 细胞株分别加入终浓度为
0.3μg/ml阿霉素继续培养 24h , 并于第 6h 、12h 、18h和 24h取
细胞进行检测 。采用 Clontech试剂盒 ,待测 2×10 6细胞加入
裂解液 , 冰育 10 min , 12000rpm离心 3 min后取上清 , 加入
2×含 DTT反应液后 , 再加入底物 1mM DEVD_pNA或 1mM
IETD_pNA 底物 37℃孵育 1h , 在 405 nm酶标仪检测 Cas-
pase_3和 Caspase_8光密度(OD)值 。
1.4 碘化丙啶(PI)荧光染色及检测
收集不同因素处理的 10 6个细胞 , 离心后 PBS液洗涤 ,
加入冰冷的 70%乙醇固定 , PBS液洗涤 , 加入 PI荧光染液
(50μg/ml PI , 10μg/ml RNA酶)4°C避光孵育 30min ,流式细胞
基金项目:广东省医学科研基金资助(A1998346)
收稿日期:2001-12-11
A Study of Drug Resistance Attributed to Caspase in
Non_Small Cell Lung Cancer
XU Meng , LUO Rong_cheng , LI Jin_han
半胱天冬酶参与非小细胞肺癌耐药机制的研究
301中国肿瘤 2002年第 11卷第 5期
仪分析 DNA荧光强度 ,在流式细胞仪测定细
胞的荧光强度 , 资料经计算机多正态拟合分
析 , 得出细胞群体在细胞周期各个时相的分
布比例 , 细胞凋亡时直方图出现亚二倍体
峰 。
2 结 果
2.1 NSCLC耐药和敏感细胞株MRP基因表达差异
以 RT_PCR对标本进行MRP及 β 2M基因扩增后 , 从图 1
看出 PCR扩增产物经电泳分离后分别出现两条阳性条带 ,长
度分别为 292bp和 114bp , 与所设计的 MRP基因和内参照
β 2M基因扩增片段大小相符;其中泳道 1可见 MRP基因与
β 2M基因同时扩增表达 , 泳道 2只有 β 2M基因扩增表达 , 而
未见MRP基因扩增条带 , 说明上述条带为特异性扩增产物 ,
MRP基因只在 GLC_82/ADR耐药细胞株中表达 ,而 GLC_82敏
感细胞株不表达。
2.2 Caspase_3和 Caspase_8活性水平在 NSCLC中的变化
由表 1可见 , 0.3μg/ml阿霉素处理 GLC_82细胞株后 ,
Caspase_3和 Caspase_8活性水平均呈上升趋势 , 第 6h组与对
照组比较 , Caspase_8活性水平有显著性差异(P<0.05), 第
12h 、18h和 24h组与对照组比较 , Caspase_3和 Caspase_8活性
水平有显著性差异 (P<0.01), 第 24h组与对照组比较 ,
Caspase_3和 Caspase_8活性分别上升 5.88倍和 12.63倍;而
在 GLC_82/ADR细胞 , 第 24h组与对照组比较 , Caspase_3和
Caspase_8活性水平分别只上升 1.54倍和 2.73倍 。
2.3 阿霉素诱导 NSCLC细胞凋亡改变
由表 2可见 , GLC_82细胞在阿霉素诱导后 , 随时间推移
凋亡率明显升高 , 第 24h组与对照组比较 , 凋亡率明显增加
12.63倍 ,GLC_82/ADR细胞凋亡率明显低于 GLC_82细胞 ,第
24h组与对照组比较 ,凋亡率只增加 3.61倍 。
3 讨 论
化疗在 NSCLC综合治疗中的作用日益受到重视 , 然而
NSCLC患者对化疗的反应各异 , 优化的经验性联合化疗总有
效率大多徘徊在 40%左右 。MDR的产生是导致肿瘤产生耐
药和化疗失败的主要原因 。在肿瘤多药耐药细胞株中 , 已检
测出由MDR1基因编码的跨膜转运蛋白 P_糖蛋白 。据推测 ,
自然底物(某些抗癌药物)通过 P_糖蛋白的跨膜区所形成的
疏水通道 ,由能量依赖的药物流出泵排出细胞外 。但是 ,在肺
癌尽管耐药发生率很高 , P_糖蛋白表达却较低 , 提示有其他
的耐药机制参与 。Cole等 [3 ]从有MDR表型但无 P_糖蛋白过
度表达的人小细胞肺癌耐药细胞系 H69AR中 , 分离出一段
