全 文 ： 药理
藤梨根提取物对人食管癌细胞生长抑制作用的研究
张　丽 1 ,国宏莉 1, 2* ,田　林1 ,曹书芬 1 ,度长海 1
(1.郧阳医学院附属人民医院病理科 ,湖北士堰;2.郧阳医学院病理学教研室 ,湖北十堰 442000)
　　摘要　观察藤梨根正丁醇提取物对培养的人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制作用 , 探讨藤梨根对人食管癌细
胞的作用机制。方法:MTT比色法检测藤莉根正丁醇提取物在不同浓度(1 μg /m l、 10 μg /m l、 100 μg /m l)及不同时
间(24 h、48 h、72 h)对 E ca-109细胞生长抑制作用 , TUNEL法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应。结果:藤梨根
正丁醇提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强 ,其生长抑
制率可达到 87.2%。同时 , 提取物对瘤细胞有明显的凋亡效应 , 而在对照组 , 未见有明显凋亡现象。结论:藤梨根
正丁醇提取物能有效抑制人食管癌 E ca-109细胞生长。
关键词　藤梨根 /猕猴桃根;食管肿瘤;凋亡
中图分类号:285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2007)05-0564-03
Study of Inh ibitory Effect ofExtracts from Actin idia arguta
on Human Carc inom a ofEsophagus Ce lls
ZHANG L i1 , GUO H ong-li1 , 2 , T IAN L in1 , CAO Shu-fen1 , DU Chang-hai1
(1.Dep t o f Patho logy, YunyangM ed ica lC ollegeA ffiliated Peop le’ sH osp ital, Sh iyan 442000, Ch ina;2.Dept o f Pa tho logy, Yun yang
M edica l College, Shiyan 442000, China)
Abstrac t　Objective:To study the inh ibitory effect o f ex trac ts from Actinid ia arguta by n-bu ty l alcoho l on hum an carcinom a of
e sophagus ce lls(Eca-109) and Its mechanism. Me thods:M TT co lonm e tric assay was used to exam ine the g row th inhib itory o f concen-
tration-effect(1 μg /m l, 10 μg /m l, 100 μg /m l) and tim e-effe ct(24 h, 48 h, 72 h) o f ex tracts from Actinidia arguta by n-bu ty l alcoho l
on Eca-109 ce lls. TUNEL te st w ere perform ed to observe the apop to sis induced by the extracts (1 μg /m l, 10 μg /m l, 100 μg /m l) on
Eca-109 cells. Re su lts:The inhib itory effect of the ex tracts on Eca-109 ce lls inc reased in a dose-tim eM anne r and the highe st rate of
inhibition w as 87. 2%. The ex trac ts cou ld significantly induce apopto sis of Eca-109 cells, bu t in con tro l g roup, apopto sis wasn’ t
obse rved. Conc lusion:The ex trac ts from Actinid ia arguta by n-buty l alcoho l have good inh ib itory effec t on E ca-109 ce lls.
K ey words　Actinidia arguta;Esophague tum o r;Apopto sis
作者简介:张丽(1962 -),女 ,副主任医师 ,研究方向为肿瘤病理学。 Te l:0719-8637286。*通讯作者:国宏莉 , E-m ai l:hongloolool@21 cn. com。
　　食管癌是临床常见的恶性肿瘤之一。由于就诊
时大部分患者已处于食管癌的中晚期 ,故其临床治
疗效果并不令人满意 。近年研究发现 ,细胞凋亡是
机体维持正常生理活动所必需的 ,在许多疾病尤其
