全 文 ：藤梨根诱导人食管癌 Eca-109 细胞凋亡的调节机制
国宏莉 李江华 李 斌 度长海 张 丽
基金项目:湖北医药学院研究生启动基金项目( 2006QDJ03)
作者单位: 442000 湖北医药学院附属人民医院病理科( 国宏莉，李
斌，度长海，张 丽) ; 442000 湖北医药学院病理教研室 ( 国宏莉，李
斌) ; 442000 湖北医药学院附属太和医院显微整形外科( 李江华)
通讯作者: 李江华
【摘要】 目的 研究藤梨根( Actinidia arguta) 抑制人食管癌 Eca-109 细胞增殖和诱导凋亡的机制。方法 采用
MTT比色法，检测藤梨根正丁醇药液在不同浓度( 1 μg /ml、10 μg /ml、100 μg /ml等) 及不同时间( 24 h、48 h、72 h 等) 对
Eca-109 细胞生长抑制作用; 采用免疫组化 SP法，检测凋亡相关蛋白 Bax 、Bcl-2 及 Caspase的表达。结果 藤梨根正丁
醇药液对人食管癌 Eca-109 细胞的生长抑制作用，随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强，其生长抑制率可达
87． 2%。瘤细胞作用 24 h﹑ 48 h﹑ 72 h后分别与对照组比较，用药组 Bax蛋白表达明显增强( P ＜ 0． 01) ;同时伴有 Bcl-
2 表达减弱，72 h后最明显，差异有显著意义( P ＜ 0． 01) 。藤梨根正丁醇药液促进 Caspase-3、Caspase-9 表达明显增强，而
对 Caspase-8 表达影响较小。结论 藤梨根可通过下调 Bcl-2 表达，激活 Caspase-9、Caspase-3 诱导 Eca-109 细胞凋亡。
【关键词】 藤梨根 /猕猴桃根;食管肿瘤; 凋亡; Caspase激活
中图分类号: R735． 1 文献标识码: A 文章编号: 1001-5930( 2011) 02-0120-04
Regulatory Mechanisms of Apoptosis of Actinidia Arguta on Human
Carcinoma of Esophagus Eca-109 Cells
GUO Hong-li，LI Jiang-hua，LI Bin，et al． Dept of Pathology ，Attached People＇s Hospital ，Hubei University of Medicine，Shiyan，
442000
【Abstract】 Objective To study the mechanism of Actinidia arguta on the proliferation and apoptosis induction in human
carcinoma of esophagus Eca-109 cells．Methods MTT colonmetric assay was used to examine the growth inhibition of concentra-
tion-effect( 1 μg /ml、10 μg /ml、100 μg /ml) and time-effect ( 24 h﹑ 48 h﹑ 72 h) of extracts from Actinidia arguta by n-butyl
alcohol on Eca-109 cells，the level of expression Bax、Bcl-2 and Caspase in tumor cells were measured by immunohistochemical
method( SP technique) ． Results The inhibitory effect of the extracts on Eca-109 cells increased step by step to concentration
and time，the highest rate of inhibition was 87． 2% ． Compared with control group，the level of expression Bax in tumor cells in-
creased ( P ＜ 0． 01) ，but the level of expression of Bcl-2 decreased after 24 h﹑ 48 h and 72 h( P ＜ 0． 01) ，particularly after 72h．
The expressions of Caspase-3 and Caspase-9 significantly enhanced by Actinidia arguta，but Little effect on Caspase-8． Conclu-
sion Actinidia arguta may induces apoptotic Eca-109 cells death through suppressing bcl-2 and then activating Caspase-9 and
Caspase-3．
【Key words】 Tengligen /actinidia arguta; Carcinoma of esophagus; Apoptosis; Caspase activation
( The Practical Journal of Cancer，2011，26: 120 ～ 123)
藤梨根又称阳桃根，为植物猕猴桃科藤梨 ( 软枣
猕猴桃) Actinidia arguta ( Sieb． teZucc． ) Planch 或猕猴
Achinensis Planch 的根。近年来，藤梨根的抗肿瘤作
用引起了国内外部分学者的关注，并在构效分析研究
的指导下获得了许多肿瘤细胞毒活性明显提高的衍生
物［1 ～ 3］。因此，了解藤梨根抗肿瘤作用的机制对于评
价藤梨根及其衍生物作为抗肿瘤药物开发的潜力和指
