全 文 ：164　
矫丽曼 1, 2 ,纪纯阳 2 ,阚国仕 1 ,陈红漫 1 ,杨玉红 1, ＊
(1.沈阳农业大学生物科学技术学院 ,辽宁沈阳 110161;
2.辽宁省杨树研究所 ,辽宁盖州 115200)
摘　要:主要对美味牛肝菌发酵产生的胞外多糖 (BeBEP)进行了分离纯化和组分的分析。方法:采用 DEAE-纤维素
柱层析和 SephadexG-100凝胶柱层析对 BeBEP进行分离纯化 ,得到的主要成分 BeBEPⅢa,用紫外光谱和醋酸纤维素
薄膜电泳方法进行纯度鉴定 ,红外光谱进行结构分析 ,高效液相色谱法分析单糖组分 。结果表明:BeBEPⅢa为均一组
分 ,存在吡喃糖苷 ,由 D-木糖 、D-甘露糖和 D-半乳糖三种单糖组成 ,摩尔比为 3.1∶63.3∶1.0 ,其中主要以 D-甘露糖
为主 。
关键词:美味牛肝菌 ,胞外多糖 ,分离纯化 ,组分分析
Separation, purificationandcomponentanalysisofextracelular
polysaccharideofboletusedudisbul
JIAOLi-man1 , 2 , JIChun-yang2 , KANGGuo-shi1 , CHENHong-man1 , YANGYu-hong1 , ＊
(1.BiologyScienceandTechnologyInstitute, ShenyangAgricultureUniversity, Shenyang110161 , China;
2.LiaoningProvincialInstituteofPoplar, Gaizhou115200 , China)
Abstract:Thisarticlefocusedontheseparationandpurificationandanalysisofthefermentationcomponentsof
BeBEP.The BeBEP wasseparated and purificatedbyDEAE-celuloseand SephadexG-100 column
chromatography, thepurityofwhichwasverifiedthroughultravioletspectrum andceluloseacetatepelicle
electrophoresis, thestructureofwhichwasanalyzedwithIRspectrumandthemonosaccharidecomponentwas
analyseswithHPLC.TheresultsshowedthatBeBEPⅢawasapolysaccharide, presencespyranindican, including
xylose, mannoseandgalactosewithamolarratioof3.1∶63.3∶1.0 , butmannosewasprimary.
Keywords:boletusedulis;extracelularpolysaccharide;separationandpurification;analysisofthecomponents
中图分类号:TS201.3　　　　文献标识码:A　　　　文 章 编 号:1002-0306(2010)05-0164-03
收稿日期:2009-07-17　＊通讯联系人
作者简介:矫丽曼(1981-),女 , 硕士研究生 ,主要从事酶工程及生物
活性物质方面的研究。
基金项目:沈阳农业大学青年基金项目(2005053)。
　　美味牛肝菌属于担子菌纲伞菌目 、牛肝菌科 、牛
肝菌属 ,又称大脚菇 ,它含有多种氨基酸 、维生素 、矿
物质和多糖 。动物实验和临床研究结果表明 [1 ] ,食药
用真菌多糖具有抗肿瘤 、病毒作用 ,能促进机体中枢
免疫器官胸腺和脾的增长 ,促进淋巴细胞增生 ,提高
机体的免疫功能 ,同时 ,对机体红细胞 SOD活性具有
促进作用 ,因而具有抗衰老的功效 ,是一种珍贵的药
物资源 。目前国内外的大多数研究都主要集中在对
美味牛肝菌多糖的发酵 、提取和生物活性方面 ,而对
它的分离纯化和组分分析研究的较少。因此本文较
深入地研究了美味牛肝菌胞外多糖的分离纯化方
法 ,并对纯化多糖的结构和组分进行初步研究 ,为进
一步研究美味牛肝菌胞外多糖的生物活性和多糖构
效关系提供一定的理论依据 。
1　材料与方法
1.1　材料与仪器
