全 文 ：书　　注：本课题系湖北省教育厅基金［ＮＯ．Ｂ２０１３１２２］和十堰市科技局基金［ＮＯ．ＺＤ２０１３０２９］资助项目
＊通信作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｌ００１００１＠２１ｃｎ．ｃｏｍ
·论　著·
两种藤梨根制剂促凋亡作用的实验研究
　　国宏莉１，２　李江华３＊　李　斌１　徐臣利１　田　林２
　　（１．湖北医药学院病理学教研室，湖北 十堰４４２０００；２．湖北医药学院附属人民医院病理科，湖北
十堰４４２０００；３．附属太和医院显微整形外科，湖北 十堰４４２０００）
　　摘　要　目的　研究两种藤梨根制剂促进人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞凋亡的机制及差异。方法
采用 ＭＴＴ比色法检测藤梨根正丁醇药液及乙酸乙酯药液在不同浓度（１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、
１００μｇ／ｍＬ等）及不同时间（２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ等）对Ｅｃａ－１０９细胞生长的抑制作用；采用ＴＵＮＥＬ法检
测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应；采用免疫组化ＳＰ法检测凋亡相关蛋白Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２及ｃａｓｐａｓｅ的
表达。结果 藤梨根正丁醇药液对人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞的生长抑制作用，随着药物浓度的升高和作
用时间的延长而增强，其生长抑制率可达８７．２％。两种藤梨根制剂对瘤细胞有明显的凋亡效应，而
在对照组未见有明显凋亡现象。瘤细胞作用２４ｈ、４８ｈ、７２ｈ后分别与对照组比较，用药组Ｂａｘ蛋白
表达明显增强（Ｐ＜０．０１）；同时伴有Ｂｃｌ－２表达减弱，７２ｈ后最明显，差异有显著意义（Ｐ＜０．０１）。藤
梨根正丁醇药液促进ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－９表达明显增强，而对ｃａｓｐａｓｅ－８表达影响较小。藤梨根乙酸
乙酯药液作用于肿瘤细胞时也可观察到类似的效应，且正丁醇药液对肿瘤细胞生长的抑制率高于乙
酸乙酯药液。结论 藤梨根可通过下调Ｂｃｌ－２表达，激活ｃａｓｐａｓｅ－９、ｃａｓｐａｓｅ－３诱导Ｅｃａ－１０９细胞凋亡。
　　关键词　藤梨根／猕猴桃根　　食管肿瘤　　凋亡ｃａｓｐａｓｅ激活
Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｎ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａｅ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｕｏ
Ｈｏｎｇｌｉ１，２，Ｌｉ　Ｊｉａｎｇｈｕａ３＊，Ｌｉ　Ｂｉｎ１，Ｘｕ　Ｃｈｅｎｌｉ１，Ｔｉａｎ　Ｌｉｎ２．１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｈｕｂｅｉ　Ｕ－
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｉｙａｎ４４２０００，Ｃｈｉｎａ．２．Ｄｅｐｔａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ
Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｉｙａｎ，４４２０００，Ｃｈｉｎａ．３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ
Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ　Ｔａｉｈｅ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｈｕｂｅｉ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈｉｙａｎ４４２０００，Ｃｈｉｎａ．