在肿瘤的发生 、发展及转归中起着重要作用 ,这为肿
瘤病人的治疗提供了新的思路。藤梨根又称阳桃
根 ,为植物猕猴桃科藤梨 (软枣猕猴桃)Actinid ia ar-
guta(Sieb. te Zucc. )Planch或猕猴桃 A. ch inensis
P lanch的根。研究表明 ,藤梨根对多种肿瘤细胞有
生长抑制作用 ,采用不同方法所得的提取物其抑制
作用存在一定的差异〔1、2〕。本课题观察藤梨根对培
养的人食管癌 Eca-109细胞生长的作用 ,以探讨藤
梨根对人食管癌细胞的作用机制。
1　材料与方法
1.1　材料　人食管癌细胞 Eca-109细胞株购于上
海市中科院细胞库 , RPM I-1640培养基购于武汉天
源生物技术有限公司 , 为 G ibco公司产品 (货号
31800-022);超级新生牛血清为杭州四季青生物工
程有限公司产品(批号 050126);实验用 1∶250胰酶
购于武汉天源生物技术有限公司 ,为 D ifco公司产
品(批号 020411);四甲基偶氮唑蓝 (MTT)购于武汉
天源生物技术有限公司 , 为 Duchefa分装 (货号
BS0880);二甲亚砜(DMSO)购于武汉天源生物技术
有限公司 ,为 S igma公司产品 。 TUNEL试剂盒 (编
号 ZK-8005)购于北京中杉生物技术有限公司 。
1.2　细胞培养　细胞在含 10%小牛血清的 RP-
M I1640培养液中 , 37℃、5%CO2条件下培养 , 24 h
换液一次 。
1.3　药物制备　藤梨根采自湖北省十堰市武当
山。将 1 kg粉碎成粗粉 ,烘干备用 。取藤梨根 500
g,加入 3000 m l正丁醇中浸泡 12 h;回流提取 1 h,
过滤;药渣再加 2000 m l正丁醇回流提取 1 h;合并
564 中药材　Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 5期 2007年 5月DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牱牣牥牭牣牥牪牬
两次滤液 ,减压回收正丁醇至稠膏状 ,真空干燥;干
燥品加蒸馏水 500m l,旋转加热溶解 ,制成饱和水溶
液;灭菌;原液 (500 m l, 1 g /m l, pH =3.8)。将原液
稀释成 1 μg /m l、10 μg /m l、100 μg /m l三个药物浓
度;过滤;灭菌;分装 ,置 4℃冰箱备用。
1.4　MTT法　将贴壁细胞用 0.25%的胰蛋白酶
消化后计数 ,调整细胞浓度为 4×104 /m l,接种于 96
孔板 ,待 24 h细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇提取物
药液。实验组分别加入终浓度为 1 μg /m l、10 μg /
m l、100 μg /m l 3个药物浓度的药液 ,对照组加入等
体积溶剂的培养液 ,每组 12复孔 ,分别于加药后第
1、2、3 d测定各孔的吸光度值 (A值)。测定前每孔
加 5 mg /m l的 MTT20 μl,温育 4 h,弃上清液 ,加入
二甲基亚砜 (DMSO)150μl /孔 ,同时振荡至结晶完
全溶解 ,用酶联免疫检测仪在 490 nm 波长下测定
A 490值 。用各组的平均 A值计算细胞生长抑制率。
生长抑制率 =(对照组 A值 -实验组 A值 /对照组 A
值)×100%
1.5　 TUNEL法检测凋亡细胞　将浓度为 4×104 /
m l的 Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的洁净
盖玻片上 ,用 RPM I1640培养基于 37℃、5%CO2条
件下在 24孔板中培养 24h后取出盖玻片 , PBS冲洗
3次。 0.1%Triton-100破膜 、 40%多聚甲醛固定 ,
H2O2阻断。用 TDT法将生物素标记的 d-UTP在末
端转移酶的作用下 ,标记到 DNA的 5′端缺口上 ,再
用亲和素标记的 HRP与之结合 ,然后加入底物 DAB
显色 ,苏木素复染 ,从而使凋亡细胞核呈现棕褐色 ,
未凋亡细胞核呈蓝色 。在光学显微镜下随机计数 5
个高倍视野约 1000个细胞中的凋亡细胞数 ,计算凋
亡细胞所占比例 。
2　结果
2.1　MTT法检测生长抑制率　结果表明藤梨根正
丁醇提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制作
用随着药物浓度的升高和作用的延长而增强 。用 1
μg /m l的正丁醇提取物作用 24 h,细胞生长抑制率
为 18.5%;当延长至 72 h 时 , 抑制率上升至
45.3%;而 100 μg /m l的药物作用 72 h时 , 可使
85%以上的细胞生长受到抑制(见表 1及图 1)。
　表 1　　　　藤梨根正丁醇提取物对 Eca-109
细胞的生长抑制率(%)
分组 24 h 48 h 72 h
1 μg /m l 18.5 36.2 45.3
10μg /m l 24.5 46.7 66.4
100 μg /m l 36.2 58.7 87.2