导衍生物的合成具有重要意义。我们前期研究表明藤
梨根能明显抑制人食管癌 Eca-109 细胞的生长，并能
诱导细胞凋亡［4］。但细胞凋亡的机制尚不清楚，这引
起了我们极大的兴趣。本研究中，我们将对藤梨根诱
导人食管癌 Eca-109 细胞凋亡，凋亡与 Bax、Bcl-2 蛋白
表达及 Caspase活化的关系进行探讨。
1 材料与方法
1． 1 细胞株与细胞培养
人食管癌细胞 Eca-109 细胞株购于上海市中科院
细胞库，细胞在含 10%小牛血清的 RPMI 1640 培养液
中，37℃、5%CO2 条件下培养，24 h换液 1 次。
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1． 2 试剂和仪器
RPMI-1640 培养基购于武汉天源生物技术有限公
司，为 Gibco公司产品( 货号 31800-022 ) ; 超级新生牛
血清为杭州四季青生物工程有限公司产品 ( 批号
050126) ; 实验用 1∶ 250 胰酶购于武汉天源生物技术
有限公司，为 Difco公司产品( 批号 020411) ;四甲基偶
氮唑蓝( MTT) 购于武汉天源生物技术有限公司，为
Duchefa分装( 货号 BS0880 ) ; 二甲亚砜( DMSO) 购于
武汉天源生物技术有限公司，为 Sigma 公司产品。
Bax、Bcl-2 及 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 相关蛋白
均购于福州迈新生物技术有限公司。藤梨根正丁醇药
液( 以下简称藤梨根) 由湖北医药学院药学部新药研
制中心提供 ( 500 ml，1 g /ml，pH =3． 8) ，使用时用 RP-
MI 1640 培养基稀释到 1 μg /ml、10 μg /ml、100 μg /ml
等药物浓度。酶标仪 ( 美国 Biotech 公司 Powerwave
型) ; CO2 培养箱 ( 德国 Binder CB150 型) ; 数码相机
( 日本尼康 coolpix 4500 型) ; Motic 6． 0 1 000 高清晰度
彩色病理图像分析系统( 厦门麦克奥迪有限公司) 。
1． 3 MTT法
将贴壁细胞用 0． 25%的胰蛋白酶消化后计数，调
整细胞浓度为 4 × 104 个 /ml，接种于 96 孔板，待 24 h
细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇药液。实验组分别加入
终浓度为 1 μg /ml、10 μg /ml、100 μg /ml 等药物浓度
的药液，对照组加入等体积溶剂的培养液，每组 12 复
孔，分别于加药后第 1、2、3 d 等时间后测定各孔的吸
光度值 ( A 值 ) 。测定前每孔加 5 mg /ml 的 MTT
20 μl，温育 4 h，弃上清液，加入二甲基亚砜 ( DMSO)
150 μl /孔。同时振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫检
测仪在 490 nm 波长下测定 A490值。用各组的平均 A
值计算细胞生长抑制率。
生长抑制率 =
对照组 A490 －实验组 A490
对照组 A490
× 100%
1． 4 免疫细胞化学 SP法及图像分析
将浓度为 4 × 104 个 /ml的 Eca-109 细胞接种于经
多聚赖氨酸包被的清净盖玻片上，用 RPMI 1640 培养
基于 37℃、5% CO2 条件下，在 24 孔板中培养 24 h 后
取出盖玻片，PBS 冲洗 3 次。0． 1% Triton-100 破膜﹑
4%多聚甲醛固定，经 H2O2 阻断﹑血清封闭后，滴加
50 μl 一抗，PBS 代替一抗作好阴性对照，4℃冰箱过
夜。滴加生物素标记的二抗，PBS 冲洗 3 次。滴加辣
根过氧化物酶标记的链霉卵白素，DAB 显色。苏木精
复染，盐酸分化，氨水返蓝，中性树胶封片。结果判断:
每张细胞爬片随机选取 5 个不同部位，显微镜下拍照，
用 Motic 6． 0 高清晰度彩色病理图像分析系统对阳性
细胞进行分析，测定阳性细胞的灰度值或光密度值。
1． 5 统计学分析
计量资料用均数 ±标准差( 珋x ± s) 表示，各组样本
均数间比较采用 SPSS10． 0 统计分析软件包行 t检验。
2 结果
2． 1 藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞生长的影响
藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞生长的影响见图
1。结果显示，当用 1 μg /ml 的正丁醇提取物作用
24 h，细胞生长抑制率为 18． 5% ;当延长至 72 h 时，抑
制率上升至 45． 3% ;而用 100 μg /ml的药物作用 72 h
时，可使 85%以上的细胞生长受到抑制。结果表明，
藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞的生长抑制作用，随
着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。
图 1 藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞生长抑制作用
2． 2 藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞 Bax 及 Bcl-2 表
达的影响
藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞 Bax 及 Bcl-2 表
达的影响见图 2、3。结果显示，藤梨根对肿瘤细胞作
用 24 ﹑ 48 ﹑ 72 h 后分别与对照组比较，用药组 Bax
蛋白表达明显增强( P ＜ 0． 01) ，同时伴 Bcl-2 表达的改