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ａｎｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｋｉｎｄｓ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ
ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｅｓｏｐｈａｇｕｓ　Ｅｃａ－１０９ｃｅｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ＭＴＴ　ｃｏｌｏｎｍｅｔｒｉｃ　ａｓｓａｙ　ｗａｓ
ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ－ｅｆｆｅｃｔ（１μｇ／ｍＬ，１０μｇ／ｍＬ，１００μｇ／ｍＬ　ｅｔｃ）ａｎｄ
ｔｉｍｅ－ｅｆｆｅｃｔ（２４ｈ，４８ｈ，７２ｈｅｔｃ）ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　ｂｙ　ｎ－ｂｕｔｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ａｎｄ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｏｎ
Ｅｃａ－１０９ｃｅｌｓ．ＴＵＮＥＬ　ｔｅｓｔ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｘ，Ｂｃｌ－２ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ｗｅｒｅ　ｍｅａｓｕｒｅｄ　ｂｙ　ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄ（ＳＰ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｓ　ｆｒｏｍ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　ｂｙ　ｎ－ｂｕｔｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｏｎ　Ｅｃａ－１０９
ｃｅｌｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｔｅｐ　ｂｙ　ｓｔｅｐ　ｔｏ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｉｍｅ，ｔｈｅ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｗａｓ　８７．２％．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔ
ｃａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ｅｃａ－１０９ｃｅｌｓ，ｂｕｔ　ｉｎ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｗａｓ　ｎｏｔ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｃｏｍ－
ｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｂａｘ　ｉｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１），ｂｕｔ　ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌ　ｏｆ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｃｌ－２ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ａｆｔｅｒ　２４ｈ，４８ｈａｎｄ　７２ｈ（Ｐ＜０．０１），ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ　ａｆｔｅｒ　７２ｈ．Ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ　ｏｆ
ｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ－９ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｂｙ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ，ｂｕｔ　Ｌｉｔｔｌｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｃａｓｐａｓｅ－８．Ｔｈｅ
ｓｉｍｉｌａｒ　ｅｆｆｅｃｔ　ｗａｓ　ｂｅ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｗｈｉｌｅ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　ｂｙ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅｔａｔｅ　ｏｎ　Ｅｃａ－１０９ｃｅｌｓ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌ
ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　ｂｙ　ｎ－ｂｕｔｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｒ　ｔｈａｎ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　ｂｙ　ｅｔｈｙｌ　ａｃｅ－
ｔａｔｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　ｍａｙ　ｉｎｄｕｃｅｓ　ａｐｏｐｔｏｔｉｃ　Ｅｃａ－１０９ｃｅｌｓ　ｄｅａｔｈ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｂｃｌ－２
·５７６·贵州医药２０１３年８月第３７卷第８期
ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ　ｃａｓｐａｓｅ－９ａｎｄ　ｃａｓｐａｓｅ－３．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｔｅｎｇｌｉｇｅｎ／Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ　　Ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｏｆ　ｅｓｏｐｈａｇｕｓ　　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　　Ｃａｓｐａｓｅ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ
　　中图分类号：Ｒ７３０．５２；Ｒ－３３　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１０００－７４４Ｘ（２０１３）０８－０６７５－０６
　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ＩＳＳＮ．１０００－７４４Ｘ．２０１３．０８．００１
　　随着中医药对肿瘤治疗的大量临床观察及实验
研究的深入，人们逐渐肯定了它对肿瘤治疗方面的
疗效。藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨（软
枣猕猴桃）Ａｃｔｉｎｉｄｉａ　ａｒｇｕｔａ（Ｓｉｅｂ．ｔｅＺｕｃｃ．）Ｐｌａｎｃｈ
或猕猴 Ａｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　Ｐｌａｎｃｈ的根，有败毒抗癌、清热
消肿的作用。近年来，藤梨根的抗肿瘤作用引起了
国内外部分学者的关注，并在构效分析研究的指导
下获得了许多肿瘤细胞毒活性明显提高的衍生
物［１－２］。我们的前期研究［３］表明藤梨根能明显抑制
人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞的生长，并能诱导细胞凋亡。
但其如何诱导细胞凋亡，不同制剂抗肿瘤作用有何
差异等目前均不太清楚。本研究对藤梨根诱导人食
管癌Ｅｃａ－１０９细胞凋亡，凋亡与Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２蛋白表