美味牛肝菌 5.504　购自中国科学院微生物所菌
种保藏中心;乙醇 ,三氯甲烷 ,正丁醇 ,活性炭 ,苯酚 ,硫
酸 ,氯化钠 ,硼砂 ,氢氧化钠 ,甲苯胺蓝 ,溴化钾 ,三氟乙
酸 ,甲醇 , DEAE-celulose, SephadexG-100。
721型分光光度计 , HH-6型数显恒温水浴锅 ,
LGJ-10型冷冻干燥仪 , SPD-10A紫外检测仪 ,红外
光谱仪 , SPD-10A检测仪 , LC-10AT流动泵 ,层析柱
(2.0cm×40cm)。
1.2　实验方法
1.2.1　BeBEP的提取与预处理 　在无菌条件下 ,用
直径为 10mm的打孔器 ,在长满美味牛肝菌菌丝的培
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2010.05.086
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养皿上打孔 , 镊子夹取两片菌丝碟接种于盛有
100mL发酵培养基的三角瓶中 , 28℃, 150r/min恒温
振荡培养 6d,取出滤去菌丝 ,合并上清液浓缩 ,用
0.5%的木瓜蛋白酶 +Sevage[ V(多糖溶液)∶V(三氯
甲烷)∶V(正丁醇)=25∶5∶1]法 [ 2]脱去粗多糖溶液中
游离的蛋白 , 3%活性炭 , 50℃脱色 2h,过滤离心 ,浓
缩 ,用三倍体积 95%乙醇沉淀 48h,沉淀冷冻干燥 ,得
到精制的 BeBEP。
1.2.2　BeBEP的分离纯化
1.2.2.1　DEAE-纤维素柱层析 [ 3-5] 　称取 100mg精制
的 BeBEP,充分溶于 10mL蒸馏水中 ,离心除去不溶
物 ,上清液用 DE-52阴离子交换柱进行层析分离 ,分
别用蒸馏水 、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0mol/L的 NaCl溶液依
次洗脱 ,控制洗脱速度 2mL/min,每管收集 3mL洗脱
液 ,苯酚-硫酸法跟踪检测收集液 ,合并各洗脱峰洗脱
液 ,浓缩 ,透析 ,冷冻干燥 ,即得 BeBEP的半纯品。
1.2.2.2　SephadexG-100凝胶柱层析 [ 5 ] 　取洗脱峰
含量高的组分 10mg溶于 10mL蒸馏水中 ,离心除去不
溶物 ,上清液用 SephadexG-100进行凝胶柱层析 ,用
相应浓度的 NaCl溶液洗脱 ,控制洗脱速度 2mL/min,
苯酚-硫酸法跟踪检测收集液 。收集各洗脱峰洗脱
液 ,浓缩 ,透析 ,冷冻干燥 ,得到 BeBEP的纯品 。
1.2.3　BeBEP的纯度鉴定 [ 6-8 ]
1.2.3.1　紫外光谱分析法 　将 BeBEP纯品配成
1mg/mL的水溶液 ,在紫外分光光度计上进行 200～
400nm的连续扫描 。
1.2.3.2　醋酸纤维素薄膜电泳法　醋酸纤维素薄膜
规格为 2cm×8cm, 缓冲液为硼砂 -NaOH缓冲液
(pH10.0),电压为 240V,电泳时间 30～ 40min, 1%甲
苯胺蓝溶液染色 , 90%乙醇漂洗至条带清晰 ,根据染
色后斑点的形状来判断样品的纯度。
1.2.4　BeBEP的红外光谱分析 [ 9-10] 　称取 BeBEP纯
品 2mg与 KBr混合 , 压片 , 测定 BeBEP在 4000 ～
200cm-1的红外吸收光谱。
1.2.5　BeBEP的单糖组分分析 [ 11-13] 　取 BeBEP纯品
5mg,加 2mol/L的三氟乙酸 4mL,真空封管 , 110℃水
解 6h, 40℃下蒸干试管中的液体 ,用 3mL甲醇洗涤蒸
干 ,重复三次 ,最后用无菌水复溶 。进行高效液相色
谱分析 ,并与标准单糖对照 ,确定单糖的组成种类 ,
计算各单糖的摩尔比 。
色谱条件为:流动相为乙腈∶水(80∶20),流速为
0.8mL/min,固定相为氨基柱 ,检测器为示差折光检
测器 ,柱温 25℃,进样量为 5μL。
2　结果与分析
2.1　DEAE-纤维素柱层析结果
由图 1 中可以看出 , 美味牛肝菌胞外多糖
BeBEP在不同的离子强度溶液中均有存在 ,主要出
现三个峰 ,但含量不同 ,蒸馏水洗脱峰(BeBEPⅠ )和
0.1mol/LNaCl洗脱峰 (BeBEPⅡ )含糖量较低 , 而
0.3mol/LNaCl洗脱峰(BeBEPⅢ)含糖量较高 。因此
只收集 BeBEPⅢ ,并对 BeBEPⅢ进行进一步的纯化 。
2.2　SephadexG-100凝胶柱层析结果