过度表达的 mRNA ,认为它与MDR发生相关并可能导致临床
耐药 ,将其命名为MRP基因 。MRP高表达能增加抵抗化疗药
物细胞毒的能力 。Ota等 [4 ] 用 Northern杂交法检测MRP和
MDR1在 104例 NSCLC患者的表达 , 有 33例表达MRP(占
31.7%), 33例中 19例(占 57.6%)为高表达 , 只有 9例患者
(占 8.7%)表达MDR1 , 在 NSCLC中MRP表达与组织病理和
预后相关 。本实验亦发现MRP基因只在 GLC_82/ADR耐药细
胞株中表达 ,而 GLC_82敏感细胞株不表达 。MRP分子在非小
细胞肺癌的MDR中扮演重要角色[ 5] 。
Caspase 是一类具有在天门冬氨酸后进行酶切特性的半
胱氨酸蛋白酶家族 ,未活化的 Caspase是以酶原形式存在 ,酶
原的氨基端有一段原结构域的序列 , 活性酶就是要将原结构
域切除 。目前至少有 14个 Caspase 成员克隆成功 , 它们不但
氨基酸具有同源性 , 而且空间结构相似 , 在死亡受体介导和
化疗药物诱导的细胞凋亡中发挥重要作用 [6 ] 。Caspase_3是细
胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶 , 化疗药物损伤
线粒体膜使膜通透性增高和膜电位下降 ,线粒体功
能发生一系列系统损伤 ,细胞色素 C释放后与其它
凋亡促进因子共同激活 Caspase_3 , Caspase_3主要底
物是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (PARP), PARP与
DNA 修复和基因完整性监护有关 , PARP被 Cas-
pase_3切断后 , 使受 PARP负性调控的核酸内切酶
活性增高 , 裂解核小体的 DNA , 引起细胞凋亡 [ 7] 。
图 1 RT_PCR产物在 2.0%琼脂糖凝胶电泳结果
泳道 1:100bp DNA分子量标准品;泳道 2:GLC_82/
ADR细胞株;泳道 3:GLC_82细胞株
对照
6h
12h
18h
24h
与对照组比较 , *:P<0.05 , **:P<0.01
0.043±0.005
0.057±0.006
0.088±0.002**
0.157±0.020**
0.253±0.012**
0.027±0.005
0.118±0.018* *
0.187±0.009* *
0.263±0.030* *
0.347±0.024* *
0.048±0.002
0.054±0.003
0.053±0.005
0.063±0.050*
0.074±0.003**
0.030±0.002
0.038±0.005
0.035±0.004
0.071±0.050**
0.082±0.004**
GLC_82/ADR
Caspase_3 Caspase_Cas 8pase_3 Caspase_8
GLC_82
表 1 NSCLC细胞株 Caspase_3和 Caspase_8活性水平(OD)的变化
与GLC_82组比较 , *:P<0.05 , **:P<0.01
GLC_82
GLC_82/ADR
3.40±0.95
3.70±1.05
16.17±2.58
5.67±0.75*
23.07±3.07
8.20±1.66**
29.53±1.52
11.77±1.85**
对照 6h 12h 18h 24h
表 2 NSCLC细胞株细胞凋亡率(%)比较
39.13±1.99
13.37±2.67**
302 中国肿瘤 2002年第 11卷第 5期
李贵新 1 ,李国庆 2 ,赵常在 2 ,徐功立 1
(1.山东大学临床医学院山东省立医院肿瘤研究治疗中心 ,山东 济南 250021;2.潍坊市人民医院 ,山东潍坊 261041)
Expression of Telomerase Gene hTR in Gastric Cancer and Intestinal Cancer
LI Gui-xin , LI Guo-qing ,ZHAO Chang-zai , et al.