达及ｃａｓｐａｓｅ活化的关系进行探讨，同时观察不同
制剂对细胞凋亡作用的差异。
１　材料与方法
１．１　材料
１．１．１　细胞株与细胞培养　人食管癌细胞 Ｅｃａ－
１０９细胞株购于上海市中科院细胞库，细胞在含
１０％小牛血清的 ＲＰＭＩ　１６４０培养液中，３７℃、５％
ＣＯ２ 条件下培养，２４ｈ换液１次。
１．１．２　主要试剂及仪器　ＲＰＭＩ－１６４０培养基购于武
汉天源生物技术有限公司，为Ｇｉｂｃｏ公司产品（货号
３１８００－０２２）；超级新生牛血清为杭州四季青生物工程
有限公司产品（批号０５０１２６）；实验用１∶２５０胰酶购
于武汉天源生物技术有限公司，为Ｄｉｆｃｏ公司产品（批
号０２０４１１）；四甲基偶氮唑蓝（ＭＴＴ）购于武汉天源生
物技术有限公司，为Ｄｕｃｈｅｆａ分装（货号ＢＳ０８８０）；二
甲亚砜（ＤＭＳＯ）购于武汉天源生物技术有限公司，为
Ｓｉｇｍａ公司产品。Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２及ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８、
ｃａｓｐａｓｅ－９相关蛋白均购于福州迈新生物技术有限公
司。藤梨根正丁醇提药液（主要成分为三萜皂苷）及
乙酸乙酯－水提药液（主要成分为蒽醌类化合物）［４］由
湖北医药学院药学部新药研制中心提供 （５００ｍＬ，
１ｇ／ｍＬ，ｐＨ＝３．８），使用时用ＲＰＭＩ　１６４０培养基稀
释到１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ等药物浓度。
酶标仪（美国Ｂｉｏｔｅｃｈ公司Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ型）；ＣＯ２ 培养
箱（德国Ｂｉｎｄｅｒ　ＣＢ１５０型）；数码相机（日本尼康ｃｏｏｌ－
ｐｉｘ４５００型）；Ｍｏｔｉｃ　６．０　１０００高清晰度彩色病理图像
分析系统（厦门麦克奥迪有限公司）。
１．２　方法
１．２．１　ＭＴＴ法观察瘤细胞生长并计算生长抑制
率　将贴壁细胞用０．２５％的胰蛋白酶消化后计数，
调整细胞浓度为４×１０４ 个／ｍＬ，接种于９６孔板，待
２４ｈ细胞贴壁后加入藤梨根药液。实验组分别加
入终浓度为１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ等药
物浓度的药液，对照组加入等体积溶剂的培养液，每
组ｌ２复孔，分别于加药后第１、２、３天等时间后测定
各孔的吸光度值（Ａ值）。测定前每孔加５ｍｇ／ｍＬ
的 ＭＴＴ　２０μＬ，温育４ｈ，弃上清液，加入二甲基亚
砜（ＤＭＳＯ）１５０μＬ／孔。同时振荡至结晶完全溶解，
用酶联免疫检测仪在４９０ｎｍ波长下测定 Ａ４９０值。
用各组的平均Ａ值计算细胞生长抑制率。
生长抑制率＝
对照组Ａ４９０－实验组Ａ４９０
对照组Ａ４９０
×１００％
１．２．２　ＴＵＮＥＬ法检测凋亡细胞　将浓度为４×
１０４／ｍＬ的Ｅｃａ－１０９细胞接种于经多聚赖氨酸包被的清
净盖玻片上，用ＲＰＭＩ　１６４０培养基于３７℃、５％ＣＯ２ 条
件下在２４孔板中培养２４ｈ后取出盖玻片，ＰＢＳ冲洗３
次。０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－１００破膜，４％多聚甲醛固定，Ｈ２Ｏ２ 阻
断。用ＴｄＴ（末端脱氧核糖核酸转移酶）法将生物素标
记的ｄ－ＵＴＰ在末端转移酶的作用下，标记到ＤＮＡ的５
＇端缺口上，再用亲和素标记的ＨＲＰ与之结合，然后加
入底物ＤＡＢ显色，苏木素复染，从而使凋亡细胞核呈
现棕褐色，未凋亡细胞核呈蓝色。在光学显微镜下随
机计数５个高倍视野约１０００个细胞中的凋亡细胞数，
·６７６· Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．８
计算凋亡细胞所占比例。
１．２．３　免疫细胞化学ＳＰ法检测凋亡相关蛋白并行
图像分析　将浓度为４×１０４ 个／ｍＬ的Ｅｃａ－１０９细胞
接种于经多聚赖氨酸包被的清净盖玻片上，用ＲＰＭＩ
１６４０培养基于３７℃、５％ＣＯ２ 条件下，在２４孔板中培
养２４ｈ后取出盖玻片，ＰＢＳ冲洗３次。０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ－
