全 文 ：研究报告
2009年第 35卷第 2期(总第 254期) 57　
牛肝菌胞外多糖体外抗氧化能力的研究＊
阚国仕 ,矫丽曼 ,杨玉红 ,陈红漫
(沈阳农业大学生物科学技术学院 , 辽宁 沈阳 , 110161)
摘　要　主要探讨美味牛肝菌胞外多糖(BeBEP)体外抗氧化作用。结果表明 BeBEP 具有一定的还原能力 , 具
有显著的清除超氧阴离子自由基 、抑制羟基自由基能力 , 能抑制小鼠肝组织丙二醛的生成 ,可减少红细胞氧化溶
血和肝组织自发性脂质过氧化。总之 , BeBEP 具有显著的体外抗氧化作用。
关键词　美味牛肝菌 , 胞外多糖 ,体外抗氧化
第一作者:硕士 ,副教授(杨玉红为通讯作者)。
　＊沈阳农业大学青年基金项目项目编号 2005053
收稿日期:2008-07-29 ,改回日期:2008-10-30
　　多糖是生物有机体除蛋白质 、核酸之外的第三
大生物大分子。多糖作为信息分子广泛参与细胞间
配体与受体的相互识别 、细胞内信号转导等生理过
程 ,与细胞活化 、增殖 、分化及产生细胞因子等有关。
加之多糖本身低毒 、来源广泛 ,使得多糖研究成为近
年来的研究热点[ 1] 。美味牛肝菌(Boletus edudis
Bul l)属于担子菌纲伞菌目 、牛肝菌科。该菌中含有
人体所需的多种营养成分如蛋白质 ,维生素 ,氨基酸 ,
多糖及钙 、铁等微量元素等 ,因此美味牛肝菌具有极
高的食用价值和药用价值[ 2] 。由于菌根共生等复杂
原因 ,牛肝菌至今未能实现人工栽培 ,对发酵产生的
胞外多糖进行研究具有十分重要的现实意义。本文
主要对美味牛肝菌胞外多糖体外氧化能力进行了研
究。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
1.1.1　材料
美味牛肝菌5.504 , 购自中科院微生物研究所菌
种保藏中心。
昆明系小白鼠 ,雄性 ,8周龄 ,体重 20±2 g ,购自
沈阳药科大学试验动物中心。
1.1.2　试剂
葡萄糖 、麦芽糖 、酵母膏 、(NH 4)2SO 4 、KH 2PO 4 、
CuSO 4 、木瓜蛋白酶 、三氯甲烷 、正丁醇 、活性炭 、甲硫
氨酸 、NBT 、DEA E 、核黄素 、NaH 2PO 4 、Na2HPO 4 、邻
二氮菲 、FeSO 4 、H2O 2 、无水乙醇 、NaCl 、FeCl3 、K3 [ Fe
(CN)6] 、三氯乙酸 、2-硫代巴比妥酸。
1.2　BeBEP的发酵与提取
在无菌条件下 ,用直径为 10 mm 的打孔器 ,在长
满美味牛肝菌菌丝的培养皿上打孔 ,镊子夹取 2片菌
丝碟接种于盛有 100 mL 发酵培养基的三角瓶中 ,
28℃, 150 r/min恒温振荡培养 6天 ,取出滤去菌丝 ,
合并上清液浓缩 ,用 0.5%的木瓜蛋白酶+Sevage[ V
(多糖溶液)∶V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=25∶5∶
1])法脱去粗多糖溶液中游离的蛋白 , 3%活性炭 ,
50℃脱色 2 h ,过滤离心 ,浓缩 ,用 3倍体积 95%乙醇
沉淀 48 h ,沉淀冷冻干燥 ,得到多糖的半纯品 。
1.3　方　法
1.3.1　BeBEP 还原能力的测定
Oyaizu方法[ 3] 。
1.3.2　BeBEP 清除超氧阴离子自由基能力测定
NBT 光化还原法[ 4] 。
1.3.3　BeBEP 清除羟基自由基能力测定
Fenton反应[ 5 , 6] 。
1.3.4　BeBEP 对 H 2O 2 诱导红细胞氧化溶血作用
的影响[ 7 , 8]
小鼠眼球取血 ,制成抗凝血 ,3 000 r/min离心 10
min得到红细胞。冷生理盐水洗涤 3次 ,制成 0.5%
的红细胞悬液 。各组取红细胞悬液 0.5 mL ,每组 2
个平行 ,加不同浓度的 BeBEP 溶液 0.5 mL ,对照管
以生理盐水代替 ,混匀 ,最后加入 0.3% H2O2 0.2
mL 启动反应 ,37℃温浴 1 h后 ,用 4 mL 生理盐水稀
释 ,3 000 r/min 离心 10 min ,取上清液测定 415 nm
的吸光值 A ,计算抑制率 。
抑制率/ %=(A0 -A i)/A0 ×100
式中:A0 表示对照组的吸光值 , A i 表示各处理
组的吸光值 。
1.3.5　BeBEP 体外抗肝组织自发性脂质过氧化的
影响[ 9]
食品与发酵工业 FOOD AND FERMENTAT ION IND USTRIES