对照组 0 0 0
图 1　藤梨根正丁醇提取物对 Eca-109
细胞的生长抑制作用
图 2　TUNEL法检测凋亡细胞比例(实验组)
图 3　TUNEL法检测 Eca-109细胞凋亡现象 ×200
A.实验组　B.对照组
565 中药材　Journa l o f Chine seM ed icina lM a teria ls　　第 30卷第 5期 2007年 5月
2.2　 TUNEL法检测验细胞凋亡　当用 1μg /m l藤
梨根正丁醇提取物处理 Eca-109细胞 24 h ,可检测
到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞;当药物作用
时间延长至 72 h时 ,可见凋亡细胞变圆 ,体积明显
缩小 ,核染色质浓缩 ,变成新月形 ,此为晚期凋亡细
胞 ,随时间的推移 ,凋亡细胞比例逐渐增加 。而对照
组 ,未见有明显凋亡现象(见图 2、3)。
3　讨论
中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯定 ,其机
制有多方面 ,如抑制 DNA合成 、抑制肿瘤血管形成 、
诱导细胞分化 、促进细胞凋亡 、调节机体免疫功能 、
抑制蛋白酪氨酸激酶(pro te in tyrosine kinase, PTK)
活性等 〔3 ～ 6〕。
藤梨根产于陕西 、河南 、浙江 、福建 、湖北 、湖南 、
江西 、广东 、广西 、贵州 、云南 、四川等地。全株含猕
猴桃碱 (ac tinidine),根含熊果酸 (u rso lic acid)、齐墩
果酸(o leanolic acid)、琥珀酸 (succinic acid)、胡萝卜
甙 (dauco sterol)以及精氨酸 、赖氨酸 、亮氨酸 、丙氨
酸 、天门冬氨酸等 ,并富含 Fe、Cu、Mn、Se等元素 。
其性苦 ,寒 ,归肺 、肝 、胃 、脾 、大肠经 ,有败毒抗癌 、清
热消肿的作用 ,可用于消化系统肿瘤的治疗〔1〕。
关于藤梨根提取物中抗肿瘤作用的成分 ,曾有
人报道主要为三萜类化合物 ,分别为乙酸乙酯提取
物熊果酸 、β-谷甾醇及正丁醇提取物 2α, 3α, 24-三
羟基-12-烯-28-乌苏酸 、2β , 3β , 23-三羟基-12-烯-28-
乌苏酸 、24-hydroxy tormentric acid〔7〕。研究表明 ,藤
梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑制作用。钟振
国 〔8〕等采用 MTT比色法 、集落形成法等方法对藤梨
根作用的宫颈癌细胞株 Hela、神经肿瘤细胞株
NG108-15、胃癌细胞株 SGC7901等进行了研究 ,结
果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同程度的抑制
作用。李昊 〔9〕等研究了藤梨根对人胃低分化腺癌
BGC-823细胞的作用 ,发现其浓度在 1.3 mg /m l时
抑瘤率最强 (88.19%),随着药物浓度的降低 ,抑瘤
率随之下降;藤梨根对胃癌细胞作用 24 h抑制作用
最强(87.61%), 48 h回落 , 72 h再次上升 ,其对胃
癌细胞有明显杀伤作用 。卫培峰 〔10〕等在动物实验
中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞的凋亡 ,与对
照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的差异 。
近几年来 ,国内外对细胞间隙连接通讯与癌变
的关系进行了大量的研究 ,发现多数肿瘤细胞无此
功能 ,其间隙连接少或无 ,而邻近的正常组织或良性
肿瘤的间隙则连接正常。少数肿瘤细胞有脆弱的连
接通讯 ,但很容易受到破坏 ,藤梨根可以通过上调细
胞间隙连接通讯功能来抑制某些肿瘤细胞如高转移
性人肺癌细胞的生长〔11〕。
综上所述 ,藤梨根可从抑制细胞生长 、诱导细胞
凋亡 、增强细胞间通讯连接等多方面来达到抗肿瘤
的作用。而本研究结果证实:藤梨根正丁醇提取物
三个药物浓度 1 μg /m l、10 μg /m l、100 μg /m l作用
于 Eca-109细胞 24 h、48 h、72 h后 ,显示出明显的
凋亡特征 。 TUNEL法检测可见不同时期的凋亡细
胞;而 MTT法则直接检测到其对生长的抑制作用。
可见 ,诱导肿瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用
的机制之一。由于细胞凋亡的信号传导途径极其复
杂 , Fal /FasL、Caspase8、Caspase9、FADD等多种分子
结构都参与了该过程 ,尽管目前我们的体外实验证
明藤梨根正丁醇提取物对食管癌细胞有抑制生长 、
诱导凋亡的作用 ,但其抗肿瘤作用的真正机理需进
一步深入研究 。
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(2006 - 10 -17收稿)
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