１００破膜，４％多聚甲醛固定，经Ｈ２Ｏ２ 阻断、血清封闭
后，滴加５０μＬ一抗（分组滴加Ｂａｘ、Ｂｃｌ－２及ｃａｓｐａｓｅ－
３、ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９等），ＰＢＳ代替一抗作阴性对
照，４℃冰箱过夜。滴加生物素标记的二抗，ＰＢＳ冲洗
３次。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，ＤＡＢ
显色。苏木精复染，盐酸分化，氨水返蓝，中性树胶封
片。结果判断：每张细胞爬片随机选取５个不同部
位，显微镜下拍照，用Ｍｏｔｉｃ　６．０高清晰度彩色病理图
像分析系统对阳性细胞进行分析，测定阳性细胞的灰
度值或光密度值。
１．２．４　统计学分析　计量资料用均数＋－标准差（珚ｘ
±ｓ）表示，各组样本均数间比较采用ＳＰＳＳ　１０．０统
计分析软件包行ｔ检验。
２　结　果
２．１　两种藤梨根制剂对人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞生
长的影响
结果显示，当用１μｇ／ｍＬ的正丁醇药液作用
２４ｈ，细胞生长抑制率为１８．５％；当延长至７２ｈ时，
抑制率上升至４５．３％ ；而用１００μｇ／ｍＬ的药物作
用７２ｈ时，可使８５％以上的细胞生长受到抑制。藤
梨根乙酸乙酯药液作用于肿瘤细胞时也可观察到类
似的效应，且结果显示正丁醇药液对肿瘤细胞生长
的抑制率高于乙酸乙酯药液（图１－２）。结果表明，
藤梨根对人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞的生长抑制作用，
随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。
图１　藤梨根正丁醇药液对人食管癌
Ｅｃａ－１０９细胞生长抑制作用
注：与对照组比较＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１
图２　藤梨根乙酸乙酯药液对人食管癌
Ｅｃａ－１０９细胞生长抑制作用
注：与对照组比较＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１
２．２　藤梨根对人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞Ｂａｘ及Ｂｃｌ－２
表达的影响
藤梨根对人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞Ｂａｘ及Ｂｃｌ－２表
达的影响见表１－２。结果显示，两种藤梨根药液对肿
瘤细胞作用２４、４８、７２ｈ等时间后分别与对照组比
较，用药组Ｂａｘ蛋白表达明显增强（Ｐ＜０．０１），同时伴
有Ｂｃｌ－２表达的改变；空白对照组细胞Ｂｃｌ－２蛋白表达
水平最高即平均灰度值最小，胞质着色的细胞数最多
且呈深棕色。用药２４ｈ后Ｂｃｌ－２蛋白表达开始减弱；
４８ｈ后其表达量与对照组比较，差异有显著意义（Ｐ
＜０．０５）；７２ｈ后降低更为明显（Ｐ＜０．０１）。
表１　Ｂｃｌ－２在Ｅｃａ－１０９细胞的胞质表达 （灰度值，珚ｘ±ｓ）
分组 浓度 ２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
Ａ组 １μｇ／ｍＬ　 １２８．４８±７．０１　 １２３．０７±５．３９　 １１９．６３±４．８６＊＊
１０μｇ／ｍＬ　 １２７．２２±８．５６　 １１９．９０±４．５６　 １１４．７３±５．２８＊＊
１００μｇ／ｍＬ　 １２４．０１±７．２３　 １１４．４２±４．９２＊ １０９．７５±３．５１＊＊
Ｂ组 １μｇ／ｍＬ　 １２８．４３±６．４２　 １２３．４４±５．２３　 １１６．８８±５．５３＊＊
１０μｇ／ｍＬ　 １２７．２１±４．５６　 １１９．７６±３．９４＊ １１４．０７±３．３５＊＊
１００μｇ／ｍＬ　 １２５．２２±４．１１　 １１２．６４±４．５６＊ １０９．９２±４．６１＊＊
对照组 ０μｇ／ｍＬ　 １２９．８８±６．１３　 １２５．４４±７．５３　 １２３．４３±５．５７
　　注：Ａ：正丁醇组；Ｂ：乙酸乙酯组；与对照组比较＊Ｐ ＜０．０５，＊＊Ｐ ＜０．０１
·７７６·贵州医药２０１３年８月第３７卷第８期
表２　Ｂａｘ在Ｅｃａ－１０９细胞的胞质表达 （灰度值，珚ｘ±ｓ）
分组 浓度 ２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