58　 2009 Vol.35 No.2(Total 254)
取 10%肝匀浆液 1.5 mL ,加入各浓度 BeBEP 1
mL ,以生理盐水作对照 ,充分混匀在 37℃水浴 3 h
后 ,立即加入 20 %三氯乙酸 1.5 mL 沉淀蛋白 ,3500
r/min离心 10 min ,取上清液3 mL ,加入 0.67%硫代
巴比妥酸 1.5 mL ,沸水浴 15 min ,冷却离心 ,于 532
nm 处测上清液吸光值 ,以不加肝匀浆和 BeBEP为空
白样 ,以加肝匀浆不加 BeBEP 为对照样 ,计算脂质过
氧化的抑制率。
脂质过氧化抑制率/ %=(A 0 -Ai)/A 0 ×100
式中 A 0 表示对照组的吸光值 ,A i 表示各处理组
的吸光值
1.3.6　BeBEP 抗 H 2O 2 引起的小鼠肝组织丙二醛
的生成[ 10]
小鼠禁食 16 h 后眼球取血处取肝脏 ,置于4℃生
理盐水中 ,洗去表面残血 ,在冰浴下匀浆 ,制成 10%
的肝匀浆 。稀释成 1%的肝组织匀浆液 ,取 1 mL ,加
不同浓度的 BeBEP 溶液0.5 mL 和 6 mmo l/LFeSO 4
0.2 mL ,最后加 60 mmo l/L H 2O 2 0.1 mL ,37℃下水
浴 1 h后 ,加入 1 mL 15% TCA 终止反应 ,再加入 1
mL 0.7%硫代巴比妥酸 ,沸水浴显色 15 min ,冷却后
离心 ,测 532 nm 上清液的吸光值 ,吸光值表示丙二
醛含量的多少 ,吸光值越大 ,丙二醛含量越高 。
2　结果与分析
2.1　BeBEP还原能力的研究
采用不同浓度的 BeBEP 溶液 ,对其还原能力进
行测定 ,吸光值越大表明还原能力越强 。以多糖浓度
为横坐标 ,吸光值为纵坐标绘制曲线见图 1。
图 1　BeBEP 还原能力
由图 1知 ,BeBEP 具有较高的还原能力 ,还原能
力随着 BeBEP 浓度的增加而增大。BeBEP 还原能
力的存在说明 BeBEP 具有表现抗氧化作用的可能
性。
2.2　BeBEP清除超氧阴离子自由基(O2 -·)能力
自由基损伤机体的心 、脑 、肝等细胞组织 ,是机体
产生某些疾病和衰老等的重要原因 ,特别是超氧阴离
子自由基对机体的损伤尤为严重 。采用不同浓度的
BeBEP 溶液 ,用 NBT 光还原法对超氧阴离子自由基
清除率进行测定 。以多糖的浓度为横坐标 ,清除率为
纵坐标绘制曲线见图 2 。
图 2　BeBEP对超氧阴离子自由基的清除效果
由图 2 可知 , BeBEP 具有清除超氧阴离子自由
基的能力。清除率随着 BeBEP 浓度的增大而增加 ,
当 BeBEP 浓度在 0 ～ 4 mg/mL 时其增加较快 ,大于
4 mg/mL 则增加缓慢 ,当浓度为 10 mg/mL 时清除
率达到 50.3%。
2.3　BeBEP清除羟基自由基(·OH)能力
在人体内 ,羟基自由基对细胞的危害最大 ,可直
接损伤各种生物大分子和生物膜 ,导致多种疾病的发
生 。采用 Fenton反应 ,对不同浓度的 BeBEP 溶液进
行清除羟基自由基能力测定 ,以多糖浓度为横坐标 ,
清除率为纵坐标绘制曲线见图 3。
图 3　BeBEP 对清除羟基自由基的清除效果
由图 3可知 , BeBEP 具有很强的清除羟基自由
基的能力 ,清除率随着 BeBEP 浓度的增大而增加 ,当
BeBEP 浓度在 0 ～ 3 mg/mL 时其增加缓慢 ,大于 4
mg/mL 则上升加快 ,当浓度为 10 mg/mL 时清除率
达到 72.9%。
2.4　BeBEP对 H2O2 诱导红细胞氧化溶血作用的影
响
生物膜的流动性与它的重要功能(信号传导 、能
量转换等)有密切关系 ,维持膜的正常结构是维持细
研究报告
2009年第 35卷第 2期(总第 254期) 59　
胞正常生理功能的必要条件。机体内的 H 202 可诱
发转变为羟基自由基 ,这种物质可引发氧化作用 ,使
红细胞损伤 ,胞内物质外流 。BeBEP 对 H 2O 2 诱导
红细胞氧化溶血作用的影响见表 1。
表 1　BeBEP 对 H2O2 诱导红细胞氧化溶血作用的结果
试验组 BeBEP/mg·mL-1 A 415
溶血率
/ %
抑制率
/ %
对照
处理 1
处理 2
处理 3
处理 4
处理 5
0
1
3
5
7
9
0.732±0.010
0.632±0.006＊
0.506±0.021＊
0.447±0.026＊
0.373±0.023＊