变;空白对照组细胞 Bcl-2 蛋白表达水平最高即平均
灰度值最小，胞质着色的细胞数最多且呈深棕色。用
药 24 h后 Bcl-2 蛋白表达开始减弱，48 h 后其表达量
与对照组比较，差异有显著意义( P ＜ 0． 05) ，72 h 后降
低更为明显( P ＜ 0． 01) 。
2． 3 藤梨根对 Eca-109 细胞 Caspase-3、Caspase-8、
Caspase-9 表达的影响
藤梨根对 Eca-109 细胞 Caspase-3、Caspase-8、
Caspase-9 表达的影响见表 1。结果显示，用 1 μg /ml
藤梨根对肿瘤细胞作用24 h时，Caspase-8表达未见
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明显改变，Caspase-3、Caspase-9 表达稍增强; 作用 48
﹑ 72 h 后，用药组 Caspase-3、Caspase-9 表达逐渐增
强。100 μg /ml 藤梨根作用 72 h 时，两组 Caspase-3、
Caspase-9 表达均明显增强( P ＜ 0． 01) 。
图 2 藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞 Bax蛋白表达的作用
图 3 藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞 Bcl-2 蛋白表达的作用
表 1 藤梨根对人食管癌 Eca-109 细胞 Caspase-8、Caspase-9 及
Caspase-12 蛋白表达的作用( 光密度，珋x ± s)
基因 24 h 48 h 72 h
Caspase-8
1 μg /ml 0． 100 ± 0． 015 0． 112 ± 0． 011 0． 121 ± 0． 014
10 μg /ml 0． 114 ± 0． 013 0． 125 ± 0． 016 0． 126 ± 0． 011
100 μg /ml 0． 115 ± 0． 007 0． 125 ± 0． 017 0． 138 ± 0． 020*
空白对照 0． 106 ± 0． 013 0． 116 ± 0． 012 0． 121 ± 0． 015
Caspase-9
1 μg /ml 0． 114 ± 0． 013* 0． 134 ± 0． 021* 0． 151 ± 0． 013*
10 μg /ml 0． 145 ± 0． 015* 0． 172 ± 0． 016* 0． 197 ± 0． 009*
100 μg /ml 0． 167 ± 0． 010* 0． 201 ± 0． 012* 0． 228 ± 0． 017*
空白对照 0． 100 ± 0． 011 0． 112 ± 0． 013 0． 120 ± 0． 016
Caspase-3
1 μg /ml 0． 104 ± 0． 009 0． 125 ± 0． 011* 0． 146 ± 0． 015*
10 μg /ml 0． 111 ± 0． 013 0． 135 ± 0． 020* 0． 187 ± 0． 020*
100 μg /ml 0． 115 ± 0． 017 0． 152 ± 0． 017* 0． 217 ± 0． 014*
空白对照 0． 105 ± 0． 010 0． 115 ± 0． 021 0． 122 ± 0． 018
与对照组比较* 为 P ＜ 0． 05;＊＊为 P ＜ 0． 01
3 讨论
细胞凋亡是由基因编码控制的 1 种细胞的程序性
死亡，是机体维持正常生理活动所必需的。近年发现，
肿瘤的发生、发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞凋亡
有关。凋亡基因精确调控凋亡过程。目前认为至少有
3 条通路参与凋亡的发生即传统信号传导通路、死亡
受体通路( death receptor pathway) 和线粒体通路( mi-
tochondrial pathway) 通路，各条通路间又有串话 ( cross
talking) ，共同促进细胞凋亡。3 条凋亡通路最终都激
活 Caspase，但 Caspase基因敲除实验表明细胞存在凋
亡的代偿通路［5，6］。
近年来，研究发现 Bcl-2 家族及 Caspase 家族在介
导细胞凋亡的线粒体通路中起着非常重要的作
用［7 ～ 9］。部分研究显示藤梨根能增强肺组织促凋亡细
胞因子如 heme oxygenase-1、foxp3，TGF-β1 等的表达，
亦有报道显示能下调 BCL-2: BAX mRNA 的转录
率［10，11］。本研究表明，藤梨根不同药物浓度 1 μg /ml、
10 μg /ml、100 μg /ml作用于 Eca-109 细胞 24 ﹑ 48 ﹑
72 h后，有明显的凋亡特征。MTT 法检测到藤梨根能
明显抑制 Eca-109 细胞的生长; 免疫组化 SP 法检测
Bax及 Bcl-2 蛋白的表达，与对照组比较用药组 Bax 蛋
白表达增强，Bcl-2 表达减弱;而同时伴有 Caspase-3 及
Caspase-9 蛋白表达明显增强。因此，我们推测诱导肿
瘤细胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一，它
可能通过线粒体通路发挥作用。而研究中我们也观察
到 Caspase-8 的轻度增强，这说明细胞凋亡并不完全是
个线性通路，或者藤梨根同时启动了几种途径诱导细
胞凋亡。
凋亡发生时 BH -3 only 亚族蛋白和 Bax 亚族蛋
白相互作用，促使 Bax 亚族蛋白寡聚化，并进入线粒
体，促使线粒体释放细胞色素 c 和 Smac / DIABLO，细
胞色素 c 释放出来后，和凋亡蛋白酶激活因子( apop-
totic protease activating factor，Apaf-1 ) 结合，使 Apaf-1
寡聚化，激活 procaspase-9、Caspase-9 激活下游的 pro-