Ａ组 １μｇ／ｍＬ　 １６５．４８±１１．０１＊＊ １８５．０７±８．３９＊＊ １９６．６３±９．８６＊＊
１０μｇ／ｍＬ　 １７２．２２±１１．２３＊＊ １８８．９０±１３．５６＊＊ １９８．７３±９．２８＊＊
１００μｇ／ｍＬ　 １７９．１±１１．０２＊＊ １９３．４２±８．９７＊＊ １９８．７５±８．５１＊＊
Ｂ组 １μｇ／ｍＬ　 １５３．４３±８．４２＊＊ １７９．４４±１０．２３＊＊ １９２．８８±８．５３＊＊
１０μｇ／ｍＬ　 １５４．２１±８．５６＊＊ １８３．７６±９．１４＊＊ １９４．０７±９．３５＊＊
１００μｇ／ｍＬ　 １６１．２２±９．０１＊＊ １９１．６４±９．５６＊＊ １９６．９２±９．６１＊＊
对照组 ０μｇ／ｍＬ　 １２５．４３±５．４２　 １２５．８９±６．２３　 １２６．８８±８．５８
　　注：Ａ：正丁醇组；Ｂ：乙酸乙酯组；与对照组比较＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ ＜０．０１
２．３　ＴＵＮＥＬ法检测细胞凋亡
当用１μｇ／ｍＬ藤梨根正丁醇药液处理Ｅｃａ－１０９
细胞２４ｈ时，可检测到形态尚未发生改变的早期凋
亡细胞；当药物作用时间延长至７２ｈ时，可见凋亡
细胞变圆，体积明显缩小，核染色质浓缩，变成新月
形，此为晚期凋亡细胞；随时间的推移，凋亡细胞比
例逐渐增加，１００μｇ／ｍＬ 提取物 ７２ｈ 后可达
６０．８％。见图３－４。当用乙酸乙酯药液作用于肿瘤
细胞时也观察到同样的效应。而对照组未见有明显
凋亡现象。
图３　ＴＵＮＥＬ法检测凋亡细胞比例（藤梨根正丁醇药液组）
图４　ＴＵＮＥＬ法检测凋亡细胞比例（藤梨根乙酸乙酯药液组）
２．４　藤梨根对Ｅｃａ－１０９细胞ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－８、
ｃａｓｐａｓｅ－９表达的影响
藤梨根正丁醇药液对Ｅｃａ－１０９细胞ｃａｓｐａｓｅ－３、
ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９表达的影响见表３。结果显示，
用１μｇ／ｍＬ 藤梨根对肿瘤细胞作用 ２４ｈ 时，
ｃａｓｐａｓｅ－８ 的 表 达 未 见 明 显 改 变，ｃａｓｐａｓｅ－３、
ｃａｓｐａｓｅ－９表达稍增强；作用４８、７２ｈ后，用药组
ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－９表达逐渐增加。１００μｇ／ｍＬ藤
梨根作用７２ｈ时，两组ｃａｓｐａｓｅ－３、ｃａｓｐａｓｅ－９表达均
明显增强（Ｐ＜０．０１）。当用乙酸乙酯药液作用于肿
瘤细胞时也观察到同样的效应，见表４。
表３　ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９和ｃａｓｐａｓｅ－３在Ｅｃａ－１０９细胞胞质的表达 （藤梨根正丁醇药液组，光密度值，珚ｘ±ｓ）
分组 剂量 ２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
Ｃａｓｐａｓｅ－８　 １μｇ／ｍＬ　 ０．１００±０．０１５　 ０．１１２±０．０１１　 ０．１２１±０．０１４
１０μｇ／ｍＬ　 ０．１１４±０．０１３　 ０．１２５±０．０１６　 ０．１２６±０．０１１
１００μｇ／ｍＬ　 ０．１１５±０．００７　 ０．１２５±０．０１７　 ０．１３８±０．０２０＊
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．１０６±０．０１３　 ０．１１６±０．０１２　 ０．１２１±０．０１５
Ｃａｓｐａｓｅ－９　 １μｇ／ｍＬ　 ０．１１４±０．０１３＊ ０．１３４±０．０２１＊ ０．１５１±０．０１３＊
１０μｇ／ｍＬ　 ０．１４５±０．０１５＊ ０．１７２±０．０１６＊ ０．１９７±０．００９＊
１００μｇ／ｍＬ　 ０．１６７±０．０１０＊ ０．２０１±０．０１２＊ ０．２２８±０．０１７＊
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．１００±０．０１１　 ０．１１２±０．０１３　 ０．１２０±０．０１６
Ｃａｓｐａｓｅ－３　 １μｇ／ｍＬ　 ０．１０４±０．００９　 ０．１２５±０．０１１＊ ０．１４６±０．０１５＊