0.252±0.020＊
100
86.5
69.1
61.1
51.0
34.4
0
13.7
30.9
38.9
49.0
65.6
　　n=3 , x ±s , ＊:P<0.01对比对照组
由表 1 可知 , 随着 BeBEP 浓度的增加 , 其对
H 2O2 诱导红细胞氧化溶血抑制率也随之增大 ,当
BeBEP 浓度为 9 mg/mL ,抑制率可达到 65.5%,说
明 BeBEP 对 H2O 2 引起的红细胞溶血有显著的抑制
作用 。表明 BeBEP 在体外可以抑制自由基损伤 ,保
护红细胞的结构和功能。
2.5　BeBEP体外抗肝组织自发性脂质过氧化的影
响
脂质过氧化是氧化损伤中重要的危害之一。Be-
BEP 体外抗肝组织自发性脂质过氧化的结果见表 2。
表 2　BeBEP 体外抗肝组织自发性脂质过氧化的结果
试验组 BeBEP/mg·mL-1 A 532 抑制率/ %
对照
处理 1
处理 2
处理 3
处理 4
处理 5
0
2
4
6
8
10
1.572±0.013
1.318±0.021＊
1.045±0.019＊
0.846±0.008＊
0.731±0.018＊
0.657±0.024＊
0
18.6
42.0
53.5
58.2
68.4
　　n=3 , x ±s , ＊:P<0.01 对比对照组。
由表 2 可知 ,随着 BeBEP 浓度的增加 , BeBEP
体外抗肝组织自发性脂质过氧化的抑制作用也随之
增强 , BeBEP 浓度为 10 mg/mL 时 , 抑制率可达到
68.4%。说明 BeBEP 能抗肝组织自发性脂质过氧化
作用 。
2.6　BeBEP 抗 H2O2 引起的小鼠肝组织丙二醛
(MDA)的生成
MDA 是生物体内不饱合脂质发生过氧化的产
物 ,它可反映出过氧化反应的程度 。BeBEP 抗 H2O 2
引起的小鼠肝组织丙二醛的生成的结果见图 4 。
由图 4可知 ,有 BeBEP 时 ,丙二醛的生成量明显
减少 ,且随着 BeBEP 浓度的增加而减少 ,当多糖浓度
为 40 mg/mL ,吸光值减为 0.103。说明 BeBEP 能强
烈抑制脂质过氧化反应。
图 4　BeBEP对丙二醛生成的影响
3　结论与讨论
BeBEP 具有很强的体外抗氧化能力 ,表现为有
一定的还原能力 ,具有显著的清除超氧阴离子自由
基 、抑制羟基自由基能力 ,能抑制小鼠肝组织 MDA
的生成 ,可减少红细胞氧化溶血和肝组织自发性脂质
过氧化 。将 BeBEP 作为药用成分或抗氧化剂应用于
临床 ,可以治疗不少疾病;用于食品工业则具有保健
作用 ,所产生的社会效益从实践中得到了论证 。对
BeBEP 抗氧化活性的研究 ,可为其在临床 、保健品方
面的开发应用提供合理的科学理论基础 。对 BeBEP
抗氧化在各种体系下最佳的浓度范围以及 BeBEP 纯
化分离组分的抗氧化作用有待进一步研究。
参 考 文 献
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Study on the Antioxidative Activities of Extracellular
Polysaccharide of Boletus edudis Bull
Kan Guoshi , Jiao Liman ,Yang Yuhong ,Chen Hongman
(Biology Science and Technology Institute , Shenyang Ag riculture Univ ersity , Shenyang 110161 , China)
ABSTRACT　This ar ticle focused on Boletus edul is Bul l ex tracellular poly saccharide (BeBEP)in vi tro an-
tio xidant.The results show ed that BeBEP has a reduct ion capacity w ith signif icant removal of supe ro xide
f ree radicals.It also has hydroxy l radical capaci ty to suppression and the ability to inhibit the mouse liver ti s-