摘 要:[ 目的] 探讨胃癌和大肠癌中端粒酶基因 hTR表达与临床参数的关系 , 评价 hTR表达检测在胃癌和大肠癌诊断中
的价值。[ 方法] 用原位杂交的方法检测端粒酶基因 hTR在胃癌、大肠癌、胃癌和大肠癌癌旁组织、胃和大肠良性病变中的表达和分布情况。[ 结果] 57例胃癌中 hTR基因表达阳性率为 94.7%(54/57);57例癌旁组织中 hTR基因表达阳性率为 0(0/57);69例胃良性病变中 hTR基因表达阳性率为 2.9%(2/69)。胃癌组织中 hTR基因的表达与癌旁组织、胃良性病变比较差异有显著性
(P均<0.001)。胃癌组织中 hTR的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移相关(P 均<0.05),与肿瘤分期无相关性(P>0.05)。51例大肠癌中 hTR基因表达阳性率为 94.1%(48/51);51例癌旁组织中hTR基因表达阳性率为 0(0/51);31例大肠良性病变中hTR基
因表达阳性率为 3.2%(1/31)。大肠癌组织中 hTR基因的表达与癌旁组织、大肠良性病变比较差异有显著性(P均<0.001)。大肠癌组织中 hTR的表达与患者性别、病变部位、病理分类大体类型、淋巴结转移和临床分期无相关性(P均>0.05), 与肿瘤病理分级相关(P<0.05)。[ 结论] 端粒酶基因 hTR表达检测在胃癌和大肠癌的诊断中可能有一定的价值。
关键词:端粒 ,末端转移酶;胃肿瘤;结直肠肿瘤;基因;hTR基因中图分类号:R735.2;R735.3 文献标识码:B 文章编号:1004-0242(2002)05-0302-03
收稿日期:2001-12-28基金项目:山东省科学技术攻关计划基金资助项目(981154503B)
[ 1]
Caspase_8在凋亡过程中间接与细胞膜受体发生联系 ,从而将
细胞膜信息传递至细胞浆 , 是凋亡中首先被活化的蛋白酶 ,
Caspase_8活化后可以剪切活化 Caspase_3和 Caspase_10等 , 通
过这些蛋白酶剪切底物使凋亡继续进行 。Caspase_8属于启动
者 Caspase , Caspase_3属于效应者 Caspase , 启动者 Caspase居
于 Caspase级联反应的上游 , 通过酶切作用激活下游的 Cas-
pase_3 ,Caspase_3活化是导致凋亡的中心环节 [8 ]。本研究发现
阿霉素诱导敏感细胞株 Caspase 活性显著升高 , 且 Caspase_8
活性增高早于 Caspase_3 , 与级联反应的次序有关 [6 ] , 而耐药
株细胞 Caspase 活性增高低于敏感细胞 , 考虑 Caspase_3和
Caspase_8在参与 NSCLC耐药过程发生 , MRP蛋白表达不仅
导致细胞 MDR的产生 , 而且与凋亡抗性形成有关 , 造成
Caspase结构缺陷或激活阻断因素可以导致对化疗药物的抵
抗和耐受 。
进一步阐明凋亡分子 Caspase 参与 NSCLC耐药产生的
机制及其与凋亡发生的关系 , 加深对耐药细胞抗药性和抗
凋亡网络调控的了解 ,将为今后开辟逆转耐药研究提供新手
段 。
参考文献:
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胃癌大肠癌端粒酶基因 hTR表达