１０μｇ／ｍＬ　 ０．１１１±０．０１３　 ０．１３５±０．０２０＊ ０．１８７±０．０２０＊
１００μｇ／ｍＬ　 ０．１１５±０．０１７　 ０．１５２±０．０１７＊ ０．２１７±０．０１４＊
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．１０５±０．０１０　 ０．１１５±０．０２１　 ０．１２２±０．０１８
　　注：与对照组比较＊Ｐ＜０．０５
·８７６· Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．８
表４　ｃａｓｐａｓｅ－８、ｃａｓｐａｓｅ－９和ｃａｓｐａｓｅ－３在Ｅｃａ－１０９细胞胞质的表达 （藤梨根乙酸乙酯药液组，光密度值珚ｘ±ｓ）
分组 剂量 ２４ｈ ４８ｈ ７２ｈ
Ｃａｓｐａｓｅ－８　 １μｇ／ｍＬ　 ０．１０１±０．０１２　 ０．１１５±０．０１３　 ０．１１９±０．０１３
１０μｇ／ｍＬ　 ０．１１６±０．０２０　 ０．１２１±０．０１２　 ０．１３３±０．０１５
１００μｇ／ｍＬ　 ０．１１２±０．０１１　 ０．１２１±０．０１６＊ ０．１２８±０．０１９＊
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．１０６±０．０１３　 ０．１１６±０．０１２　 ０．１２１±０．０１５＊
Ｃａｓｐａｓｅ－９　 １μｇ／ｍＬ　 ０．１１０±０．０１２　 ０．１２９±０．０１３＊ ０．１４３±０．０１３＊
１０μｇ／ｍＬ　 ０．１３１±０．０１６＊ ０．１５０±０．０１９＊ ０．１７１±０．０１５＊
１００μｇ／ｍＬ　 ０．１５７±０．０２０＊ ０．１７８±０．０１６＊ ０．２１２±０．０１９＊
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．１００±０．０１１　 ０．１１２±０．０１３　 ０．１２０±０．０１６
Ｃａｓｐａｓｅ－３　 １μｇ／ｍＬ　 ０．１０１±０．０１２　 ０．１１５±０．０１３　 ０．１１９±０．０１９
１０μｇ／ｍＬ　 ０．１１６±０．０１８　 ０．１２４±０．０１３＊ ０．１２８±０．０２０＊
１００μｇ／ｍＬ　 ０．１１３±０．０２１　 ０．１２１±０．０１６＊ ０．１３３±０．０１９＊
Ｃｏｎｔｒｏｌ　 ０．１０５±０．０１０　 ０．１１５±０．０２１０．１２２±０．０１８＊
　　注：与对照组比较＊Ｐ＜０．０５
３　讨　论
藤梨根全株含猕猴桃碱（ａｃｔｉｎｉｄｉｎｅ），根含熊果
酸（ｕｒｓｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、齐墩果酸（ｏｌｅａｎｏｌｉｃ　ａｃｉｄ）、琥珀酸
（ｓｕｃｃｉｎｉｃ　ａｃｉｄ）、胡萝卜甙（ｄａｕｃｏｓｔｅｒｏ１）以及精氨
酸、赖氨酸、亮氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸等，并富含
Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｎ、Ｓｅ等元素。其性苦、寒，归肺、肝、胃、
脾、大肠经，有败毒抗癌、清热消肿的作用，可用于消
化系统肿瘤的治疗。
同种猕猴桃根不同提取方法所得的提取物其抗
肿瘤作用可能不尽相同。有学者用甲醇、水、乙酸乙
酯、正丁醇等溶剂回流提取，观察提取物对同种肝
癌细胞株的作用，结果表明正丁醇、乙酸乙酯提取
物对瘤细胞的生长有良好的抑制作用，但各组量效
关系不明显。关于藤梨根提取物中抗肿瘤作用的成
分，曾有人报道主要为三萜类化合物，分别为乙酸
乙酯提取物熊果酸、β－谷甾醇及正丁醇提取物２α，
３α，２４－三羟基－１２－烯－２８－乌苏酸、２β，３β，２３－三羟基－
１２－烯－２８－乌苏酸、２４－ｈｙｄｒｏｘｙｔｏｒｍｅｎｔｒｉｃ　ａｃｉｄ 。我
们的前期研究表明藤梨根能明显抑制人食管癌
Ｅｃａ－１０９细胞的生长，但其抗肿瘤作用机制还不
清楚。
本研究中我们观察到，藤梨根两种制剂三个药
物浓度１μｇ／ｍＬ 、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ作用于
Ｅｃａ－１０９细胞２４、４８、７２ｈ后，ＭＴＴ法发现随药物
浓度升高和作用时间的延长，其抑制率明显升高，且
正丁醇药液对肿瘤细胞生长的抑制率高于乙酸乙酯
药液。因此我们推测，抑制肿瘤细胞生长诱导肿瘤