由图 2中可以看出 ,经 DEAE-纤维素柱层析得
图 1　BeBEP的 DEAE-纤维素柱层析曲线
到的 BeBEPⅢ并不是单一组分 , 通过 SephadexG-
100凝胶柱层析得到了两个峰 , 即 BeBEPⅢ a和
BeBEPⅢb, BeBEPⅢb含糖量较低 ,所以未作研究。
而 BeBEPⅢa含糖量较高 ,收集并对其进行纯度鉴定
和理化性质的研究 。
图 2　BeBEPⅢ的 SephadexG-100凝胶柱层析曲线
2.3　BeBEP的纯度鉴定结果
2.3.1　紫外光谱分析法　从图 3的紫外扫描图谱可
以看出:牛肝菌胞外多糖 BeBEPⅢa的紫外扫描曲线
比较平滑 , 在 260、280nm处无吸收峰 , 可以认为 ,
BeBEPⅢa不含有杂蛋白 、多肽和核酸 ,证明其为单
一组分的多糖纯品 。
图 3　BeBEPⅢa的紫外扫描图谱
图 4　BeBEP、BeBEPⅢ 、BeBEPⅢa的电泳图
2.3.2　醋酸纤维素薄膜电泳法　由图 4的电泳图可以
看出 ,精制的 BeBEP电泳后斑点不唯一 ,说明含有多
种多糖组分;BeBEPⅢ电泳后有两个蓝色的斑点 ,说明
含有两种多糖。而经 SephadexG-100凝胶柱层析得
到的多糖组分 BeBEPⅢa,其醋酸纤维素薄膜电泳结果
为单一的蓝色斑点 ,说明 BeBEPⅢa在组成上比较唯
一 ,是一种多糖纯品 ,可以进行多糖理化性质的研究。
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2.4　BeBEP的红外光谱分析结果
由图 5可以看出 , BeBEPⅢa在 3416.2cm-1处有
一强且宽的吸收峰 ,是多糖的 O-H键的伸缩振动 ,
表明多糖存在分子内和分子间的氢键;在 2931.1cm-1
处的吸收峰表明分子中有 C-H键的伸缩振动 ,为糖
类的特征峰;1637.3cm-1处的吸收峰是 C-O的非对
称伸缩振动峰 ,为多糖的水合振动峰;在 1386.3cm-1处
的吸收峰为-OH的变形振动 ,表明该组分为多聚糖;
1054.8cm-1处比较大的吸收峰是由两种 C-O键伸缩振
动所引起的;其中一种是属于 C-O-H的 ,另一种是糖
环的 C-O-C。在 813.9cm-1处出现的吸收峰为吡喃糖
苷吸收峰 ,说明该组分中存在吡喃糖苷;在 579.6cm-1
处的吸收峰是硫酸酯键的吸收峰 ,表明多糖 BeBEPⅢa
含有硫酸基团 ,因而可能具有抗病毒作用。
图 5　BeBEPⅢa红外光谱图
2.5　BeBEP的单糖组分分析结果
BeBEPⅢa用三氟乙酸完全水解进行 HPLC分
析 ,并与单糖标准品的保留时间对比 ,分析 BeBEPⅢa
的单糖组分 ,根据峰面积确定各单糖在分子组成上
的摩尔比。
从图 6和图 7可以看出 ,与标准单糖的保留时间
对比 , BeBEPⅢa完全水解液里含有三种单糖:D-木
糖 、D-甘露糖和 D-半乳糖 ,摩尔比为:3.1∶63.3∶1.0。
可见美味牛肝菌胞外多糖 BeBEPⅢa主要由 D-甘露
糖组成 。
图 6　标准单糖的 HPLC色谱图
自左向右依次为:L-鼠李糖 、D-木糖 、D-果糖 、
D-甘露糖 、D-葡萄糖 、D-半乳糖。
图 7　BeBEPⅢa水解液的 HPLC色谱图
3　结论
3.1　脱蛋白去色素后的牛肝菌多糖 BeBEP, 经过
DEAE-纤维素柱层析和 SephadexG-100凝胶柱层析
分离纯化得到 BeBEPⅢa,用紫外光谱和醋酸纤维素
薄膜电泳方法对其纯度进行鉴定 ,结果表明 , BeBEP
Ⅲa是单一的组分 ,可以用于结构和组分的分析 。
3.2　BeBEPⅢa红外光谱扫描得出:该多糖存在分子
内和分子间的氢键 ,分子中还存在 C-H键伸缩振动
和-OH的变形振动 , 存在吡喃糖苷吸收峰。说明
BeBEPⅢa是典型的多糖类化合物 ,而且分子中存在
硫酸酯键 ,具有潜在的抗病毒作用 。
3.3　BeBEPⅢa经过高效液相色谱分析得出:其单糖
组成为 D-木糖 、D-甘露糖和 D-半乳糖 ,摩尔比为
3.1∶63.3∶1.0,主要以 D-甘露糖为主 。
本文主要对美味牛肝菌胞外多糖进行了分离纯
化 、结构和组分分析 ,而对其分子结构 、生物学活性
及其作用机制还有待进一步的研究 ,以期为美味牛
肝菌多糖药用价值的研制拓宽发展空间和途径。
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