caspase -3 及其它的 executioner Caspase，引起凋亡。而
死亡受体途径是通过激活 FADD ，由死亡效应域
( death effector domain ，DED) 与 procaspas 8 的前导区
的 DED 结合，激活 procaspase 8。随后 Caspase-8 又激
活下游的 procaspase3 及其他 Caspase 家族的 execu-
tioner Caspase，引起凋亡。
细胞凋亡中信号分子间相互影响，构成了细胞凋
亡的环形通路—死亡环［12］。在这个死亡环里，
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Caspase、Bcl-2 、细胞色素相互作用: 细胞色素能激活
procaspase ，而有活性的 Caspase 也能刺激线粒体释放
细胞色素 C。这样，上游分子和下游分子的凋亡信号
呈级联放大效应。而 Bcl-2 既能在细胞色素上游，也
能在其下游发挥作用。阻断这种环形放大的级联效
应，从而有效的抑制细胞凋亡。
本研究显示，藤梨根诱导 Eca-109 细胞凋亡中线
粒体介导的内部凋亡通路中的上游关键酶 Caspase-9
和下游的效应分子 Caspase-3 均被激活，而且 Caspase-
3 的激活伴随 Casapase-9 的活化，这不仅提供了藤梨
根诱导 Eca-109 细胞凋亡作用的基础资料，而且为食
管癌的防治提供了新的线索。
参考文献
［1］ Matich AJ，Young H，Allen JM，et al． Actinidia arguta: vola-
tile compounds in fruit and flowers〔J〕． Phytochemistry，
2003，63( 3) : 285．
［2］ Takano F，Tanaka T，Tsukamoto E，et al． Isolation of ( + ) -
catechin and ( -) -epicatechin from Actinidia arguta as bone
marrow cell proliferation promoting compounds〔J〕． Planta
Med，2003 ，69( 4) : 321．
［3］ Takano F，Tanaka T，Aoi J，et al． Protective effect of ( + ) -
catechin against 5-fluorouracil-induced myelosuppression in
mice〔J〕． Toxicology，2004 ，201( 1 ～ 3) : 133．
［4］ 国宏莉，姚俊霞，张 丽，等．藤梨根正丁醇提取物在人
食管癌细胞生长中的作用〔J〕． 中药材杂志，2008，31
( 7) : 1030．
［5］ Shankar E，Krishnamurthy S，Paranandi R，et al． PKCepsi-
lon induces Bcl-2 by activating CREB〔J〕． Int J Oncol，
2010 ，36( 4) : 883．
［6］ David-Pfeuty T，Legraverend M，Ludwig O，et al． Targeting
the cell cycle and the PI3K pathway: a possible universal
strategy to reactivate innate tumor suppressor programmes
in cancer cells〔J〕． Int J Oncol，2010，36( 4) : 873．
［7］ Danial NN． BCL-2 family proteins: critical checkpoints of
apoptotic cell death〔J〕． Clin Cancer Res，2007 13 ( 24 ) :
7254．
［8］ Danial NN，Korsmeyer SJ． Cell death: critical control points
〔J〕． Cell，2004 ，116( 2) : 205．
［9］ 沈 彤，叶良平，汪立杰，等．三氯乙烯诱导人表皮角质
形成细胞凋亡中依赖 Caspase-9 的 Caspase-3 激活〔J〕．
安徽医科大学学报，2009，44( 6) : 699．
［10］ Kim D，Kim SH，Park EJ，et al． Anti-allergic effects of PG-
102，a water-soluble extract prepared from Actinidia arguta，
in a murine ovalbumin-induced asthma model〔J〕． Clin Exp
Allergy，2009，39( 2) : 280．
［11］ Hewitt R，Forero A，Luncsford PJ，et al． Enhanced micronu-
cleus formation and modulation of BCL-2: BAX in MCF-7
cells after exposure to binary mixtures〔J〕． Environ Health
Perspect，2007，115( Suppl) : 1129．
［12］ Raj D，Brash D E，Gmssman D． Keratinocyte apoptosis in
epiderreal development and disease〔J〕． J Invest Dermatol，
2006，126( 2) : 243．
( 收稿日期 2010 － 12 － 07 修回日期 2011 － 02 － 20)
( 编辑:吴小红)
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