细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。
许多研究表明，藤梨根对多种肿瘤细胞生长均
有抑制作用。杨维泓等［５］观察了复方藤梨根制剂
（ＦＦＩ＇ＬＧ）对荷人肺巨细胞癌（ＰＧ）裸鼠移植瘤的生
长和瘤体组织 Ｃｘ４３表达的影响，认为其抗肿瘤作
用与其调节 Ｃｘ４３表达水平有关，通过上调肿瘤细
胞Ｃｘ４３基因的表达，恢复肿瘤细胞的 ＧＪＩＣ功能，
从而调控肿瘤细胞的增殖分化和代谢等功能。孙雪
飞等［６］观察藤梨根乙酸乙酯提取物（ＲＡＥ）对肺癌
Ａ５４９细胞凋亡的影响，可明显诱导肺癌Ａ５４９细胞
凋亡，其机制可能与降低其Ｂｃｌ－２蛋白和 ｍＲＮＡ表
达、上调Ｂａｘ蛋白和ｍＲＮＡ表达、升高细胞内Ｃａ２＋
浓度有关。
近年发现，肿瘤的发生、发展不仅与细胞增殖有
关，亦与细胞凋亡有关。凋亡基因精确调控凋亡过
程。目前认为至少有３条通路参与凋亡的发生，即
传统信号传导通路、死亡受体通路（ｄｅａｔｈ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｐａｔｈｗａｙ）和线粒体通路（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｐａｔｈｗａｙ）通
路，各条通路间又有串话 （ｃｒｏｓｓ　ｔａｌｋｉｎｇ），共同促进
细胞凋亡。３条凋亡通路最终都激活ｃａｓｐａｓｅ，但
ｃａｓｐａｓｅ基因敲除实验表明细胞存在凋亡的代偿通
路［７－８］。细胞凋亡中信号分子间相互影响，构成了细
胞凋亡的环形通路—死亡环［９］。在这个死亡环里，
ｃａｓｐａｓｅｓ、Ｂｃｌ－２、细胞色素相互作用：细胞色素能激
活ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ，而有活性的ｃａｓｐａｓｅ也能刺激线粒
体释放细胞色素Ｃ。
研究发现，Ｂｃｌ－２家族及Ｃａｓｐａｓｅ家族在介导细胞
凋亡的线粒体通路中起着非常重要的作用［１０－１１］。部
分研究显示藤梨根能增强肺组织促凋亡细胞因子如
ｈｅｍｅ　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１、ｆｏｘｐ３，ＴＧＦ－β１等的表达，亦有报
道显示能下调Ｂｃｌ－２：Ｂａｘ　ｍＲＮＡ的转录率［１２－１３］。本
研究结果表明，藤梨根不同药物浓度１μｇ／ｍＬ、
１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ作用于Ｅｃａ－１０９细胞２４、４８、
·９７６·贵州医药２０１３年８月第３７卷第８期
７２ｈ后，有明显的凋亡特征。ＴＵＮＥＬ法检测可见不
同时期的凋亡细胞；免疫组化ＳＰ法检测Ｂａｘ及Ｂｃｌ－２
蛋白的表达，与对照组比较用药组Ｂａｘ蛋白表达增
强，Ｂｃｌ－２表达减弱；而同时伴有ｃａｓｐａｓｅ－３及ｃａｓｐａｓｅ－９
蛋白表达的明显增强。实验还显示，正丁醇药液对肿
瘤细胞生长的抑制作用高于乙酸乙酯药液。因此，我
们推测诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用
的机制之一，它可能通过线粒体通路发挥作用。研究
中我们也观察到ｃａｓｐａｓｅ－８的轻度增强，这说明细胞
凋亡并不完全是个线性通路，或者藤梨根同时启动了
几种途径诱导细胞凋亡。
本研究中，两种藤梨根制剂能诱导人食管癌
Ｅｃａ－１０９细胞凋亡中线粒体介导的内部凋亡通路中
的 上 游 关 键 酶 ｃａｓｐａｓｅ－９ 和 下 游 的 效 应 分 子
ｃａｓｐａｓｅ－３均被激活，而且ｃａｓｐａｓｅ－３的激活伴随
ｃａｓｐａｓｅ－９的活化。该结果不仅提供了藤梨根诱导
Ｅｃａ－１０９细胞凋亡作用的基础资料，而且为食管癌
的防治提供了新的线索。
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ＢＡＸ　ｉｎ　ＭＣＦ－７ｃｅｌｓ　ａｆｔｅｒ　ｅｘｐｏｓｕｒｅ　ｔｏ　ｂｉｎａｒｙ　ｍｉｘ－
ｔｕｒｅｓ［Ｊ］．Ｅｎｖｉｒｏｎ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ，２００７，１１５：１１２９．
（本文编辑　章　松）
·０８６· Ｇｕｉｚｈｏｕ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１３，Ｖｏｌ．３７，Ｎｏ．８