sue MDA gene rat ion.It w as seen tha t BeBEP can reduce oxidation of red blood cell hemoly sis and liver spon-
taneous lipid oxidat ion.In short , BeBEP is a significant in v it ro antio xidant.
Key words　Boletus edudis Bull , ext racellular poly saccharide , in v i tro antioxidation
(上接第 56页)
Protoplast Fusion Between Streptomyces
clavuligerus B71-14 and B71-50
Zuo Zhihan
1 , Zhang Yang2 ,Wang Yanping2
1(Colleg e of Chemical & Life Science , Tianjin normal university.T ianjin 300387 , China)
2(Depar tment o f Food Enginee ring & Biotechno log y , T ianjin Univer sity of Science &Techno lo gy , Tianjin 300457 , China)
ABSTRACT　Protoplast fusion be tw een g lycerol resistant mutants S .clavuligerus B71-14 and sulbactam so-
dium resistant mutant S .clavuligerus B71-50 we re made.Fusants were selected by the resistant markers.A
glycerol and sulbactam sodium resistant fusant S.clavul igerus F-11 w as selected f rom 98 mo rpholo gy dif fer-
ence fusants.The clavulanic acid yield of S.clavul igerus F-11 could reach 742.71mg/ L , which w as 1.38
times compared wi th S.clavul igerusB71-14(538.20mg/ L), 1.55 times compared w ith S .clavuligerus B71-50
(479.91mg/ L).
Key words　Streptomyces clavul igerus , protoplast fusion , clavulanic acid , gly cerol resistant , sulbactam re-
sistant.
　会　讯
　
德国国际烘焙 、糖果 、巧克力及糕点博览会
德国国际烘焙 、糖果 、巧克力及糕点博览会将于 2009 年 10 月 3 ～ 10 日在德国慕尼黑举办。慕尼黑国际烘焙 、糖
果 、巧克力及糕点博览会每 3 年举办一届 ,自从 1949 年首届 IBA博览会开幕以来 ,它就成为这些行业最为重要的国际性贸易博
览会 , 该展会每 3 年在杜塞尔多夫和慕尼黑各交替举办一次。在 iba———这个国际焙烤业盛会上 , 来自五大洲的参展商们将为
大中小型企业和专业人士展示他们的焙烤机械 、设备和产品 , 以及最新的技术和制作过程。在 2006 年杜塞尔多夫举办的上届
IBA 展会上 , 的参展面积吸引了来自36 个国家的参展商加盟 ,其中有国际展商 94家;参观观众共有 72 000 人 ,其中共有国际观
众 32 400 人。
展品范围:烤炉与附件 、面包与点心机械 、发酵 、冷藏与空调机械设备与技术 、烘焙代理与原材料供应 、部分烘焙制成品 、冰
激凌生产技术 、糕点生产技术 、咖啡店与糕饼店的家具与装修设计 、冰淇淋 、休闲食品与糖果甜点机械设备 、产品包装设备与包
装材料 、烘焙附件 、卫生与洁净设施 、实验与计量设备 、计算机 EDP硬件与软件 、相关服务。
中国联系人:李敏;联系电话:010-66122877-8008;联系地址:北京市西直门南大街 6 号 A 座 4308;
传真:010-66122877-8005;推广网址:ww w .silkroad2000.com。