全 文 ：　文章编号:　1007-6611(2007)05-0413-04
藤梨根乙酸乙酯提取物对人食管癌细胞生长的抑制作用
曹书芬1 , 　国宏莉1 ,2 , 　张　丽1 , 　田　林1 , 　度长海1　(1 郧阳医学院附属人民医院病理科 , 　十堰　442000;
2 郧阳医学院病理学教研室)
摘要:　目的　观察藤梨根乙酸乙酯提取物对培养的人食管癌 Eca-109 细胞的生长抑制作用 , 探讨藤梨根对人食管癌细胞的
作用机制。 　方法　MT T 比色法检测藤梨根乙酸乙酯提取物在不同浓度(1 μg/ml , 10 μg/ml , 100μg/ ml)及不同时间(2 h , 48
h , 72 h)对 Eca-109 细胞生长抑制作用 , TUNEL 法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应 , 免疫组化 SP 法检测凋亡相关蛋白
Bax 及 Bcl-2 的表达。 　结果　①藤梨根乙酸乙酯提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作
用时间的延长而增强 , 其生长抑制率可达到 77.5%。 ②提取物对瘤细胞有明显的凋亡效应 , 而在对照组 , 未见有明显凋亡现
象。 ③提取物对瘤细胞作用 24 h , 48 h , 72 h后分别与对照组比较 ,用药组 Bax蛋白表达明显增强(P<0.01);同时伴有 Bcl-2
表达的减弱 , 在 72 h 后最明显 ,差异有显著意义(P<0.01)。 　结论　藤梨根乙酸乙酯提取物能有效抑制人食管癌 Eca-109
细胞生长。
关键词:　食管肿瘤;　藤梨根/猕猴桃根;　细胞凋亡
中图分类号:　R735.1　　　文献标识码:　A
Inhibitory effect of extracts from Actinidia arguta on human esophagus cell carcinoma
CAO Shu-fen , GUO Hong-li , ZHANG Li , et al (Dept of Pathology , People s Hospital , Yunyang Medical College , S hiyan
442000 , China)
Abstract:　Objective　To observe the inhibito ry effect of ex tracts from Actinidia arguta by ethy l ace tate on human carcinoma of
esophagus cells(Eca-109), and explo re its mechanism.　Methods　MTT colonmetric assay w as used to detect the g rowth inhibition
effects on Eca-109 cells in different concentrations of extracts from Actinidia arguta by ethyl ace tate(1 μg/ml , 10 μg/ ml , 100 μg/
ml)and at different times(24 h , 48 h , 72 h).TUNEL test w as performed to observe the apoptosis induced by the ex tracts (1 μg/
ml , 10 μg/ ml , 100 μg/ ml)on Eca-109 cells.The expression of Bax and Bcl-2 in tumor cells was measured by immunohistochemical
method(SP technique).　Results　①The inhibito ry effect of the ex tracts on Eca-109 cells increased w ith the increase of concentra-
tion and time , and the highest inhibition ra te was 77.5%.②The extracts could significantly induce apoptosis of Eca-109 cells , but
no t in control group.③Compared with control group , the expression of Bax in tumo r cells increased after 24 h , 48 h , 72 h(P <
0.01), but the expression of Bcl-2 decreased(P<0.01), particularly after 72 h.　Conclusion　The extracts f rom Actinidia arguta
by ethyl acetate have good inhibitory effect on Eca-109 cells.
Key words:　esophageal neoplasms;　Actinidia arguta;　apoptosis
　　食管癌是临床常见的恶性肿瘤之一。由于就
诊时大部分患者已处于食管癌的中晚期 ,故其临床
治疗效果并不令人满意 。近年研究发现 ,细胞凋亡
是机体维持正常生理活动所必需的 ,在许多疾病尤
其在肿瘤的发生 、发展及转归中起着重要作用 ,这
为肿瘤病人的治疗提供了新的思路 。藤梨根又称
阳桃根 ,为植物猕猴桃科藤梨(软枣猕猴桃)Act ini-
dia arguta(Sieb.te Zucc.)Planch.或猕猴桃 A .chi-
nensis Planch 的根。研究表明 ,藤梨根对多种肿瘤
细胞有生长抑制作用 ,采用不同方法所得的提取物
其抑制作用存在一定的差异[ 1 , 2] 。本课题观察藤梨
根对培养的人食管癌 Eca-109细胞生长的作用 ,以
探讨藤梨根对人食管癌细胞的作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料　人食管癌细胞 Eca-109细胞株购于上
海市中科院细胞库 , RPM I1640 培养基购于武汉天
源生物技术有限公司 , 为 Gibco 公司产品(货号
31800022);超级新生牛血清为杭州四季青生物工
程有限公司产品(批号 050126);实验用 1∶250 胰酶
购于武汉天源生物技术有限公司 ,为 Difco 公司产
品(批号 020411);四甲基偶氮唑蓝(MTT)购于武
汉天源生物技术有限公司 ,为 Duchefa 分装(货号
BS0880);二甲亚砜(DMSO)购于武汉天源生物技
术有限公司 ,为 Sigma公司产品 。TUNEL 试剂盒(
编号 ZK-8005)购于北京中杉生物技术有限公司 。
1.2　细胞培养　细胞在含 10%小牛血清的 RP-
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M I1640培养液中 ,37 ℃、5%CO2 条件下培养 , 24 h
换液一次。
1.3　药物制备　藤梨根采自十堰市武当山。将 1
kg粉碎成粗粉 , 烘干备用 。取藤梨根 500 g ,加入
3 000 ml乙酸乙酯中浸泡 12 h;回流提取 1 h ,过滤;
药渣再加 2 000 ml乙酸乙酯回流提取 1 h;合并两
次滤液 ,减压回收乙酸乙酯至稠膏状 ,真空干燥;干
燥品加蒸馏水 500 ml ,旋转加热溶解 ,制成饱和水
溶液;灭菌;原液(500 ml ,1 g/ml ,pH3.8)。将原液
稀释成 1 μg/ml , 10 μg/ml , 100 μg/ml三个药物浓
度;过滤;灭菌;分装 ,置 4 ℃冰箱备用 。
1.4　MTT 法　将贴壁细胞用 0.25%的胰蛋白酶
消化后计数 ,调整细胞浓度为 4×104/ml ,接种于 96
孔板 ,待 24 h细胞贴壁后加入藤梨根乙酸乙酯提取
物药液 。实验组分别加入终浓度为 1μg/ml ,10 μg/
ml ,100μg/ml 3个药物浓度的药液 ,对照组加入等
体积溶剂的培养液 ,每组 12复孔 ,分别于加药后第
1 , 2 ,3天测定各孔的吸光度值(A 值)。测定前每孔
加 5 mg/ml的 MTT 20μl ,温育 4 h ,弃上清液 ,加入
二甲基亚砜(DMSO)150 μl/孔 。同时振荡至结晶完
全溶解 ,用酶联免疫检测仪在 490 nm 波长下测定
A490值 。用各组的平均 A 值计算细胞生长抑制率。
生长抑制率=(对照组 A 值-实验组 A 值/对
照组 A 值)×100%。
1.5　TUNEL法检测凋亡细胞　将浓度为 4×104/
ml的 Eca-109 细胞接种于经多聚赖氨酸包被的清
净盖玻片上 ,用 RPM I1640培养基于 37 ℃、5%CO2
条件下在 24 孔板中培养 24 h 后取出盖玻片 , PBS
冲洗 3次 。0.1%Triton-100破膜 , 4%多聚甲醛固
定 ,H2O2 阻断。用 TdT(末端脱氧核糖核酸转移
酶)法将生物素标记的 d-U TP 在末端转移酶的作用
下 ,标记到 DNA 的 5′端缺口上 ,再用亲和素标记的
HRP 与之结合 ,然后加入底物 DAB 显色 ,苏木素复
染 ,从而使凋亡细胞核呈现棕褐色 ,未凋亡细胞核
呈蓝色。在光学显微镜下随机计数 5 个高倍视野
约 1 000个细胞中的凋亡细胞数 , 计算凋亡细胞所
占比例 。
1.6　免疫细胞化学SP 法及图像分析　将浓度为 4
×104/ml的Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被
的清净盖玻片上 ,用 RPM I1640 培养基于 37 ℃、
5%CO2 条件下在 24 孔板中培养 24 h 后取出盖玻
片 ,PBS冲洗 3次。0.1%Triton-100 破膜 ,4%多聚
甲醛固定 ,经 H2O2 阻断 。血清封闭后 ,滴加 50 μl
一抗(Bax 与 Bcl-2分别检测),PBS 代替一抗作阴性
对照 ,4 ℃冰箱过夜 。滴加生物素标记的二抗 ,PBS
冲洗 3次 。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白
素 ,DAB显色 。苏木素复染 ,盐酸分化 ,氨水返蓝 ,
中性树胶封片 。采用 Motic 6.0图像分析系统检测
其灰度值 。
1.7　统计学分析　计量资料用 x ±s表示 ,各组样
本均数间比较采用 SPSS10.0 统计分析软件包行 t
检验 。以 α=0.05为检验水准 , P <0.05为差别有
统计学意义 , P >0.05为差别无显著性。
2　结果
2.1　MT T 法检测生长抑制率　结果表明藤梨根
乙酸乙酯提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑
制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而
增强。当用 100 μg/ml的药物作用 72 h 时 , 可使
77.5%以上的细胞生长受到抑制(表 1)。
表 1　　藤梨根乙酸乙酯提取物对Eca-109细胞的生长抑制
率　(%)
Tab 1　　The inhibition rates of the extract from Actinidia
arguta by ethyl acetate on Eca-109 cells　(%)
分组 24 h 48 h 72 h
1 μg/ ml 15.9 26.5 39.8
10 μg/ml 21.4 36.1 58.6
100 μg/ ml 28.7 54.3 77.5
对照组 0 0 0
2.2　TUNEL 法检测细胞凋亡　当用 1 μg/ml藤
梨根乙酸乙酯提取物处理 Eca-109细胞 24 h时 ,可
检测到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞;当药物
作用时间延长至 72 h时 ,可见凋亡细胞(棕褐色)变
圆 ,体积明显缩小 ,核染色质浓缩 ,变成新月形 ,此
为晚期凋亡细胞 ,随时间的推移 ,凋亡细胞比例逐
渐增加(图 1 ,图 2 ,见封 3)。而对照组 ,未见有明显
凋亡现象(图 3 ,见封 3)。
2.3　免疫组化 SP 法检测 Bax 及 Bcl-2蛋白的表达
　Motic 6.0图像分析系统灰度值分析结果显示 ,提
取物对肿瘤细胞作用 24 h ,48 h ,72 h后分别与对照
组比较 ,用药组 Bax 蛋白表达明显增强(P <0.01);
同时伴有 Bcl-2表达的变化 ,24 h 后开始减弱 , 48 h
后表达量与对照组比较 , 差异有显著意义(P <
0.05),72 h后降低最为明显(P <0.01),见表 2及
图 4 ,5(见封 3)。
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表 2　　Bax及 Bcl-2在 Eca-109 细胞的胞质表达
Tab 2　　The expression of Bax and Bcl-2 in cytoplasma in Eca-109 cells
分组 Bax
24 h 48 h 72 h
Bcl-2
24 h 48 h 72 h
Bax乙酸乙酯组　1μg/ml 153.43±8.42＊＊ 179.44±10.23＊＊ 192.88±8.53＊＊ 　128.43±6.42 　123.44±5.23 116.88±5.53＊＊
10 μg/ ml 154.21±8.56＊＊ 183.76±9.14＊＊ 194.07±9.35＊＊ 127.21±4.56 119.76±3.94＊ 114.07±3.35＊＊
100μg/ml 161.22±9.01＊＊ 191.64±9.56＊＊ 196.92±9.61＊＊ 125.22±4.11 112.64±4.56＊ 109.92±4.61＊＊
对照组　0μg/ml 125.43±5.42 125.89±6.23 126.88±8.53 123.43±6.13 125.44±7.53 126.88±5.57
　　与对照组比较 , ＊P<0.05 , ＊＊P <0.01
3　讨论
肿瘤是危及人类生命的首要顽疾 ,药物治疗为
中西医肿瘤治疗中的一个重要模式 ,包括化学药物
和天然药物。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的
肯定 ,其机制有多方面 ,如抑制 DNA 合成 、抑制肿
瘤血管形成 、诱导细胞分化 、促进细胞凋亡 、调节机
体免疫功能 、抑制蛋白酪氨酸激酶(protein ty rosine
kinase , PTK)活性等[ 3-6] 。目前 ,关于藤梨根的研
究已有报道 ,其对消化系统肿瘤有抗肿瘤作用 ,但
其抗肿瘤作用机制还不清楚 。
研究发现 ,同种猕猴桃根不同提取方法所得的
提取物其抗肿瘤作用可能不尽相同 。有学者用甲
醇 、水 、乙酸乙酯 、正丁醇等溶剂回流提取 , 观察提
取物对同种肝癌细胞株的作用 , 结果表明正丁醇 、
乙酸乙酯提取物对瘤细胞的生长有良好的抑制作
用 , 但各组量效关系不明显[ 2] 。关于藤梨根提取物
中抗肿瘤作用的成分 ,曾有人报道主要为三萜类化
合物 ,分别为乙酸乙酯提取物熊果酸 、β -谷甾醇及
正丁醇提取物 2α,3α, 24-三羟基-12-烯-28-
乌苏酸 、2β ,3β ,23-三羟基-12-烯-28-乌苏酸 、
24-hydroxytormentric acid[ 7] 。
研究表明 ,藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑
制作用 。钟振国等[ 8]采用 MTT 比色法 、集落形成
法等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株 Hela、神经
肿瘤细胞株 NG108-15 、胃癌细胞株 SGC7901等进
行了研究 ,结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不
同程度的抑制作用。李昊等[ 9]研究了藤梨根对人
胃低分化腺癌 BGC-823细胞的作用 ,发现其浓度在
1.3 mg/ml时抑瘤率最强(88.19%),随着药物浓度
的降低 ,抑瘤率随之下降;藤梨根对胃癌细胞作用
24 h抑制作用最强(87.61%),48 h回落 , 72 h再次
上升 , 其对胃癌细胞有明显杀伤作用 。卫培峰
等[ 10]在动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌
细胞的凋亡 ,与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显
著的差异 。
近几年来 ,国内外对细胞间隙连接通讯与癌变
的关系进行了大量的研究 ,发现多数肿瘤细胞无此
功能 ,其间隙连接少或无 ,而邻近的正常组织或良
性肿瘤的间隙连接正常 ,少数肿瘤细胞有脆弱的连
接通讯 ,但很容易受到破坏 ,其间隙连接数量很少 ,
藤梨根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑
制某些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长[ 11] 。
本研究结果揭示:藤梨根乙酸乙酯提取物三个
药物浓度 1 μg/ml , 10 μg/ml , 100 μg/ml 作用于
Eca-109细胞 24 h ,48 h , 72 h 后 ,有明显的凋亡特
征。TUNEL 法检测可见不同时期的凋亡细胞;免
疫组化SP 法检测 Bax 及 Bcl-2蛋白的表达 ,与对照
组比较 ,用药组 Bax 蛋白表达增强 ,Bcl-2表达减弱。
因此我们推测 ,诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗
肿瘤作用的机制之一。但细胞凋亡的调控及信号
传导极其复杂 ,有多种分子参与。肿瘤细胞胞质内
Bax 蛋白的高表达 ,可能直接刺激一些细胞器比如
线粒体 ,使其渗透压失衡基质发生肿胀或产生其他
变化 ,引起外膜损伤 , 释放细胞色素 C(Cyto C)等
Caspase激活蛋白。Cy to C 则可和凋亡蛋白酶激活
因子(apoptotic protease activating facto r , Apaf-1)
结合并使之活化 ,而触发 Caspase级联反应 ,引起细
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　文章编号:　1007-6611(2007)05-0416-03
不同日龄视网膜变性大鼠眼底组织结构学观察
彭　清1 , 　顾国贞2 , 　邓明辉1 , 　任佩贤1　(1 山西医科大学第一临床医学院眼科 , 　太原　030001;　2 吉林大学再
生医学研究所)
摘要:　目的　探究转基因视网膜退行性变性 S334ter-line-3 大鼠在出生后不同日龄视网膜组织结构学变化。 　方法　选择
出生后 1 , 9 , 11 , 18 , 30 , 59 d 的 S334ter-line-3大鼠 , 断颈或腹腔注射过量麻药后处死大鼠 , 摘除双眼球 ,置入眼球混合固定液及
福尔马林液中 , 左眼行常规石腊包埋 ,右眼行 Histocry l plastic包埋 ,HE 染色 ,光学显微镜下观察不同时点视网膜组织学结构。
　结果　出生后第 1 天 , S334ter-line-3 大鼠视网膜是一种未发育完善的胚胎型组织 ,仅有 RPE细胞层 、祖细胞层 , 短的内丛状
层和神经节细胞层;第 9 天时其视网膜发育才较完善。第 11 天时视网膜感光细胞层即开始发生退行性变性 , 其外核层内可
见深染皱缩的凋亡细胞核;第 18 天时感光细胞层内外节几乎完全消失 , 外核层变薄 , 胞核数仅为正常 1/2;第 30 天时 ,
S334ter-line-3大鼠视网膜外层退行性变性已基本完成 ,仅残留 1排感光细胞核层 , 其外接 RPE细胞层 ,内接视网膜内核层;第
59 天视网膜结构与第 30 天基本相同。 　结论　S334ter-line-3 大鼠在出生后随年龄的增长 , 视网膜外层逐渐发生退行性变
性 , 至出生后第 30 d时这种退行性变性基本完成 ,故出生后 30 d 的大鼠适合作为视网膜移植中的移植受体 。
关键词:　视网膜变性;　大鼠;　组织学结构
中图分类号:　R774.13　　　文献标识码:　A
Histological changes of retina in rats of retinal degeneration at dif ferent postnatal days
PENG Qing , GU Guo-zhen , DENG Ming-hui , et al(Dept of Ophthalmology , First Clinical Medical College , Shanx i Medical U-
niversity , Taiyuan 030001 , China)
Abstract:　Objective　To observe the histolog ical changes of retina in S334ter-line-3 rats at different postnatal day s.　Methods　
Rats were injected over-dose sodium barbiturate or cut neck at postnatal days 1 , 9 , 11 , 18 , 30 and 59.The eyes were taken off and
placed to eye mixed fixation first , and then moved to 10% formarlin.The samples were embedded after 24 h with paraffin o r his-
tocry l plastic, and then were stained w ith HE.Histological structures o f re tina with different day-age were observed under the light
microscope.Results　There were multi-layers ganglion cell layers(GCL), short inner plexifo rm layer(IPL)and the mostly undiffer-
entiated neuroblastic outer lay er(NBL)in retinas of S334ter-line-3 rats at postnatal day 1.Re tinas had not developed well until at
postnatal day 9.There w ere many degenerating rod photoreceptors with deeper and smaller nuclei at outer nuclear layer(ONL)in
胞发生程序性死亡即凋亡。故抗肿瘤作用的真正机
制及体内抑瘤实验需进一步深入研究 。
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作者简介:　曹书芬 ,女 , 1968-10 生 ,本科 ,主管技师.
[ 收稿日期:　2006-11-27]
·416· 　山西医科大学学报 (J Shanxi Med Univ)2007 年 5 月 , 